Università degli Studi di Firenze Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali

Corso di Laurea in Biotecnologie

Dott. Ferri Lorenzo Dott. Sparvoli Valentina

Single Nucleotide Primer Extension

Permette di rilevare polimorfismi puntiformi (SNPs) in qualsiasi punto di una regione del

DNA amplificabile via PCR.

Attraverso l’estensione di uno o più primerdi un solo nucleotide complementare alla base polimorfica che si vuole studiare.

T5’ 3’

A 5’3’T

Single Nucleotide Primer Extension

O BASE

H

H

H

H HH

CH2

O-PO

OPO

OO-

PO

OO-

O-

I

lunghezza

ELETTROFORESI

CAPILLARE

ANALISI SNuPE

DETERMINAZIONE GENOTIPI

Single Nucleotide Primer Extension

INDIVIDUAZIONE MUTAZIONI

IDENTIFICAZIONE di SPECIE

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

1. ANALISI BIONFORMATICARicerca e recupero, per ogni specie, delle sequenze nucleotidiche del MARCATORE MOLECOLARE (es.

un gene) scelto come bersaglio dell’analisi, disponibili in banca dati

SPECIE ASPECIE B

SPECIE CAF108056 AF108057 AF269041 AY074260 AY460027 ........

AY473021 AF057108 AY604126 AY067403 AF269017 ........

AF247043 AF604821 AY600626 AY744103 AY690319 ........

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

1. ANALISI BIONFORMATICAAllineamento delle sequenze recuperate per ogni specie

AF108056 Specie A AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG

AF108057 Specie A AGTCAACCGACCGTTCCGACCGGTGACTATTCGACG

AF269041 Specie A AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG

AY074260 Specie A AGTCAATCGGCCGTTCGGACCGCTGACTATACGACG

AY460027 Specie A AGTCAATCGGCCGTTCGGCCCGCTGACTATACGACG

Creazione di SEQUENZE CONSENSO

Consensus sequence AGTCAAYCGRCCGTTCGGCCCGSTGACTATWCGACG

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

1. ANALISI BIONFORMATICAAllineamento delle sequenze

consenso delle specie considerate

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

Individuazione SNPs SPECIE SPECIFICI

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

2. DISEGNO PRIMER

CRITERI

Devono ricadere all’interno di una regione amplificabile via PCR

Scelta SNPs utili per l’analisi SNuPE

Devono presentare regioni conservate a monte o a valle

Singolarmente o combinati insieme devono consentire di discriminare le specie

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

2. DISEGNO PRIMER

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

2. DISEGNO PRIMERCARATTERISTICHE

Annealing su tutte le specieDisegno primer per

l’analisi SNuPE Coda di poli T all’estremità 5’

SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

5’-(T)5AGTCACGACGTCGCTGAGTAT-3’

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

3. PCRFw Rev

245

PURIFICAZIONE PCR

1. Marker; 2. campione; 3. controllo negativo

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

4. REAZIONE SNuPE

PRODOTTO di PCR PURIFICATO

PRIMER SNuPEREADY REACTION MIX

AmpliTaq®DNA Polymerase;FS Reaction Buffer;

ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddTTP,ddATP)

O BASE

H

H

H

H HH

CH2

O-PO

OPO

OO-

PO

OO-

O-

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX)

DenaturazioneDenaturazione..T5’ 3’Specie ASpecie AA 5’3’

AnnealingAnnealingdel primer.del primer. T5’ 3’

A 5’3’Specie ASpecie A

STRATEGIA SPERIMENTALE

4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX)

Estensione del Estensione del primer.primer.

T5’ 3’

A 5’3’T

O BASE

H

H

H

H HH

CH2

O-PO

OPO

OO-

PO

OO-

O-

Specie ASpecie A

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX)

Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.

I

lunghezza

I

lunghezza

I

lunghezza

3’ 5’TSpecie CSpecie C

Specie BSpecie B 3’ C 5’

Specie ASpecie A 3’ A 5’

G

A

T

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX)

Elettroforesi capillare Elettroforesi capillare

I

3’ 5’TA

Specie BSpecie B

Specie ASpecie A 3’ AT

5’

lunghezza

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

TGSpecie C

TASpecie B

CASpecie A

SNP 2SNP 1Specie

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

TGSpecie C

TASpecie B

CASpecie A

SNP 2SNP 1Specie

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

TGSpecie C

TASpecie B

CASpecie A

SNP 2SNP 1Specie

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC

SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC

SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

TGSpecie C

TASpecie B

CASpecie A

SNP 2SNP 1Specie

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAYT

SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT

SpecieA 215 TCTACGTTCAGTCACGACGCCGCTGAGTATACGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG

SpecieB 215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATCCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG

SpecieC 215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG

5’-(T)14CGTTCGCCCGCTGACTATACG-3’ PRIMER 1 (35 basi)

5’-(T)5TACGTTCAGTCACGACG-3’ PRIMER 2 (22 basi)

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX)

PRODOTTO di PCR PURIFICATO

READY REACTION MIX

AmpliTaq®DNA Polymerase;FS Reaction Buffer;

ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddUTP,ddATP)

PRIMER 1 PRIMER 2

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

4. REZIONE SNuPE (MULTIPLEX)

DenaturazioneDenaturazione..

A

AnnealingAnnealing del primer.del primer.

A5’ 3’

T 5’3’

C

G

5’ 3’T 5’3’

CGSpecie ASpecie A

Specie ASpecie A

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX)

Estensione del primer.Estensione del primer.

AA

T

C 3’5’

5’3’ GCSpecie ASpecie A

I

lunghezza

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)

Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.A5’ 3’

T 5’3’

C

G

A5’ 3’

T 5’3’

T

A

Specie CSpecie C

Specie BSpecie B

G5’ 3’

C 5’3’

T

A

A

A

G

C

T

T

I

lunghezza

I

lunghezzaI

lunghezza

Specie ASpecie A

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)

Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.

I

lunghezza

A

G

C

T

A5’ 3’

T 5’3’

C

GSpecie ASpecie A

Specie CSpecie CG5’ 3’

C 5’3’

T

A

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)

Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.

AT

A C

Specie BSpecie B

Specie ASpecie A

3’5’

5’3’ GC

I

lunghezzaAT

A T 3’5’

5’3’ AT

VANTAGGI TECNICA SNuPE

Single Nucleotide Primer Extension

RAPIDITA’ di ESECUZIONE

SENSIBILITA’

RILEVAZIONE SNPs in QUALSIASI PUNTO del MARCATORE SCELTO