Lez 9

• Control of Gene Expression –1

• procarioti

Regolazione genetica nei procarioti

Operone del triptofano

I principi della regolazione trascrizionale

• Nei batteri i geni sono controllati principalmente da molecole dell’ambiente, che agiscono su proteine regolatrici: attivatori o repressori.

• Il repressore si lega all’operatore sul DNA• L’attivatore si lega ad un sito vicino al promotore

ed aiuta il reclutamento della RNA polimerasi. • Alcuni attivatori agiscono con meccanismo

allosterico, inducendo il passaggio da complesso chiuso ad aperto

Reclutamento della RNA polimerasi.

 In assenza di attivazione e di repressione la RNA polimerasi si lega occasionalmente al promotore ed inizia un basso livello di espressione, livello basale.

 Il legame del repressore alla sequenza dell'operatore blocca il legame delle RNA polimerasi e quindi inibisce la trascrizione.

 Il reclutamento delle RNA polimerasi da parte dell'attivatore porta ad elevati livelli di trascrizione.

Attivazione allosterica della RNA polimerasi.

 La RNA polimerasi è legata al promotore in un complesso chiuso stabile.

 L'attivatore interagisce con la polimerasi promuovendo la trascrizione a complesso aperto ed elevati livelli di trascrizione.

L'interazione tra proteine legate al DNA.

Il legame cooperativo tra proteine legate a siti adiacenti.

Legame cooperativo tra proteine posizionate su siti distanti

Una proteina che curva il DNA (architettonica) può facilitare l'interazione tra due proteine che legano il DNA.

Una proteina che curva il DNA si lega su di un sito collocato tra il sito di legame dell'attivatore ed il promotore. Questo legame avvicina nello spazio due siti e quindi favorisce l'interazione tra l'attivatore legato al DNA e la polimerasi.

Procarioti: meccanismi di controllo

Operone Lac

• L’operone di Lac contiene tre ORF: lacZ: B-galattosidasi, lacY: permeasi del lattosio, lacA: trigalattoside transacetilasi. È regolato dal repressore Lac: lacI

• Anche CAP (Catabolite Activator Protein) regola l’operone. È un recettore di cAMP.

• Il repressore Lac lega il DNA solo in assenza di lattosio,

• CAP è un attivatore, e lega il DNA solo in assenza di glucosio, quando cAMP è alto.

L'operone Lac.

I tre geni lacZ, LlcY e lacA sono trascritti come un unico mRNA dal promotore. Il sito CAP e l'operatore sono lunghi circa 20 bp ciascuno. L'operatore si trova sul promotore nella regione legata dalla RNA polimerasi e di sito CAP si trova proprio a monte del promotore.

L'espressione dei geni lac.

La presenza o l'assenza degli zuccheri lattosio e di glucosio controlla il livello di espressione dei geni lac. Livelli elevati di espressione necessitano la presenza del lattosio (quindi la assenza di un repressore lac funzionale) e l'assenza della preferenziale forma di energia, il glucosio (e quindi la presenza dell'attivatore CAP).

Quando è legato all'operatore il repressore Lac esclude la polimerasi, indipendentemente dalla presenza di CAP attivo.

CAP porta la polimerasi sul promotore sul promotore lac dove va incontro ad una isomerizzazione spontanea a compresso aperto.

La regione di controllo dell'operone lac. Sono mostrate le sequenze nucleotidiche e l'organizzazione della regione di controllo dell'operone lac. Le barre colorate sotto e sopra indicano le regioni coperte dalla RNA polimerasi e dalle proteine regolatrici. Si noti che il repressore lac copre più DNA della sequenza definita come il minimo sito di legame dell'operatore, e la RNA polimerasi copre più DNA di quello definito dalle sequenze che formano il promotore.

Le due metà simmetriche dell'operatore lac

Lambda repressor

• Può agire da attivatore o repressore

L'attivazione del promotore lac da parte di CAP.

Il legame dell’RNA polimerasi al promotore lac con l'aiuto di CAP. Il CAP è riconosciuto dalla CTD della subunità alfa. Quando interagisce con il CAP l'alfa-CTD contatta anche il DNA adiacente al sito CAP.

struttura del complesso CAP-alfa CTD-DNA. CAP è mostrato legato al suo sito sotto forma di dimero. Inoltre viene mostrato l‘alfa-CTD della RNA polimerasi legata ad un pezzo di DNA adiacente e mentre interagisce con il CAP. Il sito di interazione su ciascuna proteina coinvolge residui identificati geneticamente. CAP è in turchese alfa-CTD in viola. Ad ogni molecola di CAP è legata una molecola di ATP

Il legame al DNA di una proteina con il dominio helix-turn-helix.

