Principi e basi della Principi e basi della diagnostica virologicadiagnostica virologica

A.Azzi, Firenze 19.11.2004

L’importanza della diagnosiL’importanza della diagnosi

Esclusione di altre causeImpiego di terapie antiviraliNella prevenzione

Diagnosi precoce Diagnosi rapida

Approcci diagnosticiApprocci diagnostici

Diagnosi indiretta (sierologica)– Sieroconversione– Aumento del titolo– Presenza di IgM

specifiche– Avidità delle IgG

Diagnosi diretta

Ricerca del virus (o di sue componenti)

Manifestazioni cliniche

Il rischio infettivo in ambito trasfusionale

Diagnosi sierologicaDiagnosi sierologica

Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (03/03/03) del Sig ZZ: positivo

Il sig ZZ ha una infezione da HIV

Diagnosi sierologicaDiagnosi sierologica

Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo

Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo

Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos

Il sig XY gode di ottima salute !!!

Diagnosi indiretta: limitiDiagnosi indiretta: limiti

Malattie causate da: – riattivazione di virus latenti o infezioni

persistenti

In:– pazienti immunodepressi

Disponibilità dei campioni

La ricerca del virusLa ricerca del virusIl microscopio elettronico

La ricerca del virusLa ricerca del virus

L’isolamento– Nell’aminale– Nelle uova embrionate

– Nelle colture cellulari

Isolamento nelle colture cellulariIsolamento nelle colture cellulari

Effetti dello sviluppo del virus– ECP (+/- specifico)– Emoadsorbimento – …………………

Necessità di test identificazione del virus: neutralizzazione, IEA, IF …………..

Effetti citopatici da virusEffetti citopatici da virus

Morte cellulare– Arrotondamento– Degenerazione– Aggregazione– Perdita di adesione al substrato

Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o citoplasmatiche

Formazione di sinciziCambiamenti della superficie cellulare:

espressione di antigeni viraliemoadsorbimento

C y t o p a t h i c E ff e c t ( 2 )

S y n c y t i u m f o r m a t i o n i n c e l l c u l t u r e c a u s e d b y R S V ( t o p ) , a n d m e a s l e s v i r u s ( b o t t o m ) . ( c o u r t e s y o f L i n d a S t a n n a r d , U n i v e r s i t y o f C a p e T o w n , S . A . )

Problemi nell’impiego delle Problemi nell’impiego delle colture cellularicolture cellulari

Tempi lunghi per comparsa ECP Determinanti le condizioni di conservazione del

campione. Possibii contaminazioni batteriche e fungine. Sostanza tossiche presenti nel campione. Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g.

Hepatitis B, Diarrhoeal viruses, parvovirus, papillomavirus.

Rapid Culture Techniques

Posibilità di individuare antigeni virali nelle colturedopo 24- 48 ore. Es CMV

Nuovi sviluppi

Rapid Diagnosis Based on the Detection of Viral Antigens

Nasopharyngeal Aspirate RSVInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus

Faeces RotavirusesAdenovirusesAstrovirus

Skin HSVVZV

Blood CMV (pp65 antigenaemia test)

Test rapidiTest rapidi

Ricerca di Ag dei virus influenzali A e BTest immunoenzimatico (ELISA)Supporto: membrana di nitrocellulosaAb monoclonali specifici per la NP viraleCampioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF

Tempo: 15 minutiDistinzione dei tipi (A-B)

Immunofluorescense

Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

CMV pp65 antigenaemia test

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

La ricerca di componenti del virus nel La ricerca di componenti del virus nel campione clinicocampione clinico

Antigeni virali– Nel siero: antigeni

solubili

– Nelle cellule : antigeni di superficie o intracellulari

Acido nucleico virale– Tecniche di

amplificazione– …. ma non solo

HBsAg, HBeAgp24Tecniche

di immunoprecipitazioneimmunoenzimatiche

Immunofluorescenzaimmunoistochimica

• Tecniche quantitativenel monitoraggio dell’infezionee della terapia • Analisi delle sequenze per la determinazione delle resistenze, per la genotipizzazione, per l’epidemiologia

Limiti tecniche “tradizionali”Limiti tecniche “tradizionali”

EM/IEM

Isolamento

Ricerca antigeni

Virus non coltivabili Scarsamente visualizzabili Agentisconosciuti

Costi Manualità Tempi Manualità Sensibilità

Difficoltà di individuare antigeni (HCV,TTV…)

Tecniche di ibridazioneTecniche di ibridazione

Impiego prevalente per rivelazione e conferma specifictà prodotti di amplificazione

Ibridazione in situ

Nuove versioni

Quali tecniche di Quali tecniche di amplificazioneamplificazione

Amplificazione della sequenza bersaglioAmplificazione del segnaleAmplificazione della sonda

Applicazioni qualitative e quantitativeNon solo PCR

Per quali esigenze:Per quali esigenze:

•per virus non coltivabili o •coltivabili con difficoltà•a lento sviluppo - effetto•per virus “ad alto rischio”•per la ricerca di virus nel liquoro comunque •in campioni in cui la carica virale sia bassa

Virus epatite B e CPapillomavirus Parvovirus B19, TTV

Impiego delle tecniche di biologia Impiego delle tecniche di biologia molecolare nella diagnostica virologicamolecolare nella diagnostica virologica

Applicazioni quantitative per

distinzione tra infezione latente e infezione attiva (riattivazione)

monitoraggio infezione (prognosi)

monitoraggio terapia

valutazione del rischio di trasmissione

La ricerca di componenti del virus nel La ricerca di componenti del virus nel campione clinicocampione clinico

Antigeni virali Acido nucleico virale

Sensibilità +++Specificità +++Rapidità ++

Sensibilità +Specificità +++Rapidità ++++

L’interpretazioneL’interpretazione

L’immunodepressione

Infezioni virali latenti e infezioni virali persistenti

Infezioni subcliniche

Può rendere poco attendibili i risultati della sierologia

L’uso di tecniche molto sensibili rende Necessario riconsiderare il valore diagnostico di un risultato positivo

I marcatori sierologici dell’HCV nel periodo seguente all’infezione

InfectionInfezione

HCV RNA HCV RNA1 2 EIA 3.0EIA 3.0

EIA 2.0EIA 2.03

EIA 1.0EIA 1.04

00 13 13 70 8070 80 150 (giorni)150

Ortho-Clinical Diagnostics

Nuovi sviluppiNuovi sviluppi

L’analisi delle sequenze nella diagnostica virologica– Genotipizzazione

Nuove tecnologie– Amplificazione real time– Microarray– Pyrosequencing