MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTIGENICA NEI PROCARIOTI

- ESPRESSIONE GENICA IN ESPRESSIONE GENICA IN E. coliE. coli

UN GENE PER ESSERE ESPRESSO UN GENE PER ESSERE ESPRESSO DEVE ESSERE “CIRCONDATO” DA DEVE ESSERE “CIRCONDATO” DA

UNA SERIE DI SEGNALI CHE DEVONO UNA SERIE DI SEGNALI CHE DEVONO ESSERE RICONOSCIUTI DAL ESSERE RICONOSCIUTI DAL

BATTERIO.BATTERIO.

- 3 PRINCIPALI SEGNALI:3 PRINCIPALI SEGNALI:

1.1. PROMOTORE:PROMOTORE: SEGNALA IL PUNTO DI INIZIO DELLA SEGNALA IL PUNTO DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE DEL GENETRASCRIZIONE DEL GENE

2.2. TERMINATORE:TERMINATORE: SEGNALA LA FINE DELLA TRASCRIZIONE SEGNALA LA FINE DELLA TRASCRIZIONE DEDL GENEDEDL GENE

3.3. SITO DI LEGAME AL RIBOSOMA:SITO DI LEGAME AL RIBOSOMA: BREVE SEQUENZA DI BREVE SEQUENZA DI NUCLEOTIDI RICONOSCIUTA DAL RIBOSOMA; IL CODONE NUCLEOTIDI RICONOSCIUTA DAL RIBOSOMA; IL CODONE DI INIZIO TRADUZIONE E’ SITUATO A POCHI NUCLEOTIDI A DI INIZIO TRADUZIONE E’ SITUATO A POCHI NUCLEOTIDI A VALLE DI QUESTO SEGNALEVALLE DI QUESTO SEGNALE

IL PROMOTORE DEVE ESSERE SCELTO IL PROMOTORE DEVE ESSERE SCELTO CON CURA!!CON CURA!!

PICCOLE VARIAZIONI NELLE SEQUENZE CONSENSUS PICCOLE VARIAZIONI NELLE SEQUENZE CONSENSUS DEI PROMOTORI PROCARIOTICI POSSONO ALTERARE DEI PROMOTORI PROCARIOTICI POSSONO ALTERARE L’EFFICIENZA CON CUI UN GENE VIENE TRASCRITTO.L’EFFICIENZA CON CUI UN GENE VIENE TRASCRITTO.

• PROMOTORI FORTIPROMOTORI FORTI:: CONTROLLANO L’ESPRESSIONE CONTROLLANO L’ESPRESSIONE DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’ RICHIESTO IN DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’ RICHIESTO IN

GROSSE QUANTITA’ DALLA CELLULAGROSSE QUANTITA’ DALLA CELLULA

• PROMOTORI DEBOLI:PROMOTORI DEBOLI: CONTROLLANO CONTROLLANO L’ESPRESSIONE DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’ L’ESPRESSIONE DI QUEI GENI IL CUI PRODOTTO E’

RICHIESTO IN PICCOLE QUANTITA’ DALLA CELLULARICHIESTO IN PICCOLE QUANTITA’ DALLA CELLULA

PROMOTORI INDUCIBILI

lac PROMOTER lac ZIPTG

TRANSCIPTION

trp PROMOTER trpA

BETA-INDOLYACETIACID

TRANSCIPTION

tac PROMOTER

IPTG

TRANSCIPTION

-35 -10

-35 -10(trp) (lac)

-35 -10

TRIPTOFANO

NOTRANSCRIPTION

PROMOTORI INDUCIBILIPROMOTORI INDUCIBILI

• pL: promotore di sinistra del batteriofago lambdapL: promotore di sinistra del batteriofago lambdaControllato dal dal repressore Controllato dal dal repressore ccI del batteriofago lambda.I del batteriofago lambda.Mutante termosensibile del repressore Mutante termosensibile del repressore ccI, I, ccI 857.I 857.Crescita a 28-30 °C = Crescita a 28-30 °C = ccI impedisce la trascrizione diretta da I impedisce la trascrizione diretta da ppL.L.Crescita a 42 °C = inattivazione di Crescita a 42 °C = inattivazione di ccII

• Promotore del gene 10 del batteriofago T7Promotore del gene 10 del batteriofago T7Si inserisce il gene della RNA-polimerasi T7 nel cromosoma di Si inserisce il gene della RNA-polimerasi T7 nel cromosoma di

E. coli E. coli su di un batteriofago lambda lisogeno sotto il controllo su di un batteriofago lambda lisogeno sotto il controllo del promotore lac di del promotore lac di E. coliE. coli..

