Le funzioni del DNA

Replicazione

Trascrizione

mRNA rRNA tRNA snRNA

Traduzione

Proteine strutturali

Proteine con funzioni

speciali

Enzimi

Controllo delle attività metaboliche

Auto-sintetica

Replicazione del DNA

Allosintetica Sintesi di RNA

Sintesi Proteica

Proteina

Espressione del DNA Funzione allosintetica

Trascrizione

rRNA

snRNA ← Sintesi di RNA → mRNA

tRNA

Controllo sulla morfologia e funzione cellulare

PRO

TE

INE

Il nucleoside è composto da una base azotata e da uno zucchero pentoso (a 5 atomi di C):

Ø Ribosio nell’acido Ribonucleico, RNA

Ø Deossiribosio nell’acido Deossiribonucleico, DNA

Nucleotide = Nucleoside + Gruppo Fosfato

Basi Azotate

Puriniche Adenina

Guanina

Timina (solo nel DNA)

Uracile (solo nel RNA)

Citosina

Pirimidiniche

Basi Puriniche (dalla Purina)

Zuccheri

Basi Pirimidiniche (dalla Pirimidina)

Basi Azotate e Zuccheri Pentosi

Adenina (A) Guanina (G)

Citosina (C) Timina (T) Uracile (U)

Ribosio 2’- deossiribosio

RNA mRNA- RNA messaggero- viene tradotto in un polipeptide rRNA- RNA ribosomale- viene utilizzato per la costruzione dei ribosomi tRNA- RNA transfer- porta gli aminoacidi sul polipeptide nascente snRNA- small nuclear RNA- piccoli RNA nucleari complessati con proteine che mediano la maturazione degli RNA che vengono poi trasportati nel citoplasma snoRNA-small nucleolar RNA- piccoli RNA nucleolari, svolgono parecchie funzioni (partecipano alla biosintesi dei ribosomi, modificano il ribosio di alcuni RNA attraverso l’aggiunta di gruppi metilici, partecipano allo splicing alternativo, serve da templato per la sintesi dei telomeri miRNA-microRNA- piccole molecole di RNA (22 nucleotidi) che controllano l’espressione di RNA messaggeri

La sequenza di basi di una catena polinucleotidica del DNA determina la sequenza di basi nell’altra catena

polinucleotidica antiparallela

A T A C G C T G

T A T G C G A C

Complementarietà delle Basi Azotate

3’

3’ 5’

5’

La sequenza di basi di una catena polinucleotidica del DNA determina la sequenza di basi in una catena polinucleotidica

nascente di RNA

A T A C G C T G

U A U G C G A C

Complementarietà delle Basi Azotate

3’

3’ 5’

5’

IL DOGMA CENTRALE DELL’ESPRESSIONE GENICA

IL DOGMA CENTRALE DELL’ESPRESSIONE GENICA

RELAZIONE FUNZIONALE TRA GENI ED ENZIMI

RELAZIONE FUNZIONALE TRA GENI ED ENZIMI

Dato che ciascun mutante era deficitario di un singolo gene, Beadle e Tatum proposero l’ipotesi:

UN GENE- UN ENZIMA

Secondo cui la funzione di un gene consiste nel fornire informazioni per la produzione di uno specifico enzima

… IL SEGUITO DELLA STORIA Non tutte le proteine sono enzimi (la cheratina e l’ormone insulina sono due esempi di proteine non enzimatiche).

IPOTESI UN GENE-UNA PROTEINA Non tutte le proteine sono formate da un singolo polipeptide, e dunque possono essere codificate da due geni diversi, come ad esempio l’emoglobina.

IPOTESI UN GENE-UN POLIPEPTIDE

In termini molecolari un gene può essere definito come un segmaento di DNA che viene espresso per ottenere un prodotto funzionale, corrispondente o a una molecola di RNA (ad esempio RNA ribosomiale o RNA transfer) o ad

un polipeptide.

CHE COSA è UN GENE?

LA STRUTTURA DEI GENI EUCARIOTICI

La maggior parte dei geni eucariotici è costituita da segmenti di sequenze codificanti (ESONI) interrotti da sequenze non codificanti (INTRONI). Sia

gli esoni che gli introni vengono trascritti per ottenere un lungo trascritto precursore. Gli introni sono quindi rimossi attraverso il meccanismo dello

splicing per formare il trascritto maturo.

