PROTEZIONE DEL GRUPPO -NH2

I peptidi sono generalmente sintetizzati dal residuo C-terminale verso

l’amminoacido N-terminale.

Il gruppo N- viene quindi protetto in maniera temporanea.

I due gruppi più utilizzati sono:

C

CH3

H3C

CH3

O C

O

Boc Fmoc

H2CO C

O

ESEMPIO DI 3 GRUPPI PROTETTIVI PER L’N CON STABILITA’ MODULATA NEI CONFRONTI DEGLI ACIDI

O C

O

NH

O C

O

NH

CH2

O C

O

NH

Z (HBr/AcOH)

Boc (TFA 30% in CH2Cl2)

Bpoc (TFA 0,5% in CH2Cl2)

O O Ot-But-Bu

O O

(t-Boc)2O

R NH2

R NH

O

O t-Bu CO2t-BuOH

Introduzione del gruppo Boc

Condizioni di reazione:

• (Boc)2O, NaOH, H2O, 25°C; resa 75-95%

• (Boc)2O, TEA,MeOH o DMF, 40-50°C; resa 87-

98%

• (Boc)2O, NaHCO3,MeOH, ultrasuoni; resa 84-

100%

Rimozione del gruppo Boc

Condizioni di reazione:

• TFA/CH2Cl2 al 30%, a

freddo• HCl 3M/AcOEt,

R NH

O

O CCH3

CH3CH3

HXR N

H

OH+ X

O CCH3

CH2CH3

R NH

OH

O +

RNH3+ X- + CO2

H2CCH3

CH3

+ HX

H

(TFA = acido trifluoroacetico CF3COOH)

Introduzione del gruppo Fmoc

Esistono vari metodi per l’introduzione di Fmoc

Fmoc-Cl

R NH2Na2CO3

H2C O C

O

NH RH2C O C

O

Cl

Condizioni di reazione:

• Fmoc-Cl, Na2CO3, diossano/H2O

una soluzione di Fmoc-Cl in diossano viene aggiunta lentamente a

0°C ad una soluzione di Na2CO3al 10% contenente l’amminoacido.

Si agita 1h a 0° e poi 5-18 h a T ambiente. Al termine della reazione

si versa in una miscela H2O-ghiaccio e si estrae con Et2O per

eliminare l’eccesso di Fmoc-Cl. La fase acquosa contenente l’amminoacido Fmoc sotto forma di sale sodico viene acidificata con HCl fino a pH 2 e l’amminoacido Fmoc precipita

Rimozione del gruppo Fmoc

H CH2

O

O

NH RN

H

-O

O

NH RN

H H

CH2

CH2 N

NH2 RCO2

Condizioni di reazione:

• piperidina, CH2Cl2 o DMF

• morfolina, CH2Cl2 o DMF

• cicloesilammina, CH2Cl2• ecc.ecc.

R C

O

OH R C

O

XR'NH2

R C

O

NHR' + HX

R C

O

N

X

H

R'

H

X = buon gruppo uscente, elettron-attrattore

Metodi di attivazione e accoppiamento

Metodo delle Anidridi miste

Z NH

R

O

OH

Alchile

O O

Cl

(Alchile)3NZ NH

R

O

O

Alchile O

O

(Alchile)3NH+ Cl-

R'NH2

Z NH

R

O

NH

+ CO2 + Alchile-OH

R'

+

NHR'

Alchile O

OReazione collaterale: formazione dell’uretanoPer minimizzare questa reazione si può utilizzare per la formazione dell’anidride mista isobutilclorocarbonato

Vantaggi-elevata velocità di reazione a basse temperature-facilità di esecuzione-elevata purezza dei prodotti-rese soddisfacenti-facile disponibilità dei reagenti

Svantaggi-elevata tendenza delle anidridi miaste a dare racemizzazione

Si utilizza con residui amminoacidici protetti in posizione Na con gruppi del tipo uretano (es. Boc), che sfavoriscono la racemizzazione

Altri tipi di attivazione del gruppo COOH terminale:

