Fondazione PESCARA CELL FACTORY FOUNDATION Onlus - Sede legale: Corso Vittorio Emanuele II n. 346 – 65122 PESCARA Tel. 085 290142 - Mob. 338 2659056 Sede operativa : via Fonte Romana n. 8 c/o Ospedale Civile Santo Spirito di Pescara - Cod. Fiscale 91119630688 –BPER BANCA POP. EM.ROM. IBAN : IT 78 F 0538777840000000589457
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SINOPSI
dell’attività già svolta e delle attività che la PCFF intende svolgere
Istituzione fondazione E’ stata costituita con atto notarile il 28/12/2012 con la
denominazione “Pescara Cell Factory Foundation O.N.L.U.S.” Scopi Valorizzare al meglio il polo onco/ematologico/trasfusionale
della ASL di Pescara.
Ambiti di intervento Ricerca di base, traslazionale e clinica in campo onco-‐ematologico nonché la sperimentazione della terapia cellulare nella medicina rigenerativa e nel trapianto di cellule staminali.
Attività già svolte 1): terapia cellulare/medicina rigenerativa
Realizzati a Pescara negli ultimi 10 anni importanti studi sulla immunoterapia adottiva con l’impiego di cellule create in laboratorio e dotate di proprietà killer-‐specifica verso alcuni tumori. Oggi sono necessari laboratori sterili (CELL FACTORY)
Attività già svolte 2) : Cellule staminali e trapianto
Registrati a Pescara significativi progressi nel trapianto di midollo. Scoperta una nuova cellula staminale con un interessante potenziale curativo. Oggi sono necessari laboratori sterili (CELL FACTORY).
Allestimento CELL FACTORY presso AUSL PESCARA
CELL FACTORY in allestimento presso la AUSL di Pescara. Consegna manufatto ed inizio attività 2° semestre 2014-‐06-‐08
Campi di interesse di PCFF
Creazione di un ”THINK TANK” con compiti di disegnare progetti di ricerca in campo onco-‐ematologico e nell’ambito della medicina rigenerativa e del trapianto di cellule staminali.
Attività iniziale PCFF Stipula di convenzione pluriennale con AUSL di Pescara; Supporto a 6 progetti di ricerca incoming -‐ anno 2014 Supporto organizzazione 2 eventi scientifici, anno 2014.
Aspetti economici e fundraising Target raccolta fondi anni 2014-‐2016 = Euro 250.000,00.
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BACKGROUND -‐ PCFF Le nuove conoscenze maturate recentemente nei settori dell’Ematologia, della Medicina Trasfusionale e del Trapianto hanno radicalmente mutato l’orizzonte scientifico ed il destino di moltissimi pazienti affetti da malattie altrimenti mortali. In questi ambiti la ricerca ha compiuto passi da gigante e le nuove scoperte sulle cellule staminali e sulla medicina rigenerativa hanno aperto scenari e prospettive di cura assolutamente inimmaginabili fino a qualche anno fa. Una parte rilevante di questi progressi è da ascrivere al grande successo dal trapianto emopoietico ed alla moderna manipolazione cellulare in vivo ed ex-‐vivo. In questi ambiti l’Ematologia e la Medicina Trasfusionale dell’Ospedale di Pescara hanno nel corso degli anni meritatamente e ripetutamente ricoperto un ruolo da protagonisti, conseguendo una serie di importanti primati nella innovazione in medicina.
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In particolare, negli ultimi 10 anni a Pescara la ricerca è stata focalizzata sulla terapia cellulare/medicina rigenerativa e sulle cellule staminali. I due temi sono stati sviluppati parallelamente ma tenendo presente un unico obbiettivo finale, quello di “elaborare modelli di medicina avanzata capaci di riparare, rigenerare e/o sostituire tessuti e funzioni d’organo irrimediabilmente danneggiati”. La novità era anche data dal tipo di progettazione “all inclusive” che fin dall’inizio ha tenuto nel massimo conto l’esigenza primaria di ridurre drasticamente i tempi di trasferimento al letto dei pazienti delle nuove conoscenze. In genere questi tempi sono molto lunghi, talvolta anche più di 10 anni, e risultano eticamente e socialmente incompatibili con le attese di chi soffre e richiede soluzioni immediate. Vale per tutti l’ esempio delle malattie rare e cioè una serie di patologie non frequenti che interessano un numero limitato di pazienti. In questi casi l’interesse dell’industria farmaceutica è modesto così come gli investimenti. Una parte di malati viene così lasciata orfana di trattamenti . Di qui la necessità che qualcuno si faccia carico di questa umanità sofferente e di qui l’affermarsi del nuovo concetto di “cura personalizzata” realizzata “home made” in cui la terapia cellulare/medicina rigenerativa e la cellule staminali ne rappresentano la massima espressione.
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TERAPIA CELLULARE/MEDICINA RIGENERATIVA
All’inizio degli anni 2000 è stato sviluppato a Pescara, e per la prima volta in Italia, un nuovo programma di immunoterapia adottiva antitumorale basato sulla manipolazione estensiva in laboratorio di linfociti autologhi. Lo scopo era rappresentato dal tentativo di incrementare al massimo le difese immunitarie potenziando la risposta immunologica del paziente stesso nei confronti del tumore, impiegando cellule prelevate dal sangue periferico del malato dopo averle però manipolate, modificate ed “armate” in laboratorio. È stata messa a punto a Pescara una metodica originale che ha consentito la generazione su larga scala di cellule immunocompetenti espanse ad azione killer specifica (Cytokyne Induced Killer Cells -‐ CIK) contro alcune neoplasie avanzate/metastatizzate (linfomi maligni, carcinoma renale e epatocarcinoma). A determinate concentrazioni, queste cellule si sono dimostrate capaci in laboratorio di lisare selettivamente delle linee cellulari neoplastiche. Al contrario della chemio e della radioterapia questo processo di killing risparmiava sia le cellule normali che i tessuti sani. In meno di 24 mesi queste esperienze sono state trasferite in clinica. I risultati clinici sui pazienti sono stati estremamente incoraggianti.
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A) CELLULE STAMINALI
Contemporaneamente nell’ultimo decennio sono stati prodotti considerevoli sforzi per incrementarla
ricerca e l’innovazione nel campo delle cellule staminali. Ne ha tratto grande giovamento i programmi di
trapianto di come cura di leucemie, linfomi, mielomi e talassemie che per numero e qualità dei risultati
pone Pescara ai vertici nazionali.
E’ stata creata una banca interregionale (Abruzzo e Marche) di cellule staminali placentari che è entrata a
fare parte del network mondiale. Essa è dotata di tutte le certificazioni di qualità e ciò le consente di
esportare in tutto il mondo i propri prodotti trapianto-‐ logici.
Recentemente è stata individuata e caratterizzata da Anna Berardi, responsabile del Laboratorio Stem Cells
della Medicina Trasfusionale dell’Ospedale di Pescara, una nuova cellula staminale che sembra dotata di
proprietà assolutamente uniche.
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Attualmente si sta ancora esplorando il potenziale di cura di alcuni nuovi protocolli basati sull’impiego di
questa nuova cellula. Sembra molto probabile la sua capacità di riparare i vasi sanguigni e di generarne di
nuovi.
In questo ambito le ricadute pratiche potrebbero essere di valore incalcolabile, basti pensare alla
ricostruzione dei vasi coronarici nell’infarto cardiaco.
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CAMPI DI INTERESSE DELLA PCFF L’apertura presso la ASL di Pescara di un sito produttivo per la terapia cellulare medicina/ rigenerativa e
per le cellule staminali costruito con le caratteristiche ed i requisiti di una CELL FACTORY apre delle
promettenti prospettive per l’area metropolitana Chieti/Pescara, per la Regione Abruzzo ed in genere per
tutto il Mezzogiorno.
Tuttavia le precedenti esperienze maturate nella processazione delle cellule staminali per trapianto e nella
manipolazione estensiva per immunoterapia, hanno fatto maturare il chiaro convincimento che programmi
così impegnativi non siano sostenibili nel lungo periodo dalla sola sanità pubblica.
Essi necessitano di un forte supporto da parte del privato solidale ed del generale consenso della comunità
di riferimento.
L’intera filiera che porta alla fine alla cura del paziente è costituita da una serie di fasi che sono
rappresentate nello schema allegato e di cui l’aspetto produttivo all’interno della “CELL FACTORY” non è
necessariamente il più preponderante.
Occorrono in primis idee innovative, ampie conoscenze scientifiche a 360 gradi, collegamenti con altri
centri di ricerca e grande capacità progettuale. E’ indispensabile arricchire con forti contenuti la fase che
precede la fabbricazione/produzione delle cellule. In questo ambito la PCFF riveste un ruolo cruciale nella
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costituzione e nella operatività del “THINK TANK”, nella fase della ricerca di base, nella realizzazione dei
prototipi di cura e nell’abbreviare i tempi dello scaling-‐up clinico.
Modello operativo proposto da PCFF: 1. PROGETTAZIONE - fase dedicata alla ideazione di nuovi programmi e dei prodotti/servizi
innovativi, la loro fattibilità, la rilevanza strategica per l’ASL e la eventuale sostenibilità attraverso
un contenitore dedicato (THINK TANK).
2. RICERCA & SVILUPPO E PROTOTIPIZZAZIONE - fase che comprende la ricerca di base, la
pre-clinica e lo scaling-up clinico. In questo passaggio vengono allestiti i prototipi dei prodotti, le
pre-validazioni, i test in vitro e la predisposizione della documentazione di rito per l’approvazione
ministeriale.
3. PRODUZIONE NELLA CELL FACTORY - Produzione di cellule di grado farmaceutico all’interno dei 2 laboratori di classe B a produzione di cellule staminali per trapianto all’interno dei laboratori di classe C e D.
4. SERVIZIO CLINICO - Opera come braccio operativo curando l’appropriatezza delle
richieste, la distribuzione dei prodotti ed il loro impiego sui pazienti.
5. RETE ESTERNA PERIFERICA DELLE RISORSE BIOLOGICHE – Rappresentata da altri ospedali
della Regione Abruzzo e di altre Regioni. Opera secondo il modello di Hub e Spoke
PCFF – Attività Incoming Nel corso del primo anno di attività la PCFF ha intrapreso le seguenti iniziative :
A. Stipula di accordi convenzionali pluriennale con la ASL di Pescara. Il documento quadro è in allestimento e terrà nel debito conto gli scopi e gli ambiti di PCFF in quanto coincidenti con l’interesse strategico di ASL Pescara nel valorizzare il proprio polo Ematologico e Trasfusionale. Nell’immediato vengono stipulate convenzioni ad hoc per i singoli progetti.
B. Pianificazione del Fund raising.
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La ricerca dei fondi necessari al sostentamento iniziale sarà intensificata e meglio strutturata attraverso gli strumenti più idonei (informazione, comunicazione, eventi, etc.). Nei primi tre anni di esercizio (2014-‐16) è stato posto un obbiettivo di raccolta pari ad almeno Euro 250.000,00.
C. Supporto ed eventi Scientifici Rilevanti.. PCFF ha patrocinato un primo evento internazionale dal titolo “1st Scientific Workshop on Stem Cells for Ligament and Tendon Ttissue Engineering and Regenaration” (Pescara -‐ 18 aprile 2013) ed il “Giubileo per il Quarantennale dell’Ematologia e Trasfusione di Pescara” (22 novembre 2013). Altri importanti appuntamenti scientifici saranno patrocinati e supportati da PCFF anche nel 2014.
1) Affiancamento, sostegno e partecipazione a progetti di ricerca.
PCFF sosterrà nel 2014, n° 6 progetti di ricerca recentemente avviati od in fase di avvio presso l’Ematologia e la Medicina Trasfusionale.
PROGETTI DI RICERCA SOSTENUTI DA PCFF (al 21 febbraio 2013) 1)“Microvescicles in human Hepatocellular carcinoma: Potential for diagnostic and therapeutic application”.
Progetto selezionato tra i circa 3.000 partecipanti al Bando Progetti di Ricerca Giovani Ricercatori-‐Ricerca Finalizzata 2010 del Ministero della Salute Italiano ed ha avuto l’assegnazione di un finanziamento di 202.000 euro. Sarà realizzato in stretta collaborazione con il National Institute of Health di Bethesda-‐USA.
2)“Studies in evaluating the role of the addition of a new discoverd stem cell (CD34-LiN- CD45- CD133-) in to a scaffold named DEGAPOL ®”.
Progetto, che si propone di creare un nuovo scaffold in grado di facilitare la ricostruzione di nuovi vasi sanguigni in medicina rigenerativa.
3)“Ingegneria dei tessuti nella medicina rigenerativa delle lesioni tendineo-‐legamentose” Progetto nella fase finale di allestimento che ha come obbiettivo l’impiego di nuovi scaffold combinati con cellule staminali mesenchimali. Sarà condotto in cooperazione con l’ Università di Salerno e con la Queen Mary University di Londra.
4)“DSCAM role in Down Syndrom and DS-‐cancer: expression patterns DSCAM-‐Netrin1”
Ricerca, frutto di un’ampia cooperