Elementi trasponibili

Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all’altro del cromosoma

Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c’è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

sito donatore sito accettore

GATCACTAGT

sito bersaglio

ripetizioni dirette del sito bersaglio

GATCACTAGT

GATCACTAGT

Gli elementi IS

Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione.

Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi

TrasposasiIR IR

IS2, IS3, IS4, IS5

InsAIR IR

InsB

768 bp

IS1210 bp 273 bp E.coli 3-12

Shigella 30-40Serratia 2{

lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bplunghezza media IR: 10-25 bp

altri geniIR IR IR IR

sequenza IS sequenza IS

Trasposoni composti

trasposone lunghezza modulo marcatori genetici(bp) terminale

Tn3 4957 AmpTn501 8200 HgTn951 16500 Utilizzazione lattosioTn5 5700 IS50 KcTn9 2500 IS1 CmTn10 9300 IS10 TetTn1681 2061 IS1 Enterotossina stabile

al calore

IS

trasposizione in un sito adiacente

Origine dei trasposoni composti

IS

1 o più geni batterici

GGGTTTCCAAA CCCAAAGGTTT

GGGTTTCCAA AC CCAAAGGTTT

Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un

trasposone

La trasposasi induce tagli sfalsati nel sito bersaglio

Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un

trasposone

G GGTTTCCAA GGTTTCCAA AC CCAAAGGTT CCAAAGGTT T

inserzione del trasposone

riempimento delle interruzioni

GGGTTTCCAA AC CCAAAGGTTT

Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni

Inattivazione del gene bersaglio

promotore DNA

mRNA

proteina

Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni

Inattivazione del gene bersaglio

promotore DNA

mRNA

proteina assente o tronca

gene 1P gene 2 gene 3

mRNApolicistronico

P

Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto “polare”

Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione è bloccata dall’ elemento trasponibile

Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni

Attivazione di geni silenti

promotoredebole

DNA

gene non trascritto o scarsamente trascritto

gene altamente trascritto

promotoreforte

Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso l’esterno

I trasposoni svolgono un ruolo importante nel movimento dei geni per la resistenza agli antibiotici e altri geni da un genoma a un plasmide e viceversa

L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella

promotoredebole

Il ceppo iniziale di Klebsiella era poco resistente ai beta-lattamici poichè il gene ampC era scarsamente trascritto

ampC

Il gene ampC di K. pneumoniae codifica per una -lattamasi

L’odissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella

ampC

Sotto la selezione degli antibiotici il gene ampC ha acquisito due sequenze IS con il risultato di essere maggiormente trascritto conferendo un livello di resistenza clinicamente significativo

promotoreforte

IS IS

Il risultante trasposone è stato capace di muovere ampC in un plasmide coniugativo, oggi diffuso a molti ceppi di Klebsiella

Quello che un tempo era un gene di resistenza clinicamente irrilevante è diventato il terrore degli ospedali – tutto grazie alle IS

X

Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni

delezione

X

Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni

inversione

a d

a

d

a d

b c

b

c

c b

Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni

fusione di repliconi

formazione del cointegrato

sequenza ripetuta invertita di 38 bp

tnpA

trasposasi

tnpR bla

resolvasi b-lattamasi

sito di risoluzione delcointegrato

il trasposone Tn3

Un virus trasponibile: il batteriofago Mu

E’ un virus temperato

In seguito ad infezione, il suo DNA si integra in siti distribuiti casualmente sul cromosoma

Tra i batteri lisogeni si osservano mutanti dovuti all’inattivazione per integrazione del profago

Si replica mediante trasposizione (una nuova copia del DNA virale è inserita in un punto diverso del cromosoma batterico)

Come i trasposoni è in grado di promuovere riarrangiamenti del materiale genetico (delezioni, inversioni, fusione di repliconi ecc.)

A Bc

immunità

integrazionereplicazione

geni della testa e della coda

regione Ginvertibile

La mappa genetica del fago Mu

C

Il plasmide di resistenza R1

IS3

IS3

IS2

inc, reporiT

A

L

E

B

C

F

HG

S D I

F

J

K

94 Kb

Gli elementi trasponibili sono responsabili dell’integrazione del fattore F

L’adattamento dei batteri

Strategie di adattamento

mutazione regolazione dell’espressione genica

regolazione della trascrizione

regolazione della traduzione

regolazione post-traduzionale

trasferimento genicoorizzontale

T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96

regione -35 regione -10

RNA polimerasi e inizio della trascrizione

RNA polimerasi

Complesso proteico di 480.000 D costituito da 5 subunità:2’

Nucleo enzimatico Fattore sigma

Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è in grado di iniziare la trascrizione al sito corretto.Il fattore sigma è responsabile del corretto riconoscimento del promotore. Viene rilasciato appena inizia la trascrizione.