Induzione con IPTG.Induzione con IPTG.

PROMOTORE IDEALEPROMOTORE IDEALE

PROMOTORE FORTE INDUCIBILE

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE IL GENE CLONATO SI ESPRIME SOLAMENTE: • IN UNA FASE SPECIFICA DEL CICLO CELLULARE• PER UN TEMPO SPECIFICATO

COSTRUZIONE DI PLASMIDI(VETTORI DI ESPRESSIONE)

P

R

T

E. coli EXPRESSION SIGNALS:P= PROMOTERR= RBS

VETTORI DI ESPRESSIONE

P

R

T

INSERT A FOREIGN GENE INTO INSERT A FOREIGN GENE INTO THE UNIQUE RESTRICTION SITETHE UNIQUE RESTRICTION SITE

TRANSORMTRANSORME. coliE. coli R

T

mRNA

PROTEIN

STARTEGIA GENERALIZZATA PER ISOLARE STARTEGIA GENERALIZZATA PER ISOLARE PRESUNTE SEQUENZE PROMOTRICI PRESUNTE SEQUENZE PROMOTRICI

IN VARI ORGANISMIIN VARI ORGANISMI

Selezione per Selezione per resistenzaresistenzaad un antibiotico oad un antibiotico o per saggio per saggio colorimetricocolorimetrico

METODI PER AUMENTARE LA PRODUZIONE DELLE METODI PER AUMENTARE LA PRODUZIONE DELLE PROTEINE: COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pCP3PROTEINE: COSTRUZIONE DEL PLASMIDE pCP3

CRESCITA DELLE CELLULE CRESCITA DELLE CELLULE ((E. coliE. coli) RECANTI IL PLASMIDE pCP3) RECANTI IL PLASMIDE pCP3

• 28°C28°C: il repressore : il repressore ccI, integrato nel dNA I, integrato nel dNA cromosomiale di cromosomiale di E. coliE. coli, è funzionante, pL è , è funzionante, pL è spento> N. di copie normali del palsmidespento> N. di copie normali del palsmide

• 42°C:42°C: il repressore il repressore ccI si inattiva, I si inattiva, ppL è L è attivo> N. di copie del plasmide aumentaattivo> N. di copie del plasmide aumenta

EFFETTI DELLA TEMPERATURA SUL NUMEROEFFETTI DELLA TEMPERATURA SUL NUMERO DI COPIE DI TRE VETTORI PLASMIDICIDI COPIE DI TRE VETTORI PLASMIDICI

Il numero di copie del plasmide pCP3 aumenta di 5-10 Il numero di copie del plasmide pCP3 aumenta di 5-10 volte quando si innalza la temperatura volte quando si innalza la temperatura

del mezzo di crescita a 42 °Cdel mezzo di crescita a 42 °C

SISTEMI SU LARGA SCALASISTEMI SU LARGA SCALA

• Piccole colture (1-5 L): induzione facilmente realizzabile o variando la temperatura o aggiungendo un induttore chimico

• Bioreattori (>200 L): variazione di temperatura (30-60 min.) e aggiunta di induttore----COSTO ELEVATO

SISTEMA A DUE PLASMIDI

DOPPIO SISTEMA PLASMIDICO PER CONTROLLARE IL PROMOTOREDOPPIO SISTEMA PLASMIDICO PER CONTROLLARE IL PROMOTORE ppL DI LAMBA REGOLANDO IL REPRESSORE L DI LAMBA REGOLANDO IL REPRESSORE ccI CON IL TRIPTOFANOI CON IL TRIPTOFANO

CRESCITA DELLE CELLULE• Mezzo non costoso: melassa e idrossilato

di caseina contenente piccole quantità di triptofano libero.

