IMPLEMENTACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA

DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE

CANNABINOIDES EN MARIHUANA POR HPTLC Y

CONFIRMACIÓN GC/MS

Katherinne Alcamán Pantoja

Perito Químico Sección Análisis de Ilícitos

Santiago, 19 de Mayo de 2015.

Droga ilícita de mayor consumo en

Chile.

Marihuana: Sumidad florida desprovista

de semillas y tallo de la cual no se ha

extraído la resina.

Aumento del consumo en 11 puntos

porcentuales (Decimo estudio nacional

de consumo de drogas en población

escolar, SENDA 2013)

Marco ley 20.000 que sanciona el tráfico

de estupefacientes y psicotrópicos.

Esquema de planta Cannabis sativa L.

Fuente:www.botanical-online.com/florcannabis.htm

Toxicodinamia:

Receptores: CB1 (SNC) y CB2 (Periféricos).

Principales cannabinoides: Delta-9-tetrahidrocannabinol (Δ-9-THC),

cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN).

Estructuras químicas de delta-9-tetrahidrocannabinol, cannabinol y cannabidiol.

Fuente: Manual para el análisis de productos de cannabis, ONU 2009.

Efectos y Riesgos asociados a su consumo:

- Alteraciones al SNC

- Sistema Respiratorio

- Sistema Cardiovascular

- Sistema Reproductor

Percepción de la

realidad y tiempo

Ansiedad, psicosis

Cuadro amotivacional

Bloqueo impulsos

nerviosos

Neurodegeneración

Técnicas de Screening

Prueba colorimétrica Fast Blue

Análisis Microscópico

Pelos glandulares y cistólicos con cannabinoides

Análisis Cualitativo y Cuantitativo

- Cromatografía (GC/FID; GC/MS; TLC; HPTLC)

- Espectroscopía (UV; FT-IR)

Prueba Fast Blue positiva para cannabinoides

Fuente: Gentileza Laboratorio Sección Análisis de

Drogas, ISPCH.

Esquema pelo cistolico de cannabis

Fuente: Toxicología de la Drogadicción, Manuel

Repetto, 1985.

Esquema de un HPTLC marca Camag ®

Fuente: http://www.camag.com

Análisis de varias

muestras simultáneamente.

Impurezas de la muestra

quedan retenidas en la

placa.

Bajo costo.

Ventajas

Dependiente de los insumos.

Desventajas

Parámetros:

Selectividad

Linealidad y rango

Limite de Detección (LOD)

Limite de Cuantificación (LOQ)

Precisión

Exactitud

Robustez

Incertidumbre

Equipos:

HPTLC: Aplicador de muestra automático, Cámara de Desarrollo Múltiple

Automático (AMD), Revelador por inmersión y Espectrofotodensitómetro.

Todos los equipos marca Camag®.

GC/MS: Cromatógrafo de Gas, con detector de espectrómetro de masas tipo

cuadropolo y autosampler. Todos los equipos indicados de marca Agilent®

“Manual de Métodos Recomendados para el Análisis de Cannabis en Laboratorios

de Drogas”, ONU 2009.

Material de referencia:

Material de referencia de cannabinol y cannabidiol de pureza mayor al 98%

marca Sigma Aldrich® y delta-9-tetrahidrocannabinol en ampolla disuelto en

etanol de pureza mayor al 98% marca Cerilliant ®.

Fase Estacionaria:

Placa sílica gel F 254 20x10 cm

Fase Móvil:

n-Hexano/Éter dietílico (80:20)

Longitud de onda de Detección: 206 nm

Ancho de Banda: 6 mm

Volumen de Inyección

Distancia recorrida: 6 cm

Activación de la placa: Sumergida en metanol y 30 minutos a 80°C

1 µL muestra real

3 µL pool

estándares

5 µL spike

Placa Sílica Gel

Elección de la Matriz:

- Compuesto llamado RIMONABANT.

- Antagonista de los receptores cannabinoides CB1, que actúa sobre el centro

regulador del apetito.

- Falso positivo para Fast Blue.

- Pelos glandulares similares a cannabis.

- No posee cannabinoides y tampoco genera absorbancia a la misma longitud

de onda que los analitos en estudio.

Té Chino Adelgazante

Método de extracción

100 mg de muestra

Aforo a 10 mL con acetonitrilo

Sonicar durante 30 minutos

Extracción sólido -líquido

Selectividad

Densitograma muestra fortificada concentración 1,5% (p/v) y

volumen de inyección 5 µL

Densitograma de un blanco, utilizando como matriz té

adelgazante.

Espectros UV superpuestos para cada analito

Densitograma en 3 dimensiones, en color lila y verde la curva de calibración en

duplicado y de color anaranjado las muestras fortificadas

Linealidad y rango

- Curva de calibrado de 8 puntos.

- Concentraciones: 0,5% p/v; 0,75% p/v; 1% p/v; 1,5% p/v; 3,5% p/v; 5,5% p/v; 7,5%

p/v; y 9,5% p/v.

-Análisis de varianza por regresión lineal.

THC CBD CBN

Linealidad

Curvas de calibración de 8 puntos para THC, CBN y CBD

Superposición de Curvas de Calibrado

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Área Promedio CBD

Área Promedio CBN

Área Promedio THC

Robustez

- Degradación de los analitos: Analizando la misma placa durante

3 días.

-Uso de 3 placas diferentes:

Merck GLP elaboración 2008

Merck fecha elaboración 2013

Distinto proveedor y tamaño Placas de silica gel marca MERCK

Fuente: http://www.merck

Robustez

-Uso de 3 placas diferentes:

- Fase móvil en distinta proporción:

Conc. Prom.

en % p/v

CBN (%p/v) CBD (%p/v) ∆9-THC

(%p/v)

Merck 1 GLP

1,657 1,426 1,718

Merck 2

1,631 1,289 1,617

Otro

proveedor

0,080 0,045 0,048

n-Hexano/ Éter dietílico 90:10 n-Hexano/ Éter dietílico 70:30 n-Hexano/ Éter dietílico 80:20

Parámetro

LOD/LOQ THC 0,7 / 2,3 %p/v

CBN 0,3 / 1,2 %p/v

CBD 0,3 / 0,9 %p/v

Repetibilidad

C.V = 0,1%

Reproducibilidad

C.V = 3,8%

Exactitud

Recuperación de 99,5%

Totalidad de las

muestras presenta

cannabinoides.

- Tiempo retención THC 5,4 min

- Tiempo retención CBN 6,5 min

Té adelgazante no

presenta

cannabinoides.

Se analizó un total de 15 muestras reales provenientes de

decomisos de distintas lugares.

Según Naciones Unidas el año 2009, la hierba de cannabis

contaba con un porcentaje de THC entre el 0,5 y 5%.

Un tercio de las muestras analizadas supera el porcentaje de

THC estimado por la ONU.

Promedio: 4,7 % THC

Código Muestra

CBN (%p/v)

CBD (%p/v)

∆9-THC (% p/v)

16328-2012-M1-2 7,339 N/D 3,061

2632-2012-M1-1 3,124 N/D 0,828

10693-2013-M1-1 0,791 N/D 6,244

16047-2013-M1-1 N/D N/D 4,389

18979-2013-M1-1 0,529 N/D 5,565

19339-2013-M1-2 N/D N/D 1,009

19735-2013-M1-1 0,848 N/D 3,784

5416-2013-M3-3 N/D N/D 1,334

5416-2013-M2-3 0,984 N/D 3,698

31131-2012-M1-3 3,015 N/D 2,760

20519-2013-M1-1 3,178 N/D 3,114

20751-2012-M1-1 1,537 N/D 1,075

21526-2013-M1-1 5,098 N/D 10,689

18295-2012-M1-1 N/D N/D 9,822

22109-2013-M1-1 2,740 N/D 12,557

Muestra Control 3,5%

p/v 3,482 3,399 3,301

Recuento 15

Promedio 4,66

Desviación Estándar 3,69

Coeficiente de Variación 79,25%

Mínimo 0,82

Máximo 12,55

Se implementó una metodología analítica para la identificación y cuantificación de cannabinoides: THC, CBD y CBN mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento con posterior confirmación mediante cromatografía gaseosa con detector masas.

Se determinó que la metodología analítica es precisa, exacta y robusta para los factores estudiados, además presenta límites de detección y cuantificación adecuados para los análisis requeridos.

Se determinó un método de extracción óptimo para las muestras de marihuana obtenidas por decomisos, tratándose de un método sencillo y reproducible.

Se estableció un método cromatográfico que permite la confirmación de los analitos estudiados en las muestras analizadas, obteniendo una corrida cromatográfica de 24 minutos que separa a los 3 compuestos de interés.

Se estableció que en Chile es posible encontrar marihuana que supera las concentraciones de THC estimadas por la ONU el año 2009, encontrándose una incautación que supera el 12% de dicho cannabinoide.

Herramienta esencial para el análisis de preparados de cannabis con potencial efecto terapéutico.

Gracias