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DIPARTIMENTO delle SCIENZE BIOLOGICHE
UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO IICNISM
Consorzio Nazionale Interuniversitario per le Scienze Fisiche della Materia
Adriana Zagari____________
Il contributo della radiazione di sincrotrone alla
conoscenza della struttura delle macromolecole biologiche
La Biologia mira alla comprensione di complessi processi biologici in cui intervengono molti componenti cellullari
Biologia Strutturale
La Biologia Strutturale interpreta i processi biologici in termini di struttura tridimensionale delle macromolecole che partecipano a tali processi. La struttura tridimensionale viene descritta dalle posizioni di tutti gli atomi che costituiscono la macromolecola
L’ utilizzo della luce di sincrotrone e’ divenuto indispensabile !
The most popular synchrotron based techniques for biomolecules:
1 - Small Angle X-ray Scattering (SAXS)
2 - X-ray Absorption Spectroscopy (XAS)Extended X-ray Absorption Fine StructureX-ray Absorption Near Edge Structure
3 - Macromolecular Crystallography (MX)
“ Every year several thousand researchers take advantage of the exceptional properties of the synchrotron radiation to study a
remarkably wide range of materials, from biomolecules tonanomagnets, and ancient Egyptian cosmetics to metallic foams”
dalle pagine web di ESRF
Cristallografia di macromolecole biologiche
La figura illustra la traccia della catena polipeptidica della mioglobina pubblicata su Naturenel 1958 da John Kendrew e collaboratori
La mioglobina (1958)
Recenti successidella cristallografiadi macromolecolebiologiche
La disponibilità della radiazione di
sincrotrone e la costruzione di
nuove linee per la biologia ha dato
impulso ad importanti progetti
di cooperazione internazionale di
GENOMICA STRUTTURALEStructural genomics
pipeline
Structural Biology at ESRF
Structural Genomics on: - Deinococcus radiodurans
- Helicobacter pylori
Tunable Beamlines: MAD technique (multiwavelenght anomalous diffraction)microfocus (10 micron)automation
31541
5522206
--------37269
28
6
1353
121
902
705
29258
4690
TOTALOtherTheirComplexes
NucleicAcids
Proteins
X-rayStructures
NMRaltro
PDB Current Holdings: June 23, 2006
Il Protein Data Bank
1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 20060
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
Stru
ctur
es d
epos
ited
Year
total annual
Il Protein Data Bank
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 20060
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Stru
ctur
es d
epos
ited
Year
total synchrotron
Total vs Synchrotron
3 luglio 2006
Il Protein Data Bank
Il Protein Data Bank
Un esempio di file del PDB
…………..ATOM 159 N GLU I 19 17.953 30.382 47.349 1.00 31.70 N ATOM 160 CA GLU I 19 18.924 29.486 47.967 1.00 32.26 C ATOM 161 C GLU I 19 20.221 30.177 48.241 1.00 30.57 C ATOM 162 O GLU I 19 20.853 29.984 49.280 1.00 30.42 O ATOM 163 CB GLU I 19 19.159 28.290 47.063 1.00 34.66 C ATOM 164 CG GLU I 19 17.861 27.539 46.835 1.00 42.15 C ATOM 165 CD GLU I 19 18.006 26.316 45.955 1.00 48.99 C ATOM 166 OE1 GLU I 19 19.143 26.046 45.489 1.00 50.09 O ATOM 167 OE2 GLU I 19 16.961 25.639 45.735 1.00 53.19 O ATOM 168 N LEU I 20 20.609 31.010 47.300 1.00 29.37 N ATOM 169 CA LEU I 20 21.838 31.769 47.431 1.00 29.17 C ATOM 170 C LEU I 20 21.659 32.694 48.621 1.00 30.35 C ATOM 171 O LEU I 20 22.531 32.815 49.473 1.00 31.40 O ATOM 172 CB LEU I 20 22.037 32.550 46.143 1.00 26.77 C ATOM 173 CG LEU I 20 23.299 32.445 45.319 1.00 27.07 C ATOM 174 CD1 LEU I 20 24.045 31.140 45.420 1.00 27.90 C ATOM 175 CD2 LEU I 20 22.905 32.764 43.898 1.00 26.73 C ATOM 176 N LEU I 21 20.495 33.331 48.697 1.00 31.43 N ATOM 177 CA LEU I 21 20.187 34.214 49.809 1.00 32.68 C ATOM 178 C LEU I 21 20.250 33.452 51.150 1.00 34.61 C ……………………
ATOM 1340 N THR I 156 4.494 35.220 38.923 1.00 43.67 N ATOM 1341 CA THR I 156 4.626 34.376 37.725 1.00 45.46 C ATOM 1342 C THR I 156 3.345 33.587 37.392 1.00 46.98 C ATOM 1343 O THR I 156 3.263 32.960 36.357 1.00 46.79 O ATOM 1344 CB THR I 156 5.856 33.423 37.783 1.00 45.05 C ATOM 1345 OG1 THR I 156 5.652 32.422 38.781 1.00 44.86 O ATOM 1346 CG2 THR I 156 7.154 34.188 38.090 1.00 43.77 C …………………………….
