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CORSO INTEGRATO DI
GENETICA
a.a. 2010-2011
04/11/2010
Lezioni 27_28
Analisi di linkage
Analisi di mutazioni
Dott.ssa Elisabetta Trabetti
LINKAGELINKAGE
Tendenza di loci (geni e/o marcatori) vicini su un singolo cromosoma ad essere
trasmessi assieme, come una unità, attraverso la meiosi
Geni in loci vicini sullo stesso cromosoma - concatenati
● Mappaggio di geni malattia e di nuovimarcatori
● Diagnosi indiretta di malattia - Deveessere nota la localizzazionecromosomica del gene
ANALISI di LINKAGE:ANALISI di LINKAGE:applicazioniapplicazioni
Meiosi informative e non
Meiosi informative = individuare i gameti ricombinanti e non
AD
Locus marcatore AAlleli 1 e 2
50% ricombinazione Assortimento indipendente:
gene malattia NON è in linkage con il marcatore
Determinazione della fase
Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia
Frazione di ricombinazione, θ
n°meiosi ricombinanti n° soggetti ricombinanti
n° tot meiosi n°tot figli
θ =
θ = 0 loci molto viciniθ = 0,5 loci molto lontani o su cromosomi diversi
θ = misura della distanza geneticaU di misura: centimorgan cM
= lunghezza genetica in cui 1% di ricombinazione (θ =0,01)
NB: distanza genetica non è strettamente proporzionale alla distanza fisica (lunghezza in nucleotidi)
Probabilità che avvenga un evento di ricombinazionetra due loci
θ = n. figli ricombinanti/n. tot figli
= 1/8 = 0,125 = 12,5%
Distanza A-B = 12,5 cM
MISURA DELLA DISTANZA GENETICA
Frazione di ricombinazione tra i loci:
A e B = 0,06
B e C = 0,07
A e C = 0,10
Frazione di ricombinazione tra i loci:
A e D = 0,04
D e B = 0,08
COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE
Ordine 3 loci sul chr
(A) Distinguere i due cromosomi omologhi dei genitori – marcatore linked
(B) Determinare la fase = cromosoma con allele patologico
(C) Quale cromosoma e’ stato trasmesso al probando
REQUISITIREQUISITI
Famiglie (numerose)
Affetti
Marcatori geneticialtamente polimorfi
uniformemente distribuitifacile individuazione e basso costo
● Mappaggio di geni malattia e di nuovimarcatori
● Diagnosi indiretta di malattia - Deveessere nota la localizzazionecromosomica del gene
ANALISI di LINKAGE:ANALISI di LINKAGE:applicazioniapplicazioni
Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR
Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR
Famiglia non informativa
Famiglia parzialmente informativa
Famiglia pienamente informativa
1/2 1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/1
1/1
2/2
Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage
Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage
MWM P M CF V C+
MetH: extragenico, ∼1Mb
1-2 1-1
1-1 1-2
1-2 1-1 1-1 1-2 2-2
allele 2 pallele 1 m: ?
• portatore (CF carrier)o
• sano
?
Diagnosi prenatale CFDiagnosi prenatale CF
MWM P M CF V C+
Xv-2c: extragenico, ∼200 kb
1-2 1-2
1-2 1-1
1-2 1-2 1-2 1-1 2-2
allele 1 pallele 1 m ?