• Induzione: aggiunta di triptone contenente abbastanza triptofano libero da indurre efficientemente la trascrizione

Sistema potenzialmente economico per produrre su larga Sistema potenzialmente economico per produrre su larga scala proteina da microrganismi ricombinantiscala proteina da microrganismi ricombinanti

ESPRESSIONE IN ALTRI MICRORGANISMIESPRESSIONE IN ALTRI MICRORGANISMI

• E. coliE. coli: microrganismo non di elezione : microrganismo non di elezione per tutte le proteineper tutte le proteine

• Non esiste un unico vettore che Non esiste un unico vettore che assicuri livelli ottimali di espressione assicuri livelli ottimali di espressione genica in tutti i batteri o, perlomeno, in genica in tutti i batteri o, perlomeno, in tutti quelli gram-negativitutti quelli gram-negativi

• Molte strategie elaborate per Molte strategie elaborate per E. coliE. coli riescono utili anche per vari altri riescono utili anche per vari altri microganismimicroganismi

STRATEGIASTRATEGIA

• Costruzione di una serie di vettori Costruzione di una serie di vettori plasmidici contenenti lac, tac, Nm (R plasmidici contenenti lac, tac, Nm (R per neomicina) o S1 promoter (dal gene per neomicina) o S1 promoter (dal gene S1 della proteina ribosomiale di S1 della proteina ribosomiale di Rhizobium melilotiRhizobium meliloti))

• Esaminata l’espressione della beta-Esaminata l’espressione della beta-galattosidasi sotto il controllo di galattosidasi sotto il controllo di ognuno di questi promotoriognuno di questi promotori

ATTIVITA’ ATTIVITA’ -GALATTOSIDASICA ESPRESSA DA -GALATTOSIDASICA ESPRESSA DA BATTERI GRAM-NEGATIVI PORTATORI DI UN BATTERI GRAM-NEGATIVI PORTATORI DI UN

VETTORE PLASMIDICO CON IL GENE VETTORE PLASMIDICO CON IL GENE laclacZ DI Z DI E. coliE. coli E E UN PROMOTORE ETEROLOGOUN PROMOTORE ETEROLOGO

PROTEINE DI FUSIONE

LE PROTEINE ESTRANEE, NELLE CELLULE OSPITI, VENGONO SPESSO PRODOTTE IN BASSE QUANTITA’ DEGRADAZIONE

PROTEINE DI FUSIONE

COMBINAZIONE DEL PRODOTTO DEL GENE CLONATO CON UNA PROTEINA STABILE

DELL’OSPITE

VETTORI CASSETTA PER LA SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE

START OF AN E.coli GENE UNIQUE RESTRICTION SITE

P RT

FOREIGN GENEP R

T

HYBRID GENE HYBRID PROTEIN

VETTORI CASSETTA PER LA SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE

• VANTAGGI:

1. LA PRESENZA DEL PEPTIDE DI ORIGINE BATTERICA NELLA PROTEINA DI FUSIONE PUO’ STABILIZZARE LA MOLECOLA E IMPEDIRE LA DEGRADAZIONE DA PARTE DELL’OSPITE.

2. IL SEGMENTO DI ORIGINE BATTERICA PUO’ RAPPRESENTARE UN PEPTIDE SEGNALE CHE DIRIGE LA PROTEINA NELLA GIUSTA LOCALIZZAZIONE CELLULARE.

(ES. -LATTAMASI SECREZIONE

VETTORI CASSETTA PER LA SINTESI DI PROTEINE DI FUSIONE

• SVANTAGGI:

LA PRESENZA DEL PEPTIDE DI ORIGINE BATTERICA PUO’ ALTERARE IL

FUNZIONAMENTO DELLA PROTEINA

IL TAGLIO DELLE PROTEINE DI FUSIONE

TAGLIO PROTEOLITICO DI UNA PROTEINA DI FUSIONE AD OPERA DEL FATTORE DI COAGULAZIONE

DEL SANGUE Xa

VETTORE DI CLONAZIONE DI FUSIONEVETTORE DI CLONAZIONE DI FUSIONE

PROTEINA PROTEINA ““TRIIBRIDA”TRIIBRIDA”

ompF:ompF: SEGNALI DI TRASCRIZIONE,TRADUZIONE E SECREZIONE SEGNALI DI TRASCRIZIONE,TRADUZIONE E SECREZIONE

lacZ DI E. colilacZ DI E. coli:: -GALATTOSIDASI-GALATTOSIDASI

ALCUNI SISTEMI DI FUSIONE UTILIZZATI PER ALCUNI SISTEMI DI FUSIONE UTILIZZATI PER FACILITARE LA PURIFICAZIONE DELLE FACILITARE LA PURIFICAZIONE DELLE