Cristallografia di macromolecole biologiche
Primo step: il cristallo
a
b
c
αβ
γ
Cella elementare, reticoli tridimensionali, cristalli
a
b
c
Cella elementare
Reticolo tridimensionale
Cella elementare
Unique property of protein crystals
Crystals contain water up to 80%
Crystals are biphasic, as they contain liquid channels
Ordered protein molecules have large surfaces in contact with water
The water presence produces advantages
Ionisable residues change their charge, if pH of the medium is changed In the crystal, the protein undergoes moderate conformational changes
Small molecules, like ligands, substrates, inhibitors, diffuse into crystals and react!Enzymes are still active in the crystal state!
The water presence produces disadvantages
Disintegrate if allowed dehydratePresent weak lattice forcesAre soft and crush easilyDiffract poorly……….
Protein crystals:
Montaggio del cristallo
A temperatura ambiente e con sorgenti convenzionaliil cristallo va montato dentro un capillare chiuso ed in presenza delle acque madri, in modo che la tensione di vapore sia la stessa
I cristalli di proteine, quando esposti alla radiazione X,si danneggiano
Dopo brevi ( secondi ) esposizioni ai sincrotroni o lunghe (20-30 ore) esposizioni con generatori convenzionali, i cristalli di proteine
non diffrangono più
CriocristallografiaDecadimento del cristallo
Il fenomeno è estremamente più esteso per i cristalli di proteine che per gli altri cristalli perché i radicali liberi - che inizialmente si formano per effetto della interazione tra i raggi X e le molecole - DIFFONDONO rapidamente nei canali liquidi del cristallo di proteina generando a cascata altri radicali.
Il fenomeno è estremamente più esteso usando come sorgente la radiazione di sincrotrone rispetto alle sorgenti convenzionali
Criocristallografia al sincrotrone
Per evitare il decadimento si opera alla T di 100 K In tal modo si rallenta moltissimo la diffusione dei
radicali liberi
Perché proprio a 100 K?
Perchè l’ acqua, in soluzioni acquose Perchè l’ acqua, in soluzioni acquose crioprotettricicrioprotettrici, se portata , se portata
velocemente (s) a quella temperatura non forma ghiaccio (che è velocemente (s) a quella temperatura non forma ghiaccio (che è
comunque cristallino e diffrangerebbe) ma una forma solida vetrocomunque cristallino e diffrangerebbe) ma una forma solida vetrosa sa
dell’ Hdell’ H22O.O.
Set up del cristallo “surgelato”
Il cristallo viene “pescato” con un piccolo loop di fibra ( diametro dell’ ordine delle dimensioni del cristallomicron)
Il cristallo viene immerso per pochi secondi (5-20 s) nel liquidocrioprotettore (Ad es. aggiungendo glicerolo)
Flash-cooling
Il loop viene posto sotto flusso d’ azoto a 100 K. La soluzione in cui è immerso il cristallo solidifica ma resta trasparente.
Questa operazione viene spesso fatta nel proprio laboratorio e i cristalli conservati in un “cilindro del sample changer” e poi portati o spediti al sincrotrone.
Arzt, S. et al. “Automation of macromolecular crystallograpghy beamlines”Progress in Biophysics & Mol. Biology 2005, 89: 124-152
Automazione sulle beamlines dedicate alla cristallografia di macromolecole biologiche
Basket for sample changer
Automazione sulle beamlines dedicate alla cristallografia di macromolecole biologiche
Arzt, S. et al. “Automation of macromolecular crystallograpghy beamlines”Progress in Biophysics & Mol. Biology 2005, 89: 124-152
Fascio di raggi-X
Rivelatore
Raggiodiffratto
Cristallo di proteina
Immagine di diffrazioneGoniometro per il controllodell’orientazione del cristallo
Esperimento di diffrazione
Il reticoloreciproco
Sorgente deiraggi X
Rivelatore
Per registrare le intensità deiriflessi, il cristallo deve ruotare
Immagine di diffrazione
I cristalli di MB spesso diffrangono solo a bassa risoluzione, perché i riflessi ad alto tetahanno intensita’deboli che si confondono con il rumore di fondo
La risoluzione dei dati di diffrazione
θ 2,d2
θ1
d3,θ3
La legge di Braggλ = 2 d(h,k,l) sen θ
λ è noto, dalla posizione del riflesso(hkl) si ottengono θ o d
d(hkl), distanza tra i piani del cristallo che, per riflessione, hanno generato il riflesso con indici hkl.
