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TEORIA DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE25
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Componenti degli strumenti per spettroscopia ottica
sorgente stabile di energia radianteselettore di lunghezze d’onda che isola una regione limitata
dello spettro per la misurauno o più contenitori per il campioneun rivelatore di radiazione che converte l’energia radiante in
un segnale misurabile (generalmente di natura elettrica)un processore ed un registratore del segnale che mostra il
segnale trasdotto su una scala metrica, un oscilloscopio, un display digitale o la carta di un registratore
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Sorgenti di radiazione
Per essere adatta a studi spettroscopici, una sorgente devegenerare radiazioni di potenza sufficiente ad essere facilmenterilevabile e misurabile; la sua potenza in uscita altresì deveessere stabile per periodi ragionevoli.Esistono due tipi di sorgenti spettroscopiche:
sorgenti continue
sorgenti a righe
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Sorgenti continue di radiazione visibile
Le lampade tungsteno/alogene stanno incontrandoun’applicazione sempre crescente nei moderni strumentispettroscopici per via del loro esteso intervallo di lunghezzad’onda (240-2500 nm), della maggiore sensibilità e della vita più lunga.
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Sorgenti continue di radiazione ultravioletta
Le lampade al deuterio (e anche ad idrogeno) sono usate per fornire radiazione continua nell’intervallo da 160 a 380 nm e sono le sorgenti più comuni per la spettroscopia ultravioletta.
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Sorgenti continue di radiazione infrarossa
La sorgente Globar consiste di una bacchetta (5 per 50 nm) di carburo di silicio. Quando la sorgente èriscaldata a circa 1500°C dal passaggio di elettricitàemette radiazione nella regione da 1 a 40 μm.
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La lampada di Nerst è una bacchetta di ossidi di ittrio e dizirconio avente dimensioni tipiche di 2 per 20 mm. Emetteradiazione infrarossa quando riscaldata ad alta temperaturada una corrente elettrica.
Sorgenti continue di radiazione infrarossa
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Sorgenti continue per la spettroscopia ottica
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Selettori di lunghezza d’onda
Gli strumenti spettroscopici sono generalmenteequipaggiati con uno o più dispositivi per limitare la radiazione da misurare a una stretta banda, assorbita o emessa dall’analita.
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Esistono due classi di selettori di lunghezza d’onda:
monocromatori: permettono variazioni della lunghezzad’onda in uscita in un intervallo spettrale considerevole
filtri: offrono il vantaggio della semplicità, robustezza e basso costo
Selettori di lunghezza d’onda
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Monocromatori
I monocromatori sono di due tipi: uno impiega un reticolo per disperdere la radiazione nelle sue lunghezze d’onda competenti, l’altro usa un prisma.
Al momento sono i monocromatori a reticolo quellipreferenzialmente utilizzati.
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Monocromatore a reticolo
Per scopo illustrativo la radiazione è raffigurata da due lunghezze d’onda λ1e λ2 in cui λ1 > λ2. Ruotando il reticolo, sia λ1 che λ2 possono essere focalizzate sulla fenditura di uscita del monocromatore.
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Monocromatore a reticolo a piccoli gradiniI reticoli a riflessione consistono di una superficie piana e riflettentedi alluminio lunga pochi centimetri che presenta un gran numero disolchi paralleli e strettamente spaziati. Per la radiazioneultravioletta/visibile il reticolo deve avere 1200/1400 solchi per mm mentre per quella infrarossa 10/200 per mm.
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Reticoli concavi
I reticoli concavi permettono la progettazione di un monocromatore senzaspecchi o lenti ausiliari di collimazione e focalizzazione poiché la superficie concavanon solo disperde la radiazione ma la focalizza anche sulla fenditura di uscita.
Inoltre la radiazione del numero di superficiottiche aumenta l’energia in uscita daimonocromatori che presentano un reticoloconcavo.
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Reticoli olografici
I reticoli olografici vengono realizzatirivestendo una lastra di vetro piana con un materiale fotosensibile. I fasci provenientida una coppia di laser identici colpiscono la superficie di vetro ricoperta. Le frange diinterferenza risultanti dai due fascisensibilizzano la fotoresistenza causando lo scioglimento di alcune aree e la formazionedi una struttura scanalata.
L’alluminio viene quindi depositato sotto vuoto. Si possono fabbricare reticoli con anche 6000 linee/mm
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Filtri
Il tipo più comune di filtro d’assorbimento è un pezzodi vetro colorato su un supporto. Filtri di questo tipohanno ampiezze di banda effettive da 50 fino a 250 nm ed hanno picchi di trasmittanza più bassi di quellimostrati dai filtri ad interferenza.
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Qui di seguito vengono paragonate le caratteristiche di trasmissione di un filtro di assorbimento e di un filtro ad interferenza.