2’

Fattori sigma alternativi e regolazione globale dell’espressione

genica

Subunità sigma Geni trascrittiSegnalein E. coli

s 70 maggior parte dei geni

s 32 geni heat-shock temperatura elevata

s 55 geni regolati dall’azoto carenza di

ammonio

s 38 geni da stress ossidativi agente ossidanteOgni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.

La sporulazione in Bacillus subtilis e i fattori sigma

alternativiLa sporulazione rappresenta un drastico cambiamento dello stile di vita del batterio

La transizione da una fase all’altra si realizza attraverso cambiamenti globali dell’espressione genica mediati da fattori sigma alternativi

Subunità sigma Geni trascritti

s 43 fase vegetativa

s 32 inizio sporulazione

s 29 inizio sporulazione (fase II)

gp28 sporulazione intermedia

gp33-34 fasi finali della sporulazione

regione ricca in GC

serie di U

Terminazione Rho-indipendente

5’-A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U-U-U-U-U-U-U-3’

la polimerasi continua la trascrizione

terminatore

la polimerasi termina la trascrizione

Terminazione Rho-dipendente

L’operone lac

Z Y AO

lacZ: -galattosidasilacY: -galattoside permeasilacA: -galattoside transacetilasi

Geni strutturali

mRNA policistronicoregolazione coordinata: tutti i geni si esprimono all’unisono

P

Il gene regolatore lacI codifica per la proteina regolatrice (repressore)

I

mRNA

DNA

proteine

Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico

Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole di -galattosidasi (<5)

lattosio

glucosio galattosio

In presenza di lattosio , nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole di -galattosidasi (5-10% delle proteine totali)La molecola che causa la produzione dell’enzima capace di metabolizzarla è chiamata induttore

La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della -galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG) Se l’induttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca

Z Y AOPI

Il repressore previene la trascrizione legandosi a una sequenza di DNA chiamata operatore.

repressore

RNApolimerasi

L’operone lac è sottoposto a regolazione negativa

In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione dei geni strutturali. La proteina regolatrice prende il nome di repressore

In che modo l’operone lac risponde all’induttore?

Z Y AOPI

induttore

Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame all’operatore e il secondo per il legame dell’induttore

Quando il repressore lega l’induttore subisce una modificazione conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito operatore (esempio di controllo allosterico)

Z Y AOPI

repressore

Mutazioni a carico dell’operatore

Mutazioni nel gene O (Oc) portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali: vengono trascritti in assenza dell’induttoreCostitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di crescita

Mutazioni nel gene I (Ic), a carico del sito di riconoscimento dell’operatore, portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali

Z Y AOPI

Mutazioni a carico del repressore

repressore

Mutazioni nel gene I (IS), a carico del sito di riconoscimento dell’induttore, sono responsabili della super-repressione: i geni strutturali non vengono più indotti in presenza dell’induttore

Z Y AOPI

Mutazioni a carico del repressore

repressore

induttore

Un altro sistema di regolazione negativa:la tossina di Corynebacterium diphtheriae

La tossina viene prodotta quando il livello di ferro nella gola è basso

geni per la tossinaOP

gene regolatore

repressore

trascrizione e produzione della tossina

repressore ferro

La molecola effettrice (il ferro) non è un induttore bensì un co-repressore

Un sistema in cui la molecola effettrice coopera con il repressore per bloccare la trascrizione è definito reprimibile

B151

La regolazione positiva dell’espressione genica

Nel controllo positivo, la proteina regolatrice promuove il legame della RNA-polimerasi al promotore

RNApolimerasiattivatore

gene1 gene2 gene3

gene regolatore

P

“activator binding site”

induttoreinduttore

L’attivatore non si lega al DNA in assenza dell’induttore

trascrizione

P

P

ABS

ABS

trascrizione

P

ABS

P = promotoreABS = activator binding site

Il regulone

Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway

Il regulone del maltosio è sotto controllo positivo

gene1 gene2 gene3

gene regolatore

P

“activator binding site”

maltosioattivatore +maltosio

Gene o operonelocalizzazionearg A 60 minarg B-C-E-H 88 minarg D 72.5 minarg F 6 minarg G 68 min

Il regulone per la biosintesi dell’arginina

Esempio di regulone sottoposto a controllo negativo: tutti i geni per la catena biosintetica dell’arginina sono regolati da un repressore