Figlio affetto:
1*p e 2*m
oppure
1*m e 2*p
Feto:
1*p e 1 m
oppure
1*m e 1p
in entrambi i casi èPORTATORE
Diagnosi prenatale CFDiagnosi prenatale CF
1*-2 1-1*
1*-1* 1*-2• sano o portatore
1-2* 1*-2
1*-2* 1-1*• portatore
MetH: sano o carrierXv-2c: carrier Feto: carrier m causa CFFeto: carrier m causa CF
Fattori che determinanol’accuratezza diagnostica nella analisi
di linkage
Fattori che determinanol’accuratezza diagnostica nella analisi
di linkage
� Vicinanza del marcatore al gene – frequenza di ricombinazioneFC: KM19 <<0.01, MetH e J3.11 =0.01DMD marcatori intragenici: 0.05
� Errori da non paternità biologica
� Errori di laboratorio
� Nuove mutazioni
� Eterogeneità genetica
Analisi di linkage e studio degli aplotipi
Aplotipo = serie di alleli in loci associati su un cromosoma (pat o mat)
LINKAGE disequilibriumLINKAGE disequilibrium
Specifica combinazione di alleli in fase a due o piu’loci linked che si verifica più spesso di quanto accadrebbe per puro caso
Associazione a livello di popolazione tra un particolare
allele marcatore e una malattia
In una popolazione molte persone non imparentate
hanno ereditato un cromosoma con una patologia da un antenato comune
25%
25%
25%
25%
40%
10%
10%
40%
50%
0%
0%
50%
Locus A Locus B
Linkageequilibrium
Linkagedisequilibrium
parziale
Linkagedisequilibriumcompleto
GENETICA MOLECOLARE IN
MEDICINA
SVILUPPI SCIENTIFICI APPLICAZIONI MEDICHE
Mappatura gene Diagnosi indiretta
(linkage)�
Identificazione gene Identificazione mutazioni
Classificazione mutazioni Diagnosi diretta
patologiche (mutazione)�
� Mutazione = variazione della sequenza nucleotidica
rispetto ad una sequenza di riferimento -> alterazioneereditabile a carico della struttura primaria del DNA
senza alcuna implicazione sul significato funzionale di
tale cambiamento
• Effetti evolutivi = neutra, vantaggiosa, svantaggiosa
• Mutazione Patologica = produce una consistente
alterazione della funzione svolta da un gene,
determinando così l’insorgenza di una malattia
� Polimorfismo = mutazione con frequenza >1% nellapopolazione
Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche
� Identificare e sequenziare il gene malattia
� Cercare le mutazioni nel gene� Stabilire quali mutazioni sono patologiche
� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
� Disegnare pannelli popolazione specifici
� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse
Metodi per l’identificazione di
mutazioni
• Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota
• METODI: Sequenziamento del DNA, DGGE, DHPLC, etc.
Il DNA può essereottenuto da qualsiasi
cellula nucleatadell'organismo
DNA
SANGUEVILLI
CORIALI
AMNIOCITI
SALIVA
CAPELLI
ALTRI
TESSUTIMIDOLLO
OSSEO
COLTURE
CELLULARI
Fonti DNA
DNA stampo
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Taq polymerase, Mg++
Nuovo filamento
DNA polimerasi
DNA stampo
Nuovo filamento
Primer
PCR – Reazione a Catena della Polimerasi
Primer
Sequenza Normale
(esone 12, gene CFTR) �
1885 G>T; GAA>TAA
Glu > Stop
�Mutazione: E585X
Analisi della sequenza del DNA
Analisi con gradiente denaturante
(DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
MOLECOLE
OMODUPLICI
MOLECOLE
ETERODUPLICI
A
C
G
C
AT
G
T
ALLELE NORMALE ALLELE MUTATO
G
C
A
T
Denaturazione, mix,
rinaturazione
OMODUPLICI
ETERODUPLICI
1 2 3
GEL A GRADIENTE DENATURANTE
N/N N/M M/M
Con
cen
trazio
ne
cresc
ente
di
den
atu
ran
ti
La Temperatura di melting (Tm) di una molecola di
DNA dipendente strettamente dalla sua sequenza.
Frammenti di DNA che differiscono anche per un
singolo nucleotide hanno diversa Tm.
Negli eterozigoti possono formarsi molecole ibride,
costituite dall’unione di un filamento normale e da
un filamento mutato, che hanno Tm più bassa per la
presenza dell’appaiamento errato nel sito della
mutazione.
L’elettroforesi in gradiente denaturante separa le
molecole di DNA in funzione della diversa Tm.
E’così possibile identificare DNA normali e
mutati perchè si arresteranno ad una diversa
altezza nel gel.
