CORSO INTEGRATO DI

GENETICA

a.a. 2010-2011

04/11/2010

Lezioni 27_28

Analisi di linkage

Analisi di mutazioni

Dott.ssa Elisabetta Trabetti

LINKAGELINKAGE

Tendenza di loci (geni e/o marcatori) vicini su un singolo cromosoma ad essere

trasmessi assieme, come una unità, attraverso la meiosi

Geni in loci vicini sullo stesso cromosoma - concatenati

[Genetica - B.A. Pierce. Zanichelli 2005]

● Mappaggio di geni malattia e di nuovimarcatori

● Diagnosi indiretta di malattia - Deveessere nota la localizzazionecromosomica del gene

ANALISI di LINKAGE:ANALISI di LINKAGE:applicazioniapplicazioni

LINKAGE - ricombinazione

21

2

22

2 22

2

2

1

1

1 1

MP

F1 F2 F3

Meiosi informative e non

Meiosi informative = individuare i gameti ricombinanti e non

AD

Locus marcatore AAlleli 1 e 2

50% ricombinazione Assortimento indipendente:

gene malattia NON è in linkage con il marcatore

Determinazione della fase

Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia

Frazione di ricombinazione, θ

n°meiosi ricombinanti n° soggetti ricombinanti

n° tot meiosi n°tot figli

θ =

θ = 0 loci molto viciniθ = 0,5 loci molto lontani o su cromosomi diversi

θ = misura della distanza geneticaU di misura: centimorgan cM

= lunghezza genetica in cui 1% di ricombinazione (θ =0,01)

NB: distanza genetica non è strettamente proporzionale alla distanza fisica (lunghezza in nucleotidi)

Probabilità che avvenga un evento di ricombinazionetra due loci

θ = n. figli ricombinanti/n. tot figli

= 1/8 = 0,125 = 12,5%

Distanza A-B = 12,5 cM

MISURA DELLA DISTANZA GENETICA

Frazione di ricombinazione tra i loci:

A e B = 0,06

B e C = 0,07

A e C = 0,10

Frazione di ricombinazione tra i loci:

A e D = 0,04

D e B = 0,08

COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE

Ordine 3 loci sul chr

MAPPA GENETICA DEL CROMOSOMA 22

(A) Distinguere i due cromosomi omologhi dei genitori – marcatore linked

(B) Determinare la fase = cromosoma con allele patologico

(C) Quale cromosoma e’ stato trasmesso al probando

REQUISITIREQUISITI

Famiglie (numerose)

Affetti

Marcatori geneticialtamente polimorfi

uniformemente distribuitifacile individuazione e basso costo

● Mappaggio di geni malattia e di nuovimarcatori

● Diagnosi indiretta di malattia - Deveessere nota la localizzazionecromosomica del gene

ANALISI di LINKAGE:ANALISI di LINKAGE:applicazioniapplicazioni

Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR

Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR

Famiglia non informativa

Famiglia parzialmente informativa

Famiglia pienamente informativa

1/2 1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/1

1/1

2/2

Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage

Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage

MWM P M CF V C+

MetH: extragenico, ∼1Mb

1-2 1-1

1-1 1-2

1-2 1-1 1-1 1-2 2-2

allele 2 pallele 1 m: ?

• portatore (CF carrier)o

• sano

?

Diagnosi prenatale CFDiagnosi prenatale CF

MWM P M CF V C+

Xv-2c: extragenico, ∼200 kb

1-2 1-2

1-2 1-1

1-2 1-2 1-2 1-1 2-2

allele 1 pallele 1 m ?

Figlio affetto:

1*p e 2*m

oppure

1*m e 2*p

Feto:

1*p e 1 m

oppure

1*m e 1p

in entrambi i casi èPORTATORE

Diagnosi prenatale CFDiagnosi prenatale CF

1*-2 1-1*

1*-1* 1*-2• sano o portatore

1-2* 1*-2

1*-2* 1-1*• portatore

MetH: sano o carrierXv-2c: carrier Feto: carrier m causa CFFeto: carrier m causa CF

Fattori che determinanol’accuratezza diagnostica nella analisi

di linkage

Fattori che determinanol’accuratezza diagnostica nella analisi

di linkage

� Vicinanza del marcatore al gene – frequenza di ricombinazioneFC: KM19 <<0.01, MetH e J3.11 =0.01DMD marcatori intragenici: 0.05

� Errori da non paternità biologica

� Errori di laboratorio

� Nuove mutazioni

� Eterogeneità genetica

Analisi di linkage e studio degli aplotipi

Aplotipo = serie di alleli in loci associati su un cromosoma (pat o mat)