Filtri
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Rivelatori e trasduttori di radiazioni
Il rivelatore è un dispositivo in grado di indicarel’esistenza di un qualche fenomeno fisico. Anche l’occhio umano può essere considerato un rivelatore: esso converte la radiazione visibile in un segnale elettrico che è trasmesso al cervelloattraverso la catena di neuroni nel nervo ottico.
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Il trasduttore è un tipo speciale di rivelatore checonverte segnali come intensità luminosa, pH, massa e temperatura in segnali elettrici che possonoessere amplificati e convertiti in numeriproporzionali alla grandezza del segnale originale.
Rivelatori e trasduttori di radiazioni
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Trasduttori
E’ essenziale che il segnale elettrico prodotto dal trasduttore siadirettamente proporzionale alla potenza P del raggio:
G = KP + K’
G = risposta elettrica del rivelatore in unità di corrente, resistenza o potenzialeP = potenza del raggioK = costante di proporzionalità che misura la sensibilità in termini dirisposta elettrica per unità di potenza radianteK’ = corrente di fondo (risposta piccola e costante presente anchequando nessuna radiazione colpisce la superficie del trasduttore o rivelatore)
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Trasduttori
Esistono due tipi di trasduttori: un tipo risponde ai fotoni, l’altro al calore.
I rivelatori fotonici si basano sull’interazione dellaradiazione con una superficie radioattiva per produrreelettroni (fotoemissione) o per promuovere elettroni a stati dienergia in cui essi conducono elettricità (fotoconduzione). Solo le radiazioni ultravioletta, visibile e nel vicinoinfrarosso hanno energia sufficiente per promuovere questiprocessi.
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Trasduttori
La radiazione infrarossa è rivelata mediante i rivelatori dicalore misurando l’aumento di temperatura di un materialeannerito, posizionato nel cammino del raggio, o misurandol’aumento di conducibilità elettrica di un materialefotoconduttore quando questo assorbe la radiazioneinfrarossa.
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Tabella riassuntiva dei maggiori rivelatori per spettroscopia
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Rivelatori fotonici
Fototubi
Fotomoltiplicatori
Fotodiodi al silicio
Celle fotovoltaiche
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Fototubi
Applicando un potenziale tra gli elettrodi, i fotoelettroni emessifluiscono all’anodo, producendo una corrente (fotocorrente) che èvelocemente amplificata e mostrata su uno schermo e registrata.
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Tubi fotomoltiplicatori
E’ simile nella costruzione al fototubo ma è più sensibile. Glielettroni emessi sono accelerati verso un dinodo (1) mantenuto ad un potenziale di circa 90 V più elevato rispetto al catodo e cosi via su tutti i dinodi rimanenti producendo per ciascun fotone da 106 a 107 elettroni. Tale cascata di elettroni è infine raccolta all’anodo.
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Fotodiodi al silicio
Hanno acquisito notevole importanza recentemente perché èpossibile affiancarne, su un singolo chip di silicio, 1000 o più. Con uno o due di questi rivelatori a serie di diodi posti lungola lunghezza del piano focale di un monocromatore èpossibile monitorare simultaneamente tutte le lunghezzed’onda, realizzando così la spettroscopia ad alta velocità.
Il silicio cristallino è un semiconduttore. A temperaturaambiente questa struttura ha un agitazione termica
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Celle fotovoltaiche
E’ il piú semplice trasduttore di radiazione ed ècostituito da un elettrodo di rame o di ferro sul quale èdepositato uno strato di un materiale semiconduttorecome selenio o rame(I) ossido.
La cella fotovoltaica tipica ha sensibilità massima a circa 550 nm, con una risposta che cade a circa il 10% del massimo a 350 e 750 nm.
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Rivelatori termici
I rivelatori fotonici precedentemente esposti non possono essereutilizzati per misurare la radiazione infrarossa poiché i fotoni diqueste frequenze non hanno energia sufficiente a produrrefotoemissione di elettroni; come conseguenza devono essereusati i rivelatori termici.
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I rivelatori termici consistono di una sottile superficieannerita che si riscalda assorbendo radiazione infrarossa. L’aumento di temperatura è convertito in un segnaleelettrico che è amplificato e misurato.
Le prestazioni dei rivelatori termici sono decisamenteinferiori a quelle dei rivelatori fotonici.
Rivelatori termici
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Rapporto segnale-rumore
Il segnale in uscita dallo strumento fluttua in manieracasuale e proprio tali fluttuazioni limitano la precisionedello strumento.
Il segnale è il valore medio dell’uscita di un dispositivoelettronico, mentre il rumore è la misura della deviazionestandard del segnale.
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Il rapporto segnale-rumore (S/N) viene usualmentedefinito come il rapporto tra il valor medio del segnalein uscita e la sua deviazione standard ed è consideratoun’importante parametro di merito per gli strumentianalitici e per altri tipi di dispositivi elettronici.