Analisi DGGE dell’esone 19 del gene CFTR
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Corsie 1 , 2, 4, 8, 9: DNA che non presentano mutazioni in questo esone
Corsie 3, 5, 7: DNA con mutazioni in questo esone (da caratterizzare con sequenziamento)�
Corsia 6: controllo positivo (eterozigote I1237V)
- omodupliciMutato
Normale
eteroduplici
Ricerca di mutazioni con DHPLC
eteroduplici omoduplici
eteroduplici
omoduplici
WT M
DenaturingHighPerformanceLiquideChromatography
Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche
� Identificare e sequenziare il gene malattia
� Cercare le mutazioni nel gene
� Stabilire quali mutazioni sono patologiche
� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
� Disegnare pannelli popolazione specifici
� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse
Principali criteri per classificare una
mutazione come causa di malattia:
� Correlazione con il fenotipo: la mutazione è presente
negli affetti, molto rara o assente nella popolazione
generale
� Studi funzionali, in-vitro o in-vivo, dimostrano che la mutazione causa alterazione o assenza della funzione
codificata dal gene
� La mutazione causa una grave alterazione della struttura proteica (delezioni, inserzioni, stop, frameshift,
alterazioni di splicing…) �
Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche
� Identificare e sequenziare il gene malattia
� Cercare le mutazioni nel gene
� Identificare quali mutazioni sono patologiche
� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
� Disegnare pannelli di mutazioni popolazione-specifici
� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di
interesse
Analisi della frequenza e della
distribuzione geografica delle mutazioni
� Ricerca aspecifica delle mutazioni nei geni di almeno 100-
200 pazienti
� Analisi di pazienti appartenenti a popolazioni/gruppi etnici
diversi
� Selezionare le mutazioni causa di malattia tra tutte quelle
identificate
� Stabilire il pannello di mutazioni da analizzare in modo da
coprire la maggior percentuale possibile di alleli patologici
in ogni popolazione/gruppo etnico
90203/22594146/156TOT
48
10
-
9
3
4
-
3
3
10
107
22
-
21
6
9
-
6
5
27
52
-
13
6
6
3
2
-
1
11
81
-
20
9
9
5
3
-
1
18
F508del
R1162X
T338I
G542X
2183AA/G
N1303K
G1244E
711+5G/A
1717-1G/A
altre
Veneto
n %
Sardegna
n. %
Mutazione
Pannello Mutazioni CF per Veneto e Sardegna:
Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche
� Identificare e sequenziare il gene malattia
� Cercare le mutazioni nel gene
� Identificare quali mutazioni sono patologiche
� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni
� Disegnare pannelli popolazione specifici
� Selezionare i metodi di analisi piùadatti alla ricerca delle mutazioni di interesse
Metodi per l’identificazione di
mutazioni:
• Analisi specifica di una
mutazione nota
• METODI: RE; RDB/ASO; OLA.
REVERSE DOT BLOT:
ibridazione inversa degli acidi nucleici
MN
DNA N (normale)�
DNA M (mutato)�
t
G
c
a
T
g
a
C
g
t
A
c
omozigote
MM
omozigote
NN
eterozigote
NM
1
sonda sonda
N M
3
sonda sonda
N M
2
sonda sonda
N M
1 2 3 4
sonde
mutate
sonde
normali
RDB MULTIPLOanalisi mutazioni Fibrosi Cistica (gene CFTR) �
STRIP A STRIP B
sonde
mutate
sonde
normali
F508del
eteroz.
G542X
R117H
394delTT
S1251N
Normale
Metodi per l’identificazione di mutazioni:
Applicazioni possibili• 1) Ricerca diretta di mutazioni:
• 1a) Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota:
• significato funzionale non necessariamente noto -> identificazione nuove mutazioni, screening genetici di popolazioninumerose, (diagnosi di malattia).
•
• 1b) Analisi specifica di una mutazione nota:
• mutazioni patologiche -> diagnosi di malattia;
• polimorfismi, marcatori DNA -> identificazione individuale
(medicina forense, trapianti midollo, …)�
• 2) Analisi di Linkage:
• identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia
Metodi per la diagnosi di malattie genetiche mediante
analisi del DNA
� a) Analisi di mutazioni note nel soggetto (RE; RDB/ASO; OLA):− Analisi diretta/specifica delle mutazioni
− Deve essere nota la sequenza del gene
− Devono essere nota l’alterazione molecolare delle mutazioni da analizzare
− Deve essere noto quali mutazioni geniche sono causa di malattia
− Caratteristiche di un buon sistema di analisi: rapido, economico, multiplo
� b) Ricerca di mutazioni in un gene (Sequenziamento del DNA,
DGGE, DHPLC):− Deve essere nota la sequenza del gene
− Identifica sia mutazioni nuove che note; patologiche che non patologiche
− Solo il sequenziamento consente di caratterizzare il difetto molecolare
− Consentono analisi più rapida di un gene quando si hanno molti individui in esame
− Screening di popolazione: identifica quali e quante mutazioni sono presenti
c) Analisi di Linkage− Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene
− Deve essere disponibile la famiglia del probando e il DNA di almeno un familiare prossimo
che sia affetto
− Devono essere disponibili marcatori informativi molto vicini al gene interessato
Perchè la diagnosi molecolare?
• Diagnosi di una malattia è un atto clinico
• Analisi mutazioni serve a:
• Confermare diagnosi clinica
• Determinare le mutazioni specifiche per successive analisi nei familiari
– Diagnosi Pre-Natale
– Identificazione dei portatori
• Migliorare conoscenze rapporto genotipo/fenotipoe pato-fisiologia della malattia