-esteri attivi: es. RCOOCH2CN

NO2O

O

R

-azidi: es. N3

O

R

Metodo via carbodiimmidi

R

NH

C N

N C N

O

O

R O

OH

O-acilisourea

R O

OHR O

OO

R

R'NH2

R O

NH

R'

peptide

R'NH2

NH

C N

O

N-aciliurea

OR

con peptidi COOH terminali

es. R = R2CONHCHR3-

NO

(Z)

R3

H O

R25(4H)ossazolone

anidridesimmetrica

DCC

Metodo via carbodiimmidi:DCC + HOBt

RNHBoc

NH

C N

N C N

O

OR

NHBoc

O

OH

O-acilisourea

HOBt

RNHBoc

O

O

NN

N

R'NH2

estere attivo

RNHBoc

O

NH

R'

peptide

Metodo via carbodiimmidi: DCC + DMAP

RNHBoc

R'NH2

COOEt

NH

C N

N C N

O

OR

NHBoc

O

OH

N

NH3C CH3

N

NH3C CH3

RNHBoc

NH

C N

O

O

N

NH3C CH3

OR

NHBoc

NH

C N

O

NH

C NH

O

R'NH

COOEt

O

R

NHBoc

N

NH3C CH3

O-acilisoureaDCC

DMAP

Sintesi del dipeptide Phe-Phe

(S) COOH

NHBocH

(S) COOEt

NH2H

DCC, DMAP

CH2Cl2

(S)

NHBoc

O

NH

(S)

COOEt

1) 1N NaOH, EtOH, t.a.2) TFA, CH2Cl2, 0°C

(S)

NH2

O

NH

(S)

COOH

(S) COOH

NH2H

L-FENILALANINA

(Boc)2ONaOH, H2O

(S) COO- Na+

NHBocH

H+

(S) COOH

NHBocH

C14H19NO4P.M.: 265,31

I giorno: protezione della fenilalanina con il Boc

0,8 g di fenilalanina vengono posti in un pallone da 100 ml. Si aggiungono 2 equivalenti di NaOH 1M e si pone in agitazione magnetica.

Si aggiungono lentamente 2 equivalenti di (Boc)2O (è un solido

con p.f. 22-24°C, va pesato velocemente in un piccolo becker e poi o lasciato liquefare e aggiunto con una pipetta pasteur, oppure aggiunto a piccole spatolate mentre è ancora solido). Al termine dell’aggiunta la reazione viene lasciata in agitazione a 25-30 °C per 2 ore e mezza. La soluzione viene trasferita nell’imbuto separatore ed estratta una volta con AcOEt per rimuovere il

(Boc)2O non reagito. Si acidifica quindi la fase acquosa con HCl

diluito e si estrae il prodotto con AcOEt. Si anidrifica su sodio solfato e si tira a secco nel pallone da 100 ml taratoCalcolare la resa

Determinare il valore di Rf del prodotto ottenuto

(S) COOEt

NH3+ ClH

NaHCO3 5% in acqua (S) COOEt

NH2H

C11H15NO2

P.M.: 193,24C11H16ClNO2

P.M.: 229,70

II giorno: liberazione della fenilalanina etilestere dal suo sale cloridrato

1,2 g di fenilalanina etilestere cloridrato vengono posti in una beuta e sciolti in acqua. Si basifica fino a pH 8 con una soluzione acquosa di NaHCO3 al 5%. La soluzione viene travasata in un imbuto separatore e l’ammina viene estratta con AcOEt. (controllo in TLC). La fase organica viene anidrificata su sodio solfato e tirata a secco al rotavapor in un pallone da 250 ml tarato e poi ulteriormente seccata con la pompa meccanica.Calcolare la resaDeterminare il valore di Rf del prodotto ottenuto

III giorno: formazione del legame peptidico

(S) COOH

NHBocH

(S) COOEt

NH2H

DCC, DMAP

CH2Cl2

(S)

NHBoc

O

NH

(S)

COOEt

I calcoli stechiometrici vanno fatti in base alla quantità di fenilalanina N-Boc ottenuta.Si lavora nel pallone da 100 ml che già contiene la fenilalanina N-Boc.Questa viene sciolta in circa 20 ml di diclorometano, si aggiunge 1 equivalente di fenilalanina etilestere e si mette in agitazione. Si aggiungono quindi 1 equivalente di DCC e 0,1 equivalenti di DMAP. Si lascia in agitazione fino a scomparsa dei prodotti di partenza (circa 2 ore). Si osserva la formazione di un precipitato bianco di dicicloesilurea. Terminata la reazione la dicicloesilurea viene eliminata per filtrazione (filtro a pieghe).