IL CIRCUITO DELL’ESPRESSIONE GENICA

Le cellule muscolari e quelle del fegato contengono gli stessi geni; le funzioni di queste cellule non sono determinate da differenze nei loro genomi, ma da

circuiti di espressione genica che governano lo sviluppo ed il differenziamento.

Trascrizione Sequenze specifiche di DNA sono “copiate” (trascritte) in molecole di RNA. La correttezza della trascrizione è garantita dalla complementarietà tra le basi del filamento di DNA e quelle dell’RNA che si forma sul suo stampo. L’informazione del DNA è in tal modo trascritto in molecole di RNA, con funzioni diverse (hnRNAs, rRNAs, tRNAs, snRNAs) Maturazione dell’hnRNA (RNA nucleare eterogeneo) e formazione di mRNA Modificazione del trascritto primario (eliminazione degli introni, aggiunta di gruppi chimici alle estremità della molecola) e trasferimento al citoplasma dell’ mRNA maturo. Traduzione L’mRNA trasporta il messaggio dal DNA ai ribosomi, dove il messaggio sarà tradotto: attraverso un codice (codice genetico), la sequenza lineare dei nucleotidi del mRNA determinerà la sequenza lineare di aminoacidi nella catena polipeptidica (struttura primaria della proteina).

Flusso di informazione attraverso la cellula:

il dogma centrale della biologia

L’enzima principale responsabile per la sintesi dell’RNA è

l’RNA polimerasi

La RNA polimerasi è un enzima complesso formato da diverse catene polipeptidiche.

L’enzima completo batterico consiste di cinque diverse subunità chiamate a, b, b’, w, s.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La sequenza di DNA alla quale si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene è chiamata promotore

Queste sequenze comuni comprendono sei nucleotidi ognuna, e sono localizzate approssimativamente a 10 e 35 basi a monte

del sito d’inizio della trascrizione.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La trascrizione da parte dell’RNA polimerasi di E. coli

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

La terminazione della trascrizione viene segnalata da una ripetizione invertita ricca bin GC seguita da sette residui di A, tale da formare una struttura ad ansa e forcina stabile

dell’RNA, causando la dissociazione dell’RNA dallo stampo di DNA.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio metabolismo

Jacob and Monod, Nobel Prize 1965

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio metabolismo

β-galattosidasi permeasi transacetilasi repressore

Il lattosio induce la sintesi degli enzimi coinvolti nel proprio metabolismo

L’elica del DNA viene svolta e un filamento di DNA funge da stampo per la sintesi dell’hnRNA: i nucleosidi trifosfati man mano si dispongono in sequenza per complementarietà con le basi del DNA.

L’enzima RNA polimerasi taglia due gruppi fosfato da ciascun nucleoside trifosfato e unisce il gruppo fosfato rimasto all’estremità 3’ della catena di mRNA in allungamento mediante un legame covalente. Così l’hnRNA si forma in direzione 5’ - 3’.

La trascrizione termina in corrispondenza di una specifica sequenza di nucleotidi di DNA.

Direzione della trascrizione

Filamento di DNA di stampo mRNA trascritto

Catena di DNA che funge da stampo

Catena di RNA in allungamento

5’

5’

3’

5’ 3’

5’

5’

3’

3’

3’

TRASCRIZIONE

TRASCRIZIONE

Un promotore eucariotico

Gli enhancer (intensificatori) sono sequenze capaci di stimolare la trascrizione e possono svolgere la loro funzione anche a grandi distanze.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

I promotori dei geni trascritti dalla RNA polimerasi II contengono sequenze TATA (TATA box) da 25 a 30 nucleotidi a monte del sito di inizio.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

L’aggiunta di un enhancer stimola la trascrizione anche a grande distanza ed in entrambi gli orientamenti

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Il legame di proteine regolatrici agli enhancer è responsabile del controllo dell’espressione genica durante lo sviluppo ed il differenziamento, come

anche nella risposta cellulare agli ormonie ai fattori di crescita.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

Le RNA polimerasi eucariotiche

Le cellule eucariotiche contengono tre distinte RNA polimerasi nucleari che trascrivono classi distinte di geni:

RNA polimerasi I è specificamente deputata alla trascrizione delle tre specie più grandi di RNA ribosomiale (rRNA 28S, 18S e 5.8S). RNA polimerasi II trascrive i geni che codificano per le proteine (mRNA) ed i microRNA (miRNA), che sono regolatori critici dell’espressione genica nelle cellule eucariotiche. RNA polimerasi III trascrive i geni degli RNA di trasporto (tRNA) e gli RNA ribosomiali 5S.