dmin corrisponde alla Risoluzione a cui diffrange il cristallo. Migliore è la risoluzione, minore è il valore di d (Å)
Urea Termolisina
Proteina del virus del raffreddore
Risoluzione limite di alcuni cristalli
N ref = Numero di riflessi misurabili
N ref = 2 π V3 d 3
2.3Å
2.3Å
2.3Å
L’ INTENSITA’ MISURATA, per ogni riflesso (hkl), è circa EGUALE AL QUADRATO DEL MODULO DEL FATTORE DI STRUTTURA
I (h,k,l) = k |F(h,k,l)|2
F (h,k,l) = |F(h,k,l)| exp (i φ)Quindi noi conosciamo solo le ampiezze dei raggi diffratti non la fase
( ) ( ) ( )[ ]∑ ∑ ∑ ++−=h k l
lzkykx2explkhFV1zyxρ iπ
La fase viene ottenuta mediante metodi di Solving(molto importante il MAD, praticabile solo al sincrotrone).
Si passa poi a calcolare la densità elettronica perché gli atomi vengono localizzati in corrispondenza dei massimi della funzione densità elettronica
Determinazione della struttura
Esempi di mappe di densità elettronica
NECESSITA’ del sincrotrone per registrare dati a più alta risoluzione e determinare strutture più accurate
NECESSITA’ del sincrotrone per registrare pattern di diffrazione con intensità deboli/forti in caso di pseudo-simmetrie
XX--ray synchrotron radiation frame fray synchrotron radiation frame fromromcrystals of 3(Procrystals of 3(Pro--ProPro--Gly) Gly) 1100
Real structure for Real structure for 33 (PPG)(PPG)10 10 (collagen model)(collagen model)
Struttura affinata e depositata a 1.3 Å di risoluzione
Cristalli di Cristalli di proteine nelloproteine nello spaziospazio
Viaggia alla velocità di 29000 km/hcon periodo orbitale di 90’
PerchéPerché la MICROGRAVITA’ ?la MICROGRAVITA’ ?AssenzaAssenza di di sedimentazionesedimentazione
AssenzaAssenza di di motimoti convettiviconvettivi dovutidovuti a a gradientigradienti di di densitàdensità
Il Il trasportotrasporto delledelle sostanzesostanze è solo è solo diffusivodiffusivo
I CRISTALLI SONO PIU’ ORDINATI E I CRISTALLI SONO PIU’ ORDINATI E DIFFRANGONODIFFRANGONO
I RAGGI X A PIU’ ALTA RISOLUZIONEI RAGGI X A PIU’ ALTA RISOLUZIONE
Foto scattata dalla NASA un giorno dopo il Foto scattata dalla NASA un giorno dopo il landinglanding
CristalliCristalli cresciuticresciuti in in microgravitàmicrogravità
PROGETTAZIONE DI FARMACI : Enzimi bersaglio
Ricadute e applicazioni
Campo biomedicoCampo farmaceuticoCampo biotecnologico…………………………
Dal cristallo al farmaco
Struttura ad alta risoluzione
BassaRisoluzione
X
From NASA web site
Diabete100 Milioni di pazienti
Influenza800 milioni di persone
all’ anno
Malaria20 milioni di pazienti
Plasmodium falciparum
DIPARTIMENTO delle SCIENZE BIOLOGICHE
UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO IICNISM
Consorzio Nazionale Interuniversitario per le Scienze Fisiche della Materia
Adriana Zagari____________
Il contributo della radiazione di sincrotrone alla conoscenza della struttura delle macromolecole
biologicheII parte
Rnasi in funzione del pHa risoluzione atomica
Il ribosoma
Due casi in studio(radiazione di sincrotrone insostituibile)
sincrotrone
26 giugno 2006
Strutture a risoluzione atomica(d < 1.2 Å)
Le strutture a risoluzione atomica forniscono modelli molto accurati (circa 0.02 Å ):
Sono localizzati molti degli atomi di idrogenoCatene laterali in doppia conformazione
Strutture a risoluzione atomica(d < 1.2 Å)
Utili modelli per comprendere meglio:
Le correlazioni tra struttura e funzione, Meccanismi cataliticiInterazioni con ligandiStato di protonazione di residui carichiMonitorare piccole modifiche dovute a variazioni dell’
ambiente esterno come ad es il pH (non praticabile per cristalli di piccole molecole)
RNAsi AMeccanismo catalitico dipendente dal pHCristalli diffrangenti a circa 1Å
Dati di diffrazione
Qualche mappa di densità elettronica a 1 Å
Titolazione acido-base al sincrotrone
Il Ribosoma
Il maggiore successo della cristallografia di macromolecole biologiche mediante l’ utilizzo della radiazione di sincrotrone
M.W. 850,000 Da1500 nucleotides21 proteins !
