Post on 02-Jan-2020
Importanza dello studio del modelloanimale con Glicogenosi di Tipo IIIMichela Ripolone, Raffaella Violano, Serena Pagliarani,Maurizio Moggio
Convegno AIG 2015 – 20/21/22 Novembre - Rimini
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Glicogenosi
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Glicogenosi di tipo III-GSDIII
La GSDIII è una rara malattia del metabolismo che causa un accumulo di glicogeno
s0prattutto nel fegato, nel muscolo scheletrico e nel cuore.
I pazienti affetti da GSDIII presentano epatomegalia, ipoglicemia, iperlipidemia e
ritardo della crescita. I pts adulti mostrano inoltre un progressivo coinvolgimento
muscolare.
La cardiomiopatia sintomatica non è comune ma la maggior parte dei pazienti
mostra un’ipertrofia ventricolare sinistra.
La gravità clinica nei pazienti GSDIII è molto variabile.
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Enzima Deramificante GDE
L'enzima deramificante, insieme con la glicogeno fosforilasi, degrada il
glicogeno in molecole di glucosio, rendendolo così disponibile per le
necessità energetiche del metabolismo cellulare.
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Mutazioni del gene AGL nella Popolazione Italiana
ATG TAG
3513 14 15 26 27 31 32 33 34
c.100G>Tc.112A>Tc.276delG
c.293+2T>A c.664+3A>G
c.442delA
c.672insTc.700T>Cc.753_756delGACA
c.757G>C
c.853C>T
c.1571G>Ac.1589G>C
c.1264A>Tc.1283G>A
c. 2023C>Tc. 2147delG
c.2590C>T
c.2681+1G>A
c.2728C>T
c. 2929C>T
c.3258_3259AG>CC
c.3355G>Cc.3358G>C
c.3464G>Ac.3512_3549dup+3512_3519del
c.3362+1G>C
c.3652C>T
c.3912insA
c.3980G>Ac.3963delG
c.4193G>A c.4324insA
31
Glycogen
binding
domainGlucosidase
domain
Transferase
domain
TG PAS
Esame Istologico di muscolo scheletrico di un paziente affetto da GSDIII
40X
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Esame Ultrastrutturale di muscolo scheletrico di un paziente affetto da GSDIII
12000X 7000X
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Glicogenosi in animali domestici (cani e gatti)
Brooks & Koeberl J Inherit Metab Dis 2014
Le glicogenosi che colpiscono gli animali dacompagnia sono state ben caratterizzate, e aiutanonella comprensione dei meccanismi patologici dellemalattie e lo sviluppo di terapie mirate alla loro cura
Modelli Animali nella Ricerca Scientifica
Sono utili perché:
sono biologicamente simili agli uomini
possono interagire e reagire a determinati stimoli
riproducendo quello che succede nell’uomo
aiutano nella comprensione dei meccanismi patologici
di molte malattie e nello sviluppo di terapie.
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
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Modelli Animali di Glicogenosi
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Vettore di Clonaggio per la generazione di un topoAgl knock out
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Topo KO di 18 mesi
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Analisi Western blot
+/+ +/− −/−
Muscle 216.25±36.40 134.23±13.51 2.30±1.25
Liver 37.23±1.45 23.37±6.34 5.58±1.65
GDE activity
pmole glucose/min/mg protein
Attività Enzimatica
Muscolo Scheletrico
Cuore Fegato Cervello
-175kDa-175kDa
Uomo WT HET KO Uomo WT HET KO WT HET KOWT HET KO
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Gli animali KO sono vitali e non differiscono in dimensioni e peso dailoro fratelli WT ed eterozigoti sia alla nascita sia durante la crescita
Wild Type -
Heterozygote -
Knockout -
Weight
0
5
10
15
20
25
30
35
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
Days
Weig
ht
(g)
KO mice
WT mice
Hete mice
Età: 4 giorni
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Kaplan-Meier survival plot
Survival Plot (PL estimates)
0 200 400 600 800
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Survivor
Times
WT
ETE
KO
N = 10 per ciascun genotipo
KO
+/++/-
Valutazione funzionale:hind print test
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KOWT
I topi KO, a tutte le età, mostrano difettidell’andatura dovutiall’estroflessione dellezampe.