Sistemi di controllo globale dell’espressione genica

Un batterio può regolare molti geni diversi simultaneamente in risposta a cambiamenti ambientali. Spesso più operoni o reguloni diversi possono essere attivati o disattivati

Il regulone è l’insieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway

Se geni e operoni appartengono a pathway differenti si parla di moduloni

ESEMPI: regolazione mediante fattori sigma alternativirisposta SOSrepressione da catabolita

Fattori sigma alternativi e regolazione globale dell’espressione

genica

Subunità sigma Geni trascrittiSegnalein E. coli

s 70 maggior parte dei geni

s 32 geni heat-shock temperatura elevata

s 55 geni regolati dall’azoto carenza di

ammonio

s 38 geni da stress ossidativi agente ossidanteOgni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.

Repressione da catabolita

Quando un batterio cresce in un mezzo contenente glucosio come risorsa di energia, la sintesi di enzimi catabolici non correlati viene inibita

In presenza di diverse fonti di energia, il batterio sceglie per prima quella più facilmente utilizzabile

Gli enzimi per il catabolismo del glucosio sono costitutivi

Circa 300 geni di E. coli sono regolati mediante repressione da catabolita

La crescita diauxica

0 1 2 3 4

Tempo (ore)

esaurimento del glucosio

induzione galattosidasi

utili

zzaz

ione

del g

luco

sio

utilizz

azione

del lat

tosio

Densi

tà b

att

eri

ca

Crescita in un terreno contenente glucosio e lattosio

il glucosio inibisce la sintesi di -galattosidasi

durante la fase di latenza viene espresso l’operone lac e sintetizzata -galattosidasiIl tasso di crescita può variare

H

OH

O Adenina

OHH

O

CH2

H

O

HO-P=O

ATP

Adenilato ciclasi

AMP ciclico

Il glucosio inibisce l’attività dell’adenilato ciclasi e il livello di cAMP

La molecola effettrice della repressione da catabolita è AMP ciclico

Z Y AOPI

CAP binding site

cAMP

CAP CAP attiva

Ognuno degli operoni che CAP controlla è anche sotto il controllo di una proteina regolatrice

specifica

L’operone lac è regolato positivamente da CAP

L’attenuazione della trascrizione

OPtrpRtrpDtrpE trpC trpB trpB

L’operone triptofano

L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR

Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione

repressoreinattivo

triptofano

repressoreattivo

L’attenuazione della trascrizione

OPtrpRtrpDtrpE trpC trpB trpB

L’operone triptofano

peptide leader (14AA) attenuatore

1 2 3 4

codoni trp

leader

162 nt

mRNA

1 2 3 4

1 2 3 4

UUUUUUU

1

2 3

4

Attenuatore(terminatore della

trascrizione)

mRNA

Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi

1 2 3 4 mRNA

peptide leader

AUG UGA

Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l’appaiamento con il segmento 3

3 4

1 2AUG UGA

2 3

La polimerasi continua

2

34

La polimerasi terminala trascrizione

2

34

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi

1 2 3 4 mRNA

peptide leader

AUG UGA

Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento 3

2 3

41AUG UGA

Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica.

Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell’attenuatore.

La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operani insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte.

Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi

Prescott pag. 262

Rbs = “ribosome binding site” (Shine-Dalgarno) 5’-AGGAGG-3’

Regolazione traduzionale

Operone per le tossine batteriche

Due geni di un singolo operone possono essere tradotti in quantità diverse

La proteina A entra nella cellula e provoca il dannoLa proteina B si lega al bersaglio (cellula umana)

Regolazione post-trascrizionale mediante RNA antisenso

L’RNA antisenso ha una sequenza complementare a una molecola di mRNA.

Il legame dell’RNA antisenso può bloccare la traduzione dell’ mRNA.

sok

Sistema host cell killing del plasmide R1

hok mRNA: emivita 20 min

sok mRNA: emivita < 1-2 min

128 bp

SDhok

Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura il mantenimento del plasmide all’interno di una popolazione batterica

OmpR

mRNA per OmpF

EnvZOmpF

sintesi di OmpC

micF RNA174 b

OmpC

La risposta all’osmolarità in E. coli

Regolazione post-traduzionale

Un enzima della catena può legare il prodotto finale che funziona da inibitore

Se il prodotto finale viene sintetizzato in eccesso o se diventa disponibile nell’ambiente, non è più conveniente per il batterio continuare a sintetizzarlo

Controllo tipico della via biosintetica degli amminoacidi

modificazione allosterica

Questo tipo di controllo è anche definito inibizione a feedback