LINKAGE disequilibriumLINKAGE disequilibrium

Specifica combinazione di alleli in fase a due o piu’loci linked che si verifica più spesso di quanto accadrebbe per puro caso

Associazione a livello di popolazione tra un particolare

allele marcatore e una malattia

In una popolazione molte persone non imparentate

hanno ereditato un cromosoma con una patologia da un antenato comune

LINKAGE

M1

M1

M1

M1

M2

M2

M2

M2

LINKAGEDISEQUILIBRIUM

M3

M3

M3

M3

M3

M3

M3

M3

Locus “A”alleli 1 e 2

25%

25%

25%

25%

40%

10%

10%

40%

50%

0%

0%

50%

Locus A Locus B

Linkageequilibrium

Linkagedisequilibrium

parziale

Linkagedisequilibriumcompleto

Linkage disequilibrium e FC

GENETICA MOLECOLARE IN

MEDICINA

SVILUPPI SCIENTIFICI APPLICAZIONI MEDICHE

Mappatura gene Diagnosi indiretta

(linkage)�

Identificazione gene Identificazione mutazioni

Classificazione mutazioni Diagnosi diretta

patologiche (mutazione)�

� Mutazione = variazione della sequenza nucleotidica

rispetto ad una sequenza di riferimento -> alterazioneereditabile a carico della struttura primaria del DNA

senza alcuna implicazione sul significato funzionale di

tale cambiamento

• Effetti evolutivi = neutra, vantaggiosa, svantaggiosa

• Mutazione Patologica = produce una consistente

alterazione della funzione svolta da un gene,

determinando così l’insorgenza di una malattia

� Polimorfismo = mutazione con frequenza >1% nellapopolazione

Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche

� Identificare e sequenziare il gene malattia

� Cercare le mutazioni nel gene� Stabilire quali mutazioni sono patologiche

� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni

� Disegnare pannelli popolazione specifici

� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di

interesse

Metodi per l’identificazione di

mutazioni

• Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota

• METODI: Sequenziamento del DNA, DGGE, DHPLC, etc.

Il DNA può essereottenuto da qualsiasi

cellula nucleatadell'organismo

DNA

SANGUEVILLI

CORIALI

AMNIOCITI

SALIVA

CAPELLI

ALTRI

TESSUTIMIDOLLO

OSSEO

COLTURE

CELLULARI

Fonti DNA

DNA stampo

dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Taq polymerase, Mg++

Nuovo filamento

DNA polimerasi

DNA stampo

Nuovo filamento

Primer

PCR – Reazione a Catena della Polimerasi

Primer

Sequenza Normale

(esone 12, gene CFTR) �

1885 G>T; GAA>TAA

Glu > Stop

�Mutazione: E585X

Analisi della sequenza del DNA

Analisi con gradiente denaturante

(DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

MOLECOLE

OMODUPLICI

MOLECOLE

ETERODUPLICI

A

C

G

C

AT

G

T

ALLELE NORMALE ALLELE MUTATO

G

C

A

T

Denaturazione, mix,

rinaturazione

OMODUPLICI

ETERODUPLICI

1 2 3

GEL A GRADIENTE DENATURANTE

N/N N/M M/M

Con

cen

trazio

ne

cresc

ente

di

den

atu

ran

ti

La Temperatura di melting (Tm) di una molecola di

DNA dipendente strettamente dalla sua sequenza.

Frammenti di DNA che differiscono anche per un

singolo nucleotide hanno diversa Tm.

Negli eterozigoti possono formarsi molecole ibride,

costituite dall’unione di un filamento normale e da

un filamento mutato, che hanno Tm più bassa per la

presenza dell’appaiamento errato nel sito della

mutazione.

L’elettroforesi in gradiente denaturante separa le

molecole di DNA in funzione della diversa Tm.

E’così possibile identificare DNA normali e

mutati perchè si arresteranno ad una diversa

altezza nel gel.

Analisi DGGE dell’esone 19 del gene CFTR

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Corsie 1 , 2, 4, 8, 9: DNA che non presentano mutazioni in questo esone

Corsie 3, 5, 7: DNA con mutazioni in questo esone (da caratterizzare con sequenziamento)�

Corsia 6: controllo positivo (eterozigote I1237V)

- omodupliciMutato

Normale

eteroduplici

Ricerca di mutazioni con DHPLC

eteroduplici omoduplici

eteroduplici

omoduplici

WT M

DenaturingHighPerformanceLiquideChromatography

Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche

� Identificare e sequenziare il gene malattia

� Cercare le mutazioni nel gene

� Stabilire quali mutazioni sono patologiche

� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni

� Disegnare pannelli popolazione specifici

� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di

interesse

Principali criteri per classificare una

mutazione come causa di malattia:

� Correlazione con il fenotipo: la mutazione è presente

negli affetti, molto rara o assente nella popolazione

generale

� Studi funzionali, in-vitro o in-vivo, dimostrano che la mutazione causa alterazione o assenza della funzione

codificata dal gene

� La mutazione causa una grave alterazione della struttura proteica (delezioni, inserzioni, stop, frameshift,

alterazioni di splicing…) �

Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche

� Identificare e sequenziare il gene malattia

� Cercare le mutazioni nel gene

� Identificare quali mutazioni sono patologiche

� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni

� Disegnare pannelli di mutazioni popolazione-specifici

� Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di

interesse

Analisi della frequenza e della

distribuzione geografica delle mutazioni

� Ricerca aspecifica delle mutazioni nei geni di almeno 100-

200 pazienti

� Analisi di pazienti appartenenti a popolazioni/gruppi etnici

diversi

� Selezionare le mutazioni causa di malattia tra tutte quelle

identificate

� Stabilire il pannello di mutazioni da analizzare in modo da

coprire la maggior percentuale possibile di alleli patologici

in ogni popolazione/gruppo etnico

90203/22594146/156TOT

48

10

-

9

3

4

-

3

3

10

107

22

-

21

6

9

-

6

5

27

52

-

13

6

6

3

2

-

1

11

81

-

20

9

9

5

3

-

1

18

F508del

R1162X

T338I

G542X

2183AA/G

N1303K

G1244E

711+5G/A

1717-1G/A

altre

Veneto

n %

Sardegna

n. %

Mutazione

Pannello Mutazioni CF per Veneto e Sardegna:

Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche

� Identificare e sequenziare il gene malattia

� Cercare le mutazioni nel gene

� Identificare quali mutazioni sono patologiche

� Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni

� Disegnare pannelli popolazione specifici

� Selezionare i metodi di analisi piùadatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

Metodi per l’identificazione di

mutazioni:

• Analisi specifica di una

mutazione nota

• METODI: RE; RDB/ASO; OLA.

REVERSE DOT BLOT:

ibridazione inversa degli acidi nucleici

MN

DNA N (normale)�

DNA M (mutato)�

t

G

c

a

T

g

a

C

g

t

A

c

omozigote

MM

omozigote

NN

eterozigote

NM

1

sonda sonda

N M

3

sonda sonda

N M

2

sonda sonda

N M

1 2 3 4

sonde

mutate

sonde

normali

RDB MULTIPLOanalisi mutazioni Fibrosi Cistica (gene CFTR) �

STRIP A STRIP B

sonde

mutate

sonde

normali

F508del

eteroz.

G542X

R117H

394delTT

S1251N

Normale

Metodi per l’identificazione di mutazioni:

Applicazioni possibili• 1) Ricerca diretta di mutazioni:

• 1a) Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota:

• significato funzionale non necessariamente noto -> identificazione nuove mutazioni, screening genetici di popolazioninumerose, (diagnosi di malattia).

•

• 1b) Analisi specifica di una mutazione nota:

• mutazioni patologiche -> diagnosi di malattia;

• polimorfismi, marcatori DNA -> identificazione individuale

(medicina forense, trapianti midollo, …)�

• 2) Analisi di Linkage:

• identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia

Metodi per la diagnosi di malattie genetiche mediante

analisi del DNA

� a) Analisi di mutazioni note nel soggetto (RE; RDB/ASO; OLA):− Analisi diretta/specifica delle mutazioni

− Deve essere nota la sequenza del gene

− Devono essere nota l’alterazione molecolare delle mutazioni da analizzare

− Deve essere noto quali mutazioni geniche sono causa di malattia

− Caratteristiche di un buon sistema di analisi: rapido, economico, multiplo

� b) Ricerca di mutazioni in un gene (Sequenziamento del DNA,

DGGE, DHPLC):− Deve essere nota la sequenza del gene

− Identifica sia mutazioni nuove che note; patologiche che non patologiche

− Solo il sequenziamento consente di caratterizzare il difetto molecolare

− Consentono analisi più rapida di un gene quando si hanno molti individui in esame

− Screening di popolazione: identifica quali e quante mutazioni sono presenti

c) Analisi di Linkage− Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene

− Deve essere disponibile la famiglia del probando e il DNA di almeno un familiare prossimo

che sia affetto

− Devono essere disponibili marcatori informativi molto vicini al gene interessato

Perchè la diagnosi molecolare?

• Diagnosi di una malattia è un atto clinico

• Analisi mutazioni serve a:

• Confermare diagnosi clinica

• Determinare le mutazioni specifiche per successive analisi nei familiari

– Diagnosi Pre-Natale

– Identificazione dei portatori

• Migliorare conoscenze rapporto genotipo/fenotipoe pato-fisiologia della malattia