IV giorno

Purificare il prodotto su colonna dopo aver scelto l’eluente adattoCalcolare la resa della reazione dopo la purificazione,Determinare il valore di Rf del prodotto ottenuto.

La soluzione viene posta in un imbuto separatore e lavata 1 volta con HCl diluito, 1 volta con una soluzione al 5% di NaHCO3 e 1 volta con una soluzione satura di NaCl.Si anidrifica su sodio solfato e si tira a secco.Trovare un eluente idoneo alla purificazione su colonna e impaccare la colonna.

SINTESI PEPTIDICA IN FASE SOLIDA

•Tale strategia prevede l’ancoraggio dell’-amminoacido C-terminale ad una matrice polimerica mediante un legame estereo.

•Il primo -amminoacido N-protetto è fatto reagire sul polimero sotto forma di sale (es. sale di Cesio, sale di trietilammonio) in CH2Cl2/DMF, attraverso una reazione di sostituzione nucleofila.

•L’allungamento del peptide avviene dalla parte dell’N, in direzione C N con il metodo step by step

•Come protezione per l’azoto di utilizza Z, che viene rimosso con HBr/AcOH, oppure BOC, che viene rimosso con TFA.

Resina di polistirene (copolimero di stirene contenente l’1% di divinilbenzene ne come agente reticolante), funzionalizzata mediante clorometilazione

•La rimozione del gruppo N-protettore deve avvenire senza dare reazioni indesiderate con il legame amminoacido-resina né con i gruppi protettori delle funzionalità presenti sulle catene laterali.

•Dopo aver rimosso il gruppo protettore della funzione amminica, l’amminoacido successivo è addizionato mediante una reazione di coupling

•Nel metodo di Merrifield la condensazione viene eseguita con DCC/HOBt.

•Il ciclo deprotezione/accoppiamento si ripete fino a completare la sintesi del peptide

I continui trattamenti acidi, richiesti per rimuovere ad ogni stadio il gruppo protettore sull’ammina, determinano una parziale idrolisi del legame benzilestereo tra il peptide e la resina (quindi diminuzione della resa e formazione di prodotti secondari indesiderati.

Al fine di migliorare la selettività di rimozione è stato introdotto un gruppo nitro sull’anello aromatico (gruppo p-nitro-benzilestere + resistente all‘ambiente acido). Problema: per la rimozione finale del peptide dalla resina è necessario utilizzare NaOH.

Un ulteriore miglioramento è stato ottenuto utilizzando il gruppo protettore Boc al posto del gruppo Z (benzilossicarbonile). In questo caso la nitrazione dell’anello è superflua visto che il Boc viene rimosso in condizioni più blande (TFA al 25% in CH2Cl2). Il grippo amminico, dopo trattamento con TFA, è trasformato in base libera utilizzando TEA.Terminata la sintesi del peptide, questo viene staccato dalla resina con HF.Contemporaneamente vengono anche rimossi i gruppi protettivi acido-labili presenti sulle catene laterali

Vantaggi rispetto al coupling in soluzione:

-si evitano i processi di purificazione (si effettua una semplice filtrazione)-si riducono enormemente i tempi di produzione del peptide-si evitano i problemi relativi alla solubilità dei peptidi

Una volta completata la sintesi del peptide, questo viene allontanato dalla resina utilizzando HF (poco maneggevole, necessità di lavorare con contenitori in teflon)

Per ovviare a questo problema sono state messe a punto nuove resine più sensibili agli acidi dalle quali poter staccare il peptide in condizioni più blande, es. la resina di Wang (che presenta la funzione p-alcossibenzilalcolica) dalla quale il peptide è rimosso con TFA. In questo caso le protezioni transienti vengono effettuate con Fmoc.