Rapporto segnale-rumore
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Rapporto segnale-rumore
Il comportamento segnale-rumore è mostratonello spettro riportato qui a fianco relativoall’emoglobina.
Lo spettro in basso ha S/N = 100 e si possonofacilmente osservare i picchi a 540 nm e 580 nm. Con la diminuzione di S/N i picchi appaionoscarsamente visibili; per valori di S/N = 2 e S/N = 1 i picchi scompaiono nel rumore e non sonoidentificabili.
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Processori e registratori del segnale
Il processore del segnale è generalmente un dispositivoelettronico che amplifica il segnale elettrico del rivelatore; può modificare il segnale da continuo ad alternato, cambiare la fase del segnale e filtrarlo per rimuovere le componenti non desiderate.
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Processori e registratori del segnale
Il processore può anche essere utilizzato per eseguireoperazioni matematiche sul segnale come differenziazione, integrazione o conversione al logaritmo.
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Contenitori per il campione
I contenitori per il campione sono chiamaticellette o cuvette e devono avere finestrecostruite con un materiale trasparente nellaregione spettrale d’interesse.
Il quarzo o silice fusa è richiesto per la regione ultravioletta(sotto i 350 nm) e può essere usatonella regione visibile e fino a circa 3000 nm nell’infrarosso.
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Contenitori per il campione
La qualità dei dati spettroscopici dipende criticamente dalmodo in cui le cuvette accoppiate sono usate e conservate.Impronte digitali, grasso o altri depositi sulle pareti alterano in maniera marcata le caratteristiche di trasmissione di unacuvetta.
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Strumenti per misure di assorbimento ottico
Sono due i tipi di strumenti utilizzati per misure diassorbimento con radiazione ultravioletta, visibile o infrarossa:
spettrofotometri
fotometri
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Gli spettrofotometri utilizzano un monocromatore a reticolo o a prisma per selezionare una stretta banda diradiazione per le misure.
I fotometri utilizzano a tale scopo un filtro diassorbimento.
Differenze tra spettrofotometri e fotometri
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Gli spettrofotometri offrono il vantaggio considerevole della possibilità di variare in modo continuo la lunghezza d’onda utilizzata rendendo possibile la registrazione dell’intero spettro di assorbimento.
I fotometri hanno di contro il vantaggio della semplicità, robustezza e basso costo.
Differenze tra spettrofotometri e fotometri
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Esistono tre categorie di strumenti utilizzabili per la spettrofotometria ultravioletta/visibile:
strumenti a raggio singolo
strumenti a doppio raggio
strumenti multicanale
Spettrofotometri nell’ultravioletto/visibile
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La figura a fianco riporta lo schema di uno strumentosemplice e poco costoso, lo Spectronic 20, progettato per la regione visibile dellospettro. Il suo intervallospettrale va da 340 a 625 nm.
Strumenti a raggio singolo
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Lo Spectronic 20 ha una sorgente di luce a filamento ditungsteno alimentata con un alimentatore stabilizzato. L’intensità della radiazione della lampada è sufficientementecostante da fornire dati di assorbimento riproducibili.
Strumenti a raggio singolo
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La radiazione dalla sorgente passa attraverso una fenditurafissa e giunge sulla superficie di un reticolo di riflessione.La radiazione diffratta passa attraverso la fenditura diuscita fino alla cuvetta del campione o del riferimento ed infine al fototubo.
Strumenti a raggio singolo
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Strumenti a raggio singolo
Il segnale elettrico amplificato dal rivelatore alimenta un contatore dotato di una scala lineare in trasmittanzapercentuale; lo strumento è dotato anche di una scalalogaritmica calibrata in assorbanza.
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Per avere una lettura di trasmittanza percentuale il puntatoredel contatore è prima azzerato con il compartimento del campione vuoto, in modo tale che lo schermo blocchi ilraggio e nessuna radiazione raggiunga il rivelatore. Il procedimento è detto calibrazione o aggiustamento dello 0% di T.
Strumenti a raggio singolo
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Una volta effettuata la calibrazione o aggiustamento dello 0% di T si inserisce una cuvetta contenente il bianco nelportacampione e il puntatore è portato in corrispondenza del segno 100% di T corregendo la posizione della finestra dicontrollo della luce e dosando la quantità di luce che raggiungeil rivelatore.Il procedimento è detto calibrazione o aggiustamento del 100% di T.
Strumenti a raggio singolo
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Strumenti a raggio singolo
Una volta effettuata sia la calibrazione dello 0% di T siala calibrazione del 100% di T il campione viene posto nelcompartimento della cuvetta e la trasmittanza percentualeo l’assorbanza viene letta direttamente sulla scala del contatore.