3 mo
Valutazione funzionale: treadmill
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0
50
100
150
200
250
300
350
400
+/+ −/−
Dis
tan
ce (
m) *
Run test
Long walk
30cm/s
5 min
15cm/s
350 m
0
50
100
150
200
250
300
350
2 mo 3 mo
Seco
nd
s (
s)
9 mo
Valutazione funzionale: Rotarod
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
0
50
100
150
200
250
300
350
+/+ −/−
Late
ncy
to fa
ll (s
)
*
9 mo
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Glicemia
*** P<0.0001
* P<0.05
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
+/+ +/− −/−
Glu
cose
(m
g/d
l)
Basal glycemia
16 h fasting
*
***
WT HETE KO
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Analisi biochimiche
AST
0
100
200
300
400
500
600
700
3 mo 12 mo
U/L
ALT
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
3 mo 12 mo
U/L
ALP
0
20
40
60
80
100
120
3 mo 12 mo
U/L −/−
+/+
*
***** ***
AST ALT ALP
Cholesterol
0
20
40
60
80
100
3 mo 12 mo
mg/
dl
Triglycerides
0
20
40
60
80
100
120
140
3 mo 12 mo
mg/
dl
CK
0
50
100
150
200
250
300
350
3 mo 12 mo
U/L −/−
+/+
****
Cholesterol Triglycerides CK*** P<0,005
* P<0.05
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Il fegato del topo KO rispetto al WT è di dimensionimaggiori e di colore rosso scuro
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
3 mo 12 mo
Liv
er/b
ody
wei
ght
(%)
−/−
+/+
***
***
Non vi sono segni di cirrosi o adenomi
KO WT
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Contenuto in glicogeno
Colorazione PAS
4 mo 8 mo 12 mo 18 mo
F: Colorazione di MassonA,B,C,D,E: Colorazione Tricromica di Gomori
WT KO 4mo KO 8mo
KO 12mo KO 18mo KO 18mo
Fegato: epatociti gonfi e allargati
Scale bar: 25 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Muscolo scheletrico: progressiva vacuolizzazione
Scale bar: 20 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
KO 4m
ANALISI ULTRASTRUTTURALE: muscolo scheletrico
12000x
12000x
7000x
7000x
WT 12m
KO 12m
HT 12m
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Contenuto in glicogeno
N=5 per ciascun gruppoP <0.0005
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Skeletal muscle Heart Liver Brain
Gly
cog
en g
/10
0g
tis
sue
+/+
+/-
-/-
Cuore Fegato CervelloMuscolo Scheletrico
Lingua: importante vacuolizzazione
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F
I
H
M
DCBA
E G
L
O
N
RQP
Cervello CervellettoW
T−
/− 8
m−
/− 1
2 m
−/−
18
mEE EEPAS PAS
Nervo sciatico: morfologia normale
KO 12mo
WT
KO 12mo
KO 18mo
Colorazione Blu di Toluidina Scale bar: 12.5 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Conclusioni
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
• Abbiamo studiato un topo KO per il gene AGL. L’enzima deramificanteGDE e la sua attività sono completamente assenti in tutti i tessuti
• I topi KO mostrano un’alterata funzione muscolare fin dalla giovane età
• Nel topo KO le transaminasi epatiche e le CK sono aumentate
• Le analisi istologiche hanno rivelato alterazioni nel muscolo scheletrico chepeggiorano progressivamente con l’età.
• I topi KO presentano epatomegalia
• Il fegato, il muscolo scheletrico e il cuore mostrano un aumento del
contenuto in glicogeno
Conclusioni
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Il nostro modello murino AGL KO riproduceperfettamente la GSDIII umana
UOMO TOPO KO
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Prospettive future
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Dieta altamente proteica
Terapia genica con Virus Adeno Associati
NT
DIETAHP
VASTO TIBIALESOLEO-GASTROCNEMIO
EE 20X
MUSCOLO Valutazioni PRE- e POST-DIETA HIGH PROTEIN
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
KO NON TRATTATOFEGATO
ValutazioniPRE- e POST-DIETA HIGH PROTEIN
KO 3 MESIKO 2 MESI KO 4 MESI
EE 40X
WT
DIETA HIGH PROTEIN
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Si ringraziano
l’ Associazione Italiana
Glicogenosi,
i pazienti e le loro famiglie
per il supporto alla realizzazione
di questo progetto.
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III- Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
UO Neurologia
Responsabile: Bresolin N, MD
Genetica e Biochimica
Responsabile: Comi GP, MD
Pagliarani S, PhDLucchiari S, PhDUlzi G, PhDBordoni A, BS Fortunato F, BS
Sciacco M, MD, PhDColombo I, MDPeverelli L, MDVilla L, MD
Fagiolari G, BsCiscato P, BSNapoli L, PhDRipolone M, PhDViolano R, BsTironi R, Bs
Valentini P, Dr. Amministrativa
UOD Malattie Neuromuscolari e Rare
Responsabile: Moggio M, MD
Fondazione IRCCS Ca’ GrandaOspedale Maggiore Policlinico-Università degli Studi di Milano
Cuore: nonostante il marcato aumento di glicogeno non si nota ipertrofia o alterazione delle fibre
Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015
Colorazione Ematossilina-Eosina
WT
KO
0.00%
0.10%
0.20%
0.30%
0.40%
0.50%
0.60%
3 mo 12 mo
Hea
rt/b
od
y w
eigh
t (%
)
−/−
+/+
Scale bar: 25 μm