PROTEINE ESTRANEE PRODOTTE IN PROTEINE ESTRANEE PRODOTTE IN E. coliE. coli

PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA PER PURIFICAZIONE CROMATOGRAFICA PER IMMUNOAFFINITA’ DI UNA PROTEINA DI FUSIONEIMMUNOAFFINITA’ DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

STRATEGIE PER EVITARE L’INSOLUBILITA’ DELLE PROTEINE. ES. SINTESI DELLA PROTEINA DI FUSIONE TIOREDOXINA-PROTEINA TARGET

A) ASSENZA DI A) ASSENZA DI TRIPTOFANOTRIPTOFANO

B) PRESENZA DI B) PRESENZA DI TRIPTOFANOTRIPTOFANO

ESPOSIZIONE DI PROTEINE ALLA SUPERFICIE:Sistemi specializzati di proteine di fusione

1. FACILITARE LO SCREENING DI GRANDI GENOTECHE DI cDNA

2. SOVRAESPRIMERE ALCUNI PEPTIDI O PROTEINE

M13 Surface Displays

• Useful for library screening

FUSIONI TRA I GENI PER LA PROTEINA BERSAGLIO E QUELLI PER UNA PROTEINA DELLA SUPERFICIE BATTERICA ESTERNA

PARTNER DI FUSIONE BATTERICA UTILIZZATI

• PROTEINA A DELLA MEMBRANA ESTERNA DI E. coli (OmpA)

• LIPOPROTEINA ASSOCIATA AL PEPTIDOGLICANO (PAL)

• PROTEINA F DELLA MEMBRANA ESTERNA DI Pseudomonas aeruginosa (OprF)

SOVRAESPRESSIONE DI PEPTIDI O PROTEINE

INSERIMENTO DELL’EPITOPO INSERIMENTO DELL’EPITOPO Asn-Ala-Asn-Asn-Ala-Asn-Pro Pro DI UNA PROTEINA DI DI UNA PROTEINA DI P. falciparumP. falciparum IN IN REGIONI CODIFICANTI DI OrpF DI REGIONI CODIFICANTI DI OrpF DI P. P. aeruginosaaeruginosa

REAZIONE POSITIVA NELL’ESPOSIZIONE REAZIONE POSITIVA NELL’ESPOSIZIONE AGLI ANTICORPI MONOCLONALI CONTRO AGLI ANTICORPI MONOCLONALI CONTRO P. falciparumP. falciparum

POTENZIALI VACCINIPOTENZIALI VACCINI

ESEMPIO DI VETTORE CON SEGNALI TRASCRIZIONALI E TRADUZIONALI

Codon Usage Problems

• tRNAs corresponding to cloned gene codons rare in bacteria used to express gene

OTTIMIZZAZIONE DEI CODONI DEL GENE CLONATOOTTIMIZZAZIONE DEI CODONI DEL GENE CLONATO

Correcting Codon Usage Issues

• Over express tRNA genes corresponding to the required codons

• Amino acid production and/or charging enzymes may also need to be modified in some cases

MIGLIORAMENTO DELLA MIGLIORAMENTO DELLA STABILITA’ DELLE PROTEINESTABILITA’ DELLE PROTEINE

• TEMPO DI DIMEZZAMENTOTEMPO DI DIMEZZAMENTO1.1. LEGAMI DI SOLFUROLEGAMI DI SOLFURO2.2. Aa N-TERMINALI*Aa N-TERMINALI*ES. ES. -GALATTOSIDASI-GALATTOSIDASI

SEQUENZE PEST

SEQUENZE INTERMEDIE RICCHE DI• PROLINA- AC. GLUTAMMICO- SERINA- TREONINA

DEGRADAZIONE PROTEOLITICA

SE FIANCHEGGIATE DA AA A CARICA POSITIVA

SEGNALE DI DEGRADAZIONE

MANIPOLAZIONEGENETICA

STABILITA’PROTEICA

OVERCOMING OXYGEN LIMITATION

• MODIFICATION OF FERMENTATION

(AGITATION, AREATION)

• USE OF PROTEASE-DEFICIENT HOST STRAIN

• BACTERIAL HEMOGLOBIN

- USE OF VITREOSCILLAVITREOSCILLA HEMOGLOBIN-LIKE MOLECULE IN E. coli

Secrezione di proteine con attività Secrezione di proteine con attività specifica maggiorespecifica maggiore

INTEGRAZIONE DEL DNA NEL CROMOSOMA DELL’OSPITE

• PLASMIDE-------SOVRACCARICO METABOLICO

• PERDITA PLASMIDE• RIDOTTA PRODUZIONE PROTEICA

2 POSSIBILI RIMEDI:- AGGIUNTA DI ANTIBIOTICI O DI METABOLITI

ESSENZIALI (SU SCALA DI LABORATORIO)- INTRODUZIONE DIRETTA DEL DNA

CLONATO NEL DNA CROMOSOMIALE DELLA CELLULA OSPITE

INTEGRAZIONE DEL DNA NEL CROMOSOMA DELL’OSPITE

• RISOLUZIONE PERDITA PLASMIDERISOLUZIONE PERDITA PLASMIDE• DNA STABILEDNA STABILE• ASSENZA DI AGENTI SELETTIVIASSENZA DI AGENTI SELETTIVI

ESSENZIALE:ESSENZIALE:- IL SITO DI INTEGRAZIONE DELL’OSPITE NON DEVE IL SITO DI INTEGRAZIONE DELL’OSPITE NON DEVE

APPARTENERE A UN GENE CODIFICANTE APPARTENERE A UN GENE CODIFICANTE ESSENZIALEESSENZIALE

- PROMOTORE REGOLABILE DEL GENE ENTRANTEPROMOTORE REGOLABILE DEL GENE ENTRANTE- OMOLOGIA DI SEQUENZA (ALMENO 50 NT) TRA OMOLOGIA DI SEQUENZA (ALMENO 50 NT) TRA

DNA ENTRANTE E DNA CROMOSOMIALE.DNA ENTRANTE E DNA CROMOSOMIALE.

DUE MODI DI INTEGRARE IL GENE NEL SITO CROMOSOMICO

IL GENE CLONATO E’ INSERITO NEL MEZZO DI UN SEGMENTO CLONATO DI DNA PROVENIENTE DAL CROMOSOMA OSPITE

IL GENE CLONATO E’ INSERITO IN POSIZIONE ADIACENTE AL DNA CLONATO PROVENIENTE DAL CROMOSOMA OSPITE

Selectable Integration Systems

• Integrate selectable marker into target site

• Integration of cloned gene into target site by double recombination eliminates marker gene

• Choose marker gene carefully….

Engineering For Secretion

• Maltose Binding Protein secretion signal insufficient so entire gene used as fusion component

• Xa cleavage site added

• Cloned Gene (IL-2) released by cleavage

IL CARICO METABOLICO

VARIE CAUSE:

• AUMENTO DEL N. DI COPIE DEL PLASMIDE

• LIMITAZIONE OSSIGENO

• SOVRAPPRODUZIONE DI PROTEINE ESTRANEE…………

Metabolic Load

• Replication of high copy plasmids

• Oxygen consumption

• Charged tRNAs• Export apparatus• Product interference

with endogenous processes

CONSEGUENZE:• RIDUZIONE DEL TASSO DI CRESCITA

CELLULARE

EFFETTI DEL N. DI COPIE DEL PLASMIDE

CONSEGUENZE:

• ALTERAZIONI POLISACCARIDI EXTRACELLULARI

• ESAURIMENTO DI AA SCORTA E LIMITAZIONE DI CERTI AMINOACIL-tRNA

RIMEDI

• UTILIZZO DI VETTORI PLASMIDICI A BASSO N. DI COPIE

• IMPIEGO DI PROMOTORI FORTI MA REGOLABILI

• ACCETTARE UN LIVELLO MODESTO DI ESPRESSIONE DEL GENE ESTRANEO

STRATEGIA PER RIDURRE LA PRODUZIONE DI ACETATI NELLE

CELLULE OSPITI

INTRODUZIONE NELLE CELLULE OSPITI DI E. coli DI UN PLASMIDE RECANTE I GENI PER LA SINTESI DELL’ACETOLAT-TATO SINTASI (ALS)

Inibisce la crescita cellulare Inibisce la crescita cellulare e la produzione di proteinee la produzione di proteine

Acetolattato sintasi