Corso di

INGEGNERIA

SANITARIA

Prof. Paola

Foladori

Lezione 5.

Fondamenti per l’analisi

sanitaria-ambientale

Microrganismi e reazioni

biochimiche

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Microrganismi nei sistemi ambientali: i batteri (procarioti) sono gli organismi più rilevanti nell’ingegneria sanitaria-ambientale

Distinzione per categorie funzionali più che per classificazione tassonomica (es. si indica il gruppo di batteri che fanno la nitrificazione anziché il nome della specie )

Quali sono gli organismi o i microrganismi più rile vanti?

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Caratteristiche dei batteri (Dominio Prokaryota)

� Breve ciclo di duplicazione cellulare, poche ore (elevata capacità di adattamento in seguito a mutazioni genetiche)

� In base alla fonte di carbonio utilizzata dai batteri si distinguono:- Autotrofi : possono utilizzare carbonio inorganico (C��, HC��

�, C����)

- Eterotrofi : necessitano di carbonio organico

� In funzione della presenza di ossigeno si distinguono: - aerobici : in presenza di O2

- anossici : in assenza di O2 , ma in presenza di sostituti dell’O2 come NO3

- anaerobic i: in assenza di O2 e sostituti.

� Ampio range di T°- psicrofili: temperatura ambiente - mesofili: 30-35°C - termofili: 50-55°C

Come si quantificano i batteri nelle matrici ambientali ??Es. nell’acqua potabile, nei corpi idrici, effluenti depuratori, etc…

� Conteggio su piastra : si basa sul presupposto che ogni cellula batterica cresca e formi una colonia visibile e contabile. Risultato espresso in UFC/Volume (UFC= Unità Formanti Colonie) o CFU in inglese (Colony FormingUnits). Porta spesso a sottostime

� Conteggio tramite tubi multipli : stima su base statistica del numero di batteri che si ipotizzano distribuiti casualmente in un campione, suddiviso in diluizioni successive. Espresso in MPN/Volume (MPN= MostProbable Number)

� Conta diretta in seguito ad aggiunta di fluorocromi specifici che marcano il DNA, non è richiesta crescita dei batteri, si possono osservare e contare al microscopio

� Metodi molecolari di nuova generazione: immunofluorescenza, riconoscimento di sequenze specifiche di DNA o RNA

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Molte specie batteriche che si sviluppano nell’ambiente non

sono coltivabili in laboratorio a causa delle condizioni molto più

specifiche e particolari (impossibile replicare in laboratorio la

varietà delle condizioni e dei fattori ambientali)

Formula empiricaper rappresentare la composizione elementare dei batteri

La parte “secca” della cellula può essererappresentata con la seguente formula sintetica:

C5H7O2N

What are cells made of?

Component % wt mol. wt # per cel l # of kindsH2O 70 18 4 x 1010 1Inorg. ions 1 40 2.5 x 10 8 20Carbohydrates 3 150 2 x 10 8 200Amino acids 0.4 120 3 x 10 7 100Nucleotides 0.4 300 1.2 x 10 7 200Lipids 2 750 2.5 x 10 7 50Other small mol.0.2 150 1.5 x 10 7 200Proteins 15 40,000 106 2-3000DNA 1 2,500,000,000 4 1RNA: 6

rRNA 0.5-1,000,000 6 x 104 2tRNA 25,000 4 x 105 40mRNA 1,000,000 103 1000

What are cells made of?

J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, Table 3.3, 1970https://muele.mak.ac.ug/course/view.php?id=1914

Macroelementi

C Organic compounds, CO2(sugars, fats, proteins)

O O2, H2O, organic cmpds, CO2Main cell constituents

H H2, H2O, organic cmpds

N NH4, NO2, N2, proteins

S SO2-, HS-, S, S2O32-, proteins In Cys, Met, T, biotin

organic sulfur compounds CoA

P HPO42- In nucleic acids &

phospholipids

Element Source Function

Table based on G. Gottschalk, Bacterial Metabolism, 2nd Ed., p.2-3, 1986https://muele.mak.ac.ug/course/view.php?id=1914

K K+ Primary inorganic cation,Required in a variety of enzymes.

Mg Mg 2+ Required in a variety of enzymes.Stabilizes cell walls, membranes, ribosomes

Ca Ca2+ in exoenzymes and cell walls,important in spores (heat stability)

Fe Fe2+, Fe3+ In cytochromes, ferredoxins,Iron-sulfur proteins, cofactorof some enzymes

Na Na+ Required by some but not all organisms

Cl Cl - Important cellular anion

Element Source FunctionMajor Inorganic Elements

https://muele.mak.ac.ug/course/view.php?id=1914

Minor ElementsElement Source Function

Zn Zn2+ Alcohol dehydrogenase, alkaline phosphotase, aldolase, RNA and DNA polymerase