M.W. 1,450,000 Da3000 nucleotides35 proteins !
Il Ribosoma
This material is provided for educational use only. Property of :Joachim Frank Albany, New York 12201-0509
Ribosoma - the machine (protein factory)
mRNA - porta il messaggio
tRNA - dizionario con 20 parole (amminoacidi)Con il suo anticodone riconosce il codonedel mRNA e porta il corrispondente amminoacido sul ribosoma
Altri fattori: …..
The players
Il Ribosoma: uno schema
APE
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mRNA fornisceIl codice per l’ Amminoacido del aa tRNA
Ogni amminoacidoViene legato allaCatena peptidicaIn crescita, che poi fuoriesce dal tunnel
Subunita 30S Subunita 50S
280A
210 A
Ricerche condotte nell’ ultimo ventennio hanno portato all’ ottenimento di cristalli delle singole subunità 30S e 50S di ribosomi da batteri.
Le Strutture cristalline, determinate a circa 3 Å di risoluzione usando come sorgente di raggi X il sincrotrone, sono ora disponibili nel PDB e costituiscono un patrimonio di valore inestimabile per la comunità scientifica.
Il Ribosoma
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Dati Cristallografici
(ESRF, APS)
Sunit 30S (Deinococcus radiodurans)
Unit cell parameters (Å) 170.3 , 411.1, 695.5
Resolution limit (Å) 3.4
Mosaicity (°) 0.3
Number of unique reflections 291247
Completeness (%) 88.1
Rmerge (%) 9.9
<I>/<s(I)> 5.4
R-factor/ R-free (%) 26.2 / 31.0 (5%)
Molti pensano che una struttura cristallina sia rigida e quindi non sia un buon modello per processi dinamici quali ad es. la catalisi.
By Dunitz JD et al. Interpretation of atomic displacement parameters fromdiffraction studies of crystalsJ. Phys. Chem. 1988, 92:856-867
Diversamente ….”A Crystal should not beconsidered a chemical cemetery; long rows of molecules interred in a chemical cemetery ;long rows of molecules interred in a rigidgeometrical arrangement, lifeless, comparedwith the molecular mazurkas that can beimagined to occur in solution………
Il RibosomaUn breve filmato sulla subunità 30S
http://alf1.mrc-lmb.cam.ac.uk/~ribo/movies/
Yonath,Max Planck Institut,Hamburg, Germany& Weizmann Institute of Science,Rehovot, Israel
Noller,University of CaliforniaSanta Cruz
Cate,University of CaliforniaBerkley
CREDIT for Ribosome studies
Steitz,Yale university,New Haven,USA
Ramakrishnan,MRC, Cambridge,UK
La struttura cristallina del ribosoma, e di tanti altre macromolecole biologiche e di loro complessi, determinate in prestigiosi laboratori di tutto il mondo, ha contribuito in maniera decisiva ai grandi progressi nel campo della biologia…..
NON SAREBBE STATOPOSSIBILE SENZALA DISPONIBILITA’ DELLESORGENTI DI RADIAZIONEDI SINCROTRONE
Lesson learntReovirus
RNA polymerase
Nucleosome HIV envelope protein
Suggested Readings
Berisio R. et al.Protein Titration in the crystal state J.Molecular Biology (1999) 292, 845-854
Hendrickson W. Synchrotron crystallographyTIBS (2000), 25637-653. Review
Noller HFRNA structure: reading the ribosomeScience 2005, 309, 1508-1514
Chayen NTurning protein crystallisation from an art into a science.Curr Opin Struct Biol. 2004 Oct;14(5):577-83. Review.