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Strumenti a doppio raggio
Esistono due tipi di strumenti a doppio raggio:
strumento a doppio raggio con raggi separati“nello spazio”
strumento a doppio raggio con raggi separati “neltempo”
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Strumento a doppio raggio con raggi separati nello spazio
La figura sottostante illustra uno strumento a doppio raggio “nello spazio” in cui i due raggi vengono prodotti nello spazio mediante uno specchio a forma di V detto “beam splitter”.
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Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
In questo secondo tipo di strumento i raggi luminosi sonoseparati “nel tempo” per la rotazione di uno specchio a settori che dirige l’intero fascio dal monocromatore prima attraverso il riferimento e poi attraverso il campione.
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Gli impulsi di radiazione vengono ricombinati da un secondo specchio a settori chetrasmette un impulso al rivelatore e riflette l’altro.
Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
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Lo strumento precedentemente illustrato è del tipo ad azzeramento; il raggio che passa attraverso il solvente èattenuato finchè la sua intensità non eguaglia quella del fascio che passa attraverso il campione.L’attenuazione viene eseguita con un cuneo ottico la cui trasmissione decresce linearmente con la sua lunghezza.
Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
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Gli spettrofotometri a doppio raggio offrono il vantaggio dicompensare tutte le fluttuazioni, tranne quelle di duratamolto breve, nell’uscita radiante della sorgente nonché la deriva del rivelatore e dell’amplificatore.
Strumenti a doppio raggio
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Strumenti multicanale
Gli spettrofotometri multicanale, o a serie di diodi, permettono la registrazione rapida di un intero spettro ultravioletto e visibile.Il cuore di questi strumenti è rappresentato da un numero elevatodi diodi di silicio posti l’uno accanto all’altro su una singolapiastrina di silicio.
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Le piastrine generalmente sono lunghe da 1 a 6 cm mentrela larghezza dei singoli diodi varia da 0.015 a 0.050 mm.
Ponendo una o due di queste serie di diodi lungo il piano focale di un monocromatore a reticolo, tutte le lunghezzed’onda possono essere registrate contemporaneamente e i dati per un intero spettro collezionati e memorizzati in un secondo o meno.
Strumenti multicanale
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Qui di seguito viene mostrato un diagramma ottico di un tipicospettrofotometro multicanale nell’ultravioletto/visibile.
Strumenti multicanale
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Grazie all’utilizzo di questi strumenti la radiazione in uscitaè molto più intensa di quella di uno spettrofotometrotradizionale e di conseguenza la sola lampada al deuteriopuò servire come sorgente sia per la regionedell’ultravioletto che per quella del visibile (fino a 820 nm).
Strumenti multicanale
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Una singola scansione da 200 a 820 nm con uno strumentodi questo tipo richiede 0.1 s.Per migliorare la precisione delle misure la scansione vieneeseguita per un secondo o più e i dati sono acquisiti dalcomputer e mediati con quelli della scansione successiva.I ridotti tempi di esposizione del campione riducono la fotodecomposizione dello stesso anche se esso si trova trasorgente e monocromatore.
Strumenti multicanale
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Sono due i tipi di spettrofotometri utilizzati in spettroscopiainfrarossa:
strumenti dispersivi
strumenti in trasformata di Fourier
Spettrofotometri nell’infrarosso
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Differiscono dallo spettrofotometro a doppio raggio per la posizione del portacampione rispetto al monocromatore; le cuvette sono posizionate fra la sorgente e il monocromatorepoiché la radiazione infrarossa non è sufficientementeenergetica da provocare decomposizione.
Strumenti dispersivi
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Le sorgenti infrarosse sono costituite da solidiriscaldati piuttosto che lampade al deuterio o al tungsteno.
I reticoli infrarossi sono più grossolani di quelliutilizzati per la radiazione ultravioletta/visibile.
I rivelatori infrarossi rispondono al calore più che aifotoni.
Strumenti dispersivi
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Nei primi anni ’70 gli spettrofotometri in trasformata diFourier erano molto ingombranti e altrettanto costosi per cui illoro utilizzo era limitato ad applicazioni speciali per le quali le loro caratteristiche uniche risultavano essenziali.
Strumenti in trasformata di Fourier
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Adesso le dimensioni sono state ridotte a dimensioni da banco, i prezzi sono più accesibili e la facilità ed affidabilitànell’utilizzo li sta facendo diventare gli strumenti di scelta nellamaggior parte dei laboratori.
Gli strumenti in trasformata di Fourier non contengonoelementi dispersivi e tutte le lunghezze d’onda sono rivelate e misurate contemporaneamente.
Strumenti in trasformata di Fourier
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Interferometro di Michelson
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Interferenza di due fronti d’onda monocromatiche
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Interferenza di due fronti d’onda monocromatiche
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Interferogramma
Spettro di una sorgente Di luce continua