Cooper and Hausman, La cellula. Piccin

TRASCRIZIONE - Inizio

Il processamento dell’mRNA negli eucarioti

Il processamento degli RNA messaggeri rappresenta una delle maggiori differenze tra le cellule eucariotiche e procariotiche: Nei batteri infatti I ribosomi hanno immediatamente accesso all’mRNA e la traduzione può cominciare sulla catena di mRNA nascente mentre la trascrizione sta ancora procedendo. Negli eucarioti, l’mRNA sintetizzato nel nucleo deve essere processato e trasportato nel citoplasma prima di poter essere utilizzato come stampo per la sintesi delle proteine.

Il processamento dell’mRNA negli eucarioti

Cooper & Hausman 2012

I geni eucariotici contengono sequenze (introni) di DNA non codificante, che non si ritrovano nell’mRNA maturo, all’interno delle sequenze codificanti (esoni), che

saranno tradotte in sequenze di aminoacidi della proteina

Maturazione del trascritto primario negli eucarioti

Erez et al., 2003 SOPRAVVIVENZA MORTE CELLULARE

Il processamento alternativo dell’mRNA negli eucarioti

Il processamento dell’RNA di trasporto

Gli RNA di trasporto derivano dai pre-tRNA, alcuni dei quali contengono diverse molecole di tRNA. Il taglioall’estremità 5’ del tRNA è catalizzato dal ribozima Rnasi P, il taglio all’estremità 3’, invece è catalizzato da una Rnasi proteica convenzionale

Cooper & Hausman 2012

Struttura del tRNA

Gli RNA di trasporto sono lunghi approssimativamente 70-80 nucleotidi ed hanno una caratteristica struttura a quadrifoglio risultante dall’appaiamento di basi complementari fra diverse regioni della molecola

Cooper & Hausman 2012

tRNA di trasporto

Anticodone

Ansa 1

Ansa 2

Ansa 3

Estremità accettrice

di aminoacidi

Estremità 5’

Estremità 3’

Ansa 2

Ansa 1

Ansa 3 5’

3’

Nucleotidi modificati

Aggancio degli aminoacidi ai tRNA

Cooper & Hausman 2012

I ribosomi sono i siti della sintesi proteica. Sono composti di proteine ed RNA ribosomiale (rRNA) e costituiti da due

subunità, una maggiore e una minore

rRNA e RIBOSOMI

I ribosomi si assemblano all’interno del nucleo, nell’area identificata dal

nucleolo, dove gli rRNAs sintetizzati si associano alle proteine ribosomiali per

formare Ie subunità 60S e 40S

Il processamento dell’RNA ribosomiale

Cooper & Hausman 2012

Ribosomi Organelli ribonucleoproteici

Dimensioni

Eucarioti = 80 S (60S + 40S)

Procarioti = 70 S (50S + 30S) S = Svedberg, unità di misura della velocità di

sedimentazione

Struttura dei ribosomi

Cooper & Hausman 2012

mRNA procariotici ed eucariotici

Cooper & Hausman 2012

La sintesi delle proteine è lo stadio finale dell’espressione genica.

Tuttavia, la traduzione dell’mRNA è solo il primo passo nella formazione di una proteina funzionante. La catena polipeptidica deve poi ripiegarsi nella conformazione tridimensionale appropriata e, spesso, subisce vari passaggi di maturazione prima di essere convertita nella sua forma attiva. Questi passaggi di maturazione, specialmente negli eucarioti, sono strettamente connessi allo smistamento e al trasporto di diverse proteine nelle loro destinazioni finali della cellula.