Mn Mn2+ Superoxide dismutase, photosystem II, cofactor of PEP carboxykinase

Mo MoO 42- Nitrate reductase, nitrogenase, xanthine

dehydrogenase, formate dehydrogenase

Se SeO32- Glycine reductase, formate

dehydrogenase

Co Co2+ Coenzyme B 12 enzymes

Cu Cu2+ Cytochrome oxidase, nitrite reductase,

Ni Ni 2+ Urease, hydrogenase, factor F 430

W WO42- Some formate dehydrogenases

https://muele.mak.ac.ug/course/view.php?id=1914

Come ricavano energia i batteri?Reazioni enzimatiche

- Gli enzimi fungono da catalizzatori e abbassano l’energia di attivazione richiesta da una reazione chimica per il suo svolgimento

- In altre parole forniscono un percorso di reazione alternativo che richiede meno energia

- Gli enzimi non possono alterare l’equilibrio della reazione, ma possono aumentare la velocità per il raggiungimento dell’equilibrio.

Andamento dell'energia associata ad una reazione del !po: X + Y → Z

non catalizzata (in nero) e catalizzata (in rosso).

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Reazioni enzimatiche – cinetica di Michaelis-Menten

Una delle modellizzazioni più frequenti per lo studio dellle reazioni enzimatiche è stata proposta nel 1913 da Leonor Michaelis e Maud Menten.

Quando il substrato S si lega al sito attivo dell’enzima E, si forma il complesso ES. Durante lo stato di transizione il substrato viene trasformato in un prodotto (EP) che dopo poco tempo si separa dall’enzima (E+P):

� + → � → � + � k1

← k2

k3

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Reazioni enzimatiche – cinetica di Michaelis-Menten

In questa equazione:k1 = costante di velocità di formazione di ESk2 = costante di velocità di dissociazione di ESk3 = costante di velocità di formazione e rilascio del prodotto

Il modello di Michaelis-Menten assume che: - k2 sia trascurabile rispetto a k1- la velocità di formazione di ES è uguale alla velocità di scomparsa di ES ( corrisponde

allo stato stazionario). Questo concetto corrisponde alla uguaglianza:

� + → � → � + � k1

← k2

k3

[ES]=[E][S]

(k2 + k3)/k1

k1 [E][S] = (k2 + k3)[ES]

Si introduce una nuova costante, chiamata costante di Michaelis, pari a:

Km= (k2 + k3)/k1 12

Reazioni enzimatiche – cinetica di Michaelis-Menten

Si indica con [Et] la concentrazione totale di enzima

[ES]=([Et]− [ES]) [S]

Km

[Et] = [E] + [ES]

Da cui:

[E] = [Et] − [ES]

Sostituendo nella precedente:

[ES]=[Et] [S]

Km+ [S]

Da cui:

Considerando la velocità della reazione: v =��

dt= �3 [�]

Sostituendo la precedente si trova: v = �3

[Et] [S]

Km+ [S]

E infine v =����

[S]

Km+ [S]In cui vmax = k3 [Et]

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E’ nota come equazione di Michaelis-Mentenv =����

[S]

Km+ [S]Quando [S] = Km la velocità è pari alla metà della velocità massimaKm è un valore tipico per ogni enzima e substrato e esprime anche l’affinità tra l’enzima e il substrato.Se km è piccolo si ha elevata affinità tra enzima e substrato.

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ZONA PIU’ FREQUENTE PER LE CINETICHE

BATTERICHE NEGLI IMPIANTI. LE

CINETICHE SONO SEMPRE LIMITATE

LA RIPRODUZIONE BATTERICA

Il meccanismo fondamentale per la riproduzione dei batteri è la scissione binaria

Rimozione del substrato da parte dei microrganismi nelle reazioni di ossido-riduzione

crescita della biomassa batterica con sintesi di nuove cellule

dopo 10 ore il numero di cellule raggiungerebbeil numero di 2x1019

cellule

Questo rapido cambiamento nella biomassa è solo ipotetico

Nella realtà esistono sempre delle limitazioni ambientali, come la carenza di

substrato o di nutrienti, che determinano un notevole rallentamento del

processo di duplicazione batterica. LE CINETICHE SONO SEMPRE LIMITATE

Curiosità

- Il metabolismo è la somma di tutte le reazioni enzi matiche che avvengono nella cellula

- Il metabollsmo si divide in anabolismo e catabolismo

1. Metabolismo aerobico eterotrofo

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Metabolismo

batterico impiegato

in gran parte dei

processi aerobici,

cioè che si svolgono

in presenza di

ossigeno (fiumi,

laghi, depuratori,

compostaggio)

Come ricavano energia i batteri?Metabolismo

3. Metabolismo anaerobico eterotrofo

2. Metabolismo aerobico autotrofo

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Metabolismo

batterico impiegato

nella nitrificazione

(fiumi, depurazione)

Metabolismo

batterico impiegato

nella digestione

anaerobica per

produzione biogas