OCH2H2C PHO

RESI NA DI WANG

La presenza del sostituente p-alcossi sul gruppo benzilalcolico aumenta la sensibilità del legame estereo all’ambiente acido.La rimozione del peptide dalla resina può essere effettuata semplicemente con TFA.In questo caso i gruppi protettori della funzione -amminica devono essere - o rimossi in ambiente acido più blando (es. gruppo Bpoc: bifenilisopropilossi-carbonile) (STABILITA’ MODULATA)

- o rimossi in ambiente basico (es. gruppo Fmoc) (STABILITA’ ORTOGONALE)

Altre condizioni di rimozione del peptide dalla resina:

NH3/MeOH peptide carbossammide

NaOH/MeOH peptide COO-

NH2NH2 peptide idrazide

MeOH/TEA peptide metilestere

In questi casi i gruppi protettori delle catene laterali vanno sbloccati dopo rimozione del peptide dalla resina.

La sintesi in fase solida può essere effettuata

A) con la tecnica “batch”: la resina è inserita in un reattore di vetro munito di un setto poroso e i reagenti sono aggiunti e rimossi in maniera manuale o automatizzata.

B) con la tecnica “ a flusso continuo”: la resina è contenuta in una colonna attraverso la quale i reagenti e i solventi sono riciclati e monitorati in continuo mediante sistemi automatizzati.

I supporti polimerici utilizzati sono dei gel piuttosto che dei solidi veri e propri. Ciò richiede il preventivo rigonfiamento del polimero nei solventi utilizzati per la sintesi in modo da facilitare l’entrata e l’uscita dei reagenti nelle particelle, per diffusione.

SCELTA DELLA RESINA

• deve contenere i siti reattivi sui quali accrescere la catena peptidica

•deve essere stabile nelle condizioni chimiche e fisiche della sintesi

•deve permettere un rapido e libero contatto tra i reagenti e la crescente catena peptidica

•deve essere facilmente separabile dalla fase liquida in ogni fase della sintesi

•deve essere altamente funzionalizzata al fine di ottenere rese alte di peptidi, minimizzando le interazioni tra le catene peptidiche

RIMOZIONE DEL PEPTIDE DALLA RESINA

• RIMOZIONE STANDARD CON HF (per la strategia Boc)è la procedura più versatile e meno dannosa per la maggior parte dei peptidi.Il principale svantaggio è legato all’alta tossicità e alla reattività di HF, tanto da richiedere l’utilizzo di un’apparecchiatura ad hoc (in teflon).

La rimozione viene condotta a 0-5°c in 30-60 minuti in un contenitore chiuso munito di agitazione.

L’impiego di ‘scavengers’ riduce la possibilità di reazioni collaterali(es. anisolo previene l’alchilazione del Trp ad opera carbocationi t-butilici)

Alla fine della reazione si evapora HF in corrente di N2. Si estrae la resina con TFA e si rimuove il peptide dalla resina mediante filtrazione a pressione ridotta. Si lava la resina per 2 volte con TFA, si combinano i filtrati e si precipita il peptide con etere etilico freddo. In alcuni casi è necessario evaporare il TFA prima di aggiungere etere etilico.

Il precipitato viene filtrato sotto vuoto, lavato con etere etilico freddo, sciolto in un’adatta soluzione tampone e liofilizzato.

ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DEI PEPTIDI DOPO RIMOZIONE DALA RESINA

In alternativa il residuo solido viene triturato in presenza di t-butilmetiletere fino ad ottenere una sospensione, che viene centrifugata. Si decanta il surnatante e si ripetono le operazioni. Il residuo ottenuto viene sciolto in un’adatta soluzione tampone e liofilizzato.

Per peptidi solubili in acqua dopo la precipitazione si aggiunge al residuo acqua, si trasferisce la miscela in imbuto separatore, si separa la fase acquosa dall’etere. La fase acquosa viene di nuovo estratta per due volte con etere etilico fresco e poi liofilizzata.