IL CODICE GENETICO

4 basi, combinate 3 a 3, formano 4x4x4 = 43 = 64 combinazioni, dette Triplette o Codoni.

Di questi 64 codoni: 3 sono segnali d’arresto, 61 codificano per uno dei 20 aminoacidi esistenti.

Alcuni codoni sono sinonimi, cioè codificano per lo stesso aminoacido.

Il codice è universale (vale per tutti i viventi).

La tripletta UUU codifica per la fenilalanina: La traduzione in vitro di un RNA sintetico che consiste di uracili ripetuti (uno stampo di poli-U) porta alla sintesi di un polipeptide contenente solo fenilalanina.

Prima lettera

Seconda lettera Terza lettera

A U

G C

T A

C G

A U G C T A C G A U G C T A C G

IL CODICE GENETICO

A U G C T A C G A U G C T A C G A U G C T A C G

AAA UUU AAG UUC AAT UUA AAC UUG

AGA UCU AGG UCC AGT UCA AGC UCG

…... …...

ATT UAA Stop ATC UAG Stop

ATT UAA Stop

GAA CUU GAG CUC GAT CUA GAC CUG

….

DNA RNA Aminoacidi

P H E L E U

L E U

S E R

Il codice genetico: universale, degenerato, non ambiguo

Il riconoscimento tra il tRNA e lo specifico aminoacido richiede l’intervento di enzimi specifici,

le aminoacil-tRNA sintetasi

La  traduzione  è  cos0tuita  da  tre  stadi:    

Inizio  

Allungamento  

Terminazione  

TRADUZIONE  

Segnali di inizio della traduzione

Cooper & Hausman 2012

Cooper & Hausman 2012

Struttura della subunità ribosomiale 50S

Cooper & Hausman 2012

5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’

Allungamento

fMet

Legame peptidico

val val phe

phe

INIZIO DELLA TRADUZIONE

La subunità ribosomiale minore si attacca all’estremità 5’ della molecola di mRNA. La prima molecola di tRNA, che trasporta l’aminoacido modificato fMet, si inserisce nel codone d’inizio AUG sulla molecola di mRNA. La subunità ribosomiale maggiore si incastra con il tRNA in posizione P (peptide). Il sito A (aminoacile) è vuoto.

Subunità minore

mRNA fMet fMet

Ribosoma completo

3’

5’ 5’ 5’ 3’

3’

5’

3’

Inizio

5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’

Allungamento

fMet

Legame peptidico

val val phe

phe

Quando un ribosoma incontra un codone di terminazione, in questo caso UGA, il polipeptide si stacca dall’ultimo tRNA e il tRNA si libera dal sito P. Il sito A è occupato da un fattore di rilascio, che stimola la dissociazione delle due subunità del ribosoma.

5’ 5’ 3’ 3’

Terminazione

trp Fattore

di rilascio

Membrana cellulare

Aminoacidi Aminoacil tRNA-sintetasi

tRNA

DNA

mRNA Primo

ribosoma inserito

Secondo ribosoma inserito

Ribosoma

Ribosoma

tRNA con aminoacido attaccato Catena

polipeptidica in crescita

3’ 5’

5’ 3’ 3’

3’

5’

5’

5’

3’

FASE DI ALLUNGAMENTO DELLA TRADUZIONE Il ribosoma ha tre siti di attacco per il tRNA: 1.  Sito peptidilico (P) 2.  Sito aminoacilico (A) 3.  Sito di uscita (E) Il ribosoma si muove di tre nucleotidi lungo l’mRNA; questo movimento trasloca il peptidil-tRNA al sito P ed il tRNA scarico al sito E, lasciando il sito A vuoto pronto per ricevere l’aminoacido successivo.

TERMINAZIONE DELLA TRADUZIONE Un codone di terminazione (ad esempio UAA) nel sito A è riconosciuto da un fattore di rilascio piuttosto che da un tRNA. Il risultato è i l r i lascio della catena polipeptidica completata, seguito dalla dissociazione di tRNA e mRNAdal ribosoma.

TRADUZIONE

L’ mRNA per le proteine che devono essere sintetizzate nel RER contiene una sequenza peptidica segnale che blocca l’attività del ribosoma sino a

che questo non si unisce a recettori specifici del RER