Una proteina lega DNA come dimero e le due subunità sono indicate dai cerchi ombreggiati. L'elica di riconoscimento è indicata con R.

Legame idrogeno sono instaurati tra il repressore di lambda e le coppie di base nel solco maggiore del suo operatore.

Il repressore lac si lega ai due operatori come tetramero

• L’ansa si forma tra le repressore legato all'operatore principale e quello a monte, ausiliario a 90 bp. Un'ansa del tutto simile si può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp

L’attività di Lac repressor e CAP sono regolate allostericamente

• Il lattosio si trasforma in allolattosio e si lega al lac repressor.• In assenza di allolattosio il repressore è attivo, e si lega al

DNA • Il legame con allolattosio ne fa cambiare la conformazione, che

non è più competente a legare il DNA. Il sito di legame è diverso da quello del DNA.

• La presenza di glucosio mantiene bassa la concentrazione di cAMP.

• In basso glucosio cAMP aumenta, si lega a CAP e lo rende competente a legare il DNA, e ad agire da attivatore.

• CAP regola vari altri geni, tra cui cui quelli dell’operone Galattosio.

Duplice controllo dell’operon di lac

Fattori sigma alternativi

Il fago batterico SPO1, per regolare l'espressione del proprio genoma utilizza tre fattori sigma in successione. Questo fa sì che i geni virali siano espressi esattamente nello stesso ordine in cui sono richiesti.

In E. coli sigma 32 è inducibile al calore. Esso spiazza sigma70.

Attivazione mediata da NtrC: esempio di allosteria

NtrC controlla geni del metabolismo dell’azoto come glnA. La polimerasi è legata al promotore, con sigma54, nel complesso

chiuso. NtrC interagisce con una subunità 54 della polimerasi, ne induce

un cambiamento conformazionale con la transizione a complesso aperto, con attività ATPasica.

A basso azoto NtrC viene fosforilato e diventa competente a legare il DNA nel sito a 150 bp dal promotore.

MerR ruota il DNA promotore

• Gli elementi -10 e -35 del promotore merT sono esposti su due facce diverse della doppia elica perché distano 19 invece delle 15-17 bp.

• Quando Hg è assente MerR si lega e stabilizza la forma inattiva del promotore. Quando Hg è presente MerR ruota il DNA in modo da allineare nel modo appropriato gli elementi del promotore.

Il promotore mostrato è quello del genere bmr di Bacillus subtilis controllato dal regolatore di bmr. questo funziona come attivatore quando si lega al composto TPP

Struttura di un promotore simile a merT.

Promotore con uno spacer di 19 bp.

Il promotore con uno spacer di 19 bp compensato con l'attivatore funzionale.

Promotore con uno spacer di 17 bp.

Alcuni repressori trattengono la RNA polimerasi

• Esempio: il repressore Gal di E. coli che controlla enzimi del metabolismo del galattosio.

• In assenza di Galattosio, il repressore interagisce con la Pol e ne impedisce la transizione a complesso aperto.

Antiattivazione: AraC

L’operone araBAD di E. coli è attivato dall’arabinosio.

L’arabinosio si lega ad AraC inducendo una modificazione conformazionale nell'attivatore così che questi si lega come dimero ai siti araI1 ed araI2. In questo modo un monomero di AraC si posiziona vicino al promotore in modo da poter attivare la trascrizione.

Quando l’arabinosio non è presente il dimero AraC adotta una diversa conformazione e si lega araO2 ed a araI1. In questa posizione non c'è nessun monomero sul sito araI2 quindi le proteina non può attivare il promotore araBAD.

Questo promotore è regolato anche da CAP

Operone del triptofano

• l'operone triptofano di E.coli codifica per il leader e per geni strutturali che codificano gli enzimi trp

Trp si lega al Trp-repressor

Il legame con Trp determina un cambiamento conformazionale

La attenuazione• Anche con basso Trp molti tradotti terminano

prematuramente, prima del gene trpE. Solo la sequenza leader viene tradotta. Essa è seguita da un terminatore

• Ci sono 4 sequenze complementari nel mRNA 1, 2, 3 e 4. Esse si possono appaiare diversamente

• L’RNA ha una ORF di 14 amino acidi, con una forte RBS e che codifica per 2 trp.

In condizioni di elevata concentrazione di triptofano la sequenza 3 si appaia con la sequenza 4 costituendo la hairpin di terminazione della traduzione.

In condizioni di bassa concentrazione di triptofano il ribosoma si blocca sugli adiacenti codoni per il triptofano permettendo alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3 e quindi impedendo la formazione della forcine di terminazione 3 e 4. Quindi la traduzione può continuare

In assenza di sintesi proteica poiché il ribosoma non inizia la traduzione della AUG del peptide leader si forma una forcina appaiando le sequenze 1 e 2 e quindi non si forma quella data dalle sequenze 2 e 3 ne consegue che si forma una forcina con le sequenza 3 4 e gli enzimi per trp non sono espressi

Riconoscimento proteine-DNA

DNA-binding sites

DNA piegato

DNA mitocondriale di tripanosoma

AAAANNN repeats formano molecole curve

DNA può essere deformato

434 repressorCAP: catabolite activator protein

Arg e Asp • Aspargina lega A• Arginina lega G

Helix-turn-helix

HTH è una struttura molto diffusa per DNA-binding. Anche nei procarioti

Esempi di helix-turn-helix

Sequenza riconosciuta da lambda Cro

DNA-binding domains• Il zinc finger è un DNA-binding domain.• Gli steroid receptors: la proteina è inattiva finchè non

lega un piccolo ligando.• helix-turn-helix negli homeodomain,• La helix-loop-helix (HLH) anfipatica. La lunghezza del

loop varia da 12-28 amino acidi. Il motivo permette la dimerizzazione la presenza di una regione basica per il contatto con il DNA.

• Leucine zippers. Consiste in una sequenza di amino acidi con una leucina ogni sette aa per formare un dimero. Vicino ad ogni zipper c’è una regione basica per il contatto con il DNA

Struttura homeodomain

• Hanno la struttura base HLH.

Homeodomains bind related targets in DNA

The homeodomain is a DNA-binding domain of 60 amino acids that has three -helices.

The C-terminal -helix-3 is 17 amino acids and binds in the major groove of DNA.

The N-terminal arm of the homeodomain projects into the minor groove of DNA.

Proteins containing homeodomains may be either activators or repressors of transcription.

Eterodimero di due homeodomain

Due domini uniti covalentemente

Il mitivo zinc finger è un DNA-binding domain

Uno zinc finger è un’ansa di ~23 amino acidi che protrude da un zinc-binding site formato da His and Cys.

Una proteina zinc finger di solito ha molti zinc fingers.

La parte C-terminale di ogni finger forma una -elica che lega il solco maggiore del DNA.

Alcune Some zinc finger proteins legano anche RNA.

Zinc finger

Tipo. Cys-Cys-His-His

Zinc finger

• Una "finger protein" normalmente ha una serie di zinc fingers.

• la consensus sequence di un singolo finger è:

Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His

Legame al DNA di zinc finger

• Zinc fingers possono legare sequenze estese di DNA

Dimero zinc finger

• Alcune zinc fingers possono dimerizzare

Interazioni tra diversi zinc fingers e DNA

Beta sheet• Proteina batterica: Met repressor

Leucine zipper

Formazione di eterodimeri

Le Leucine zippers formano dimeri

La leucine zipper è una elica anfipatica che dimerizza.

La zipper è adiacente ad una regione basica che lega il DNA.

La dimerizzazione forma un motivo in cui le due regioni basiche legano simmetricamente degli inverted repeats nel DNA.

Helix-loop-helix proteins interact by combinatorial association

proteine Helix-loop-helix hanno un motivo di 40-50 amino acidi che comprende due eliche anfipatiche di 15-16 residui separate da un loop.

Le eliche sono responsabili della formazione dei dimeri . Le proteine HLH hanno una sequenza basica adiacente il motivo HLH che

è responsabile del legame al DNA. La classe A delle proteine HLH sono espresse in tutti i tessuti, la classe B è

tessuto specificaLe proteine di classe B spesso formano eterodimeri con la classe A.Le proteine HLH che non hanno la regione basica impediscono al partner

nell’eterodimero di legarsi al DNA.Le proteine HLH formano associazioni combinatoriali che possono variare

durante lo sviluppo per la aggiunta e perdita di proteine specifiche

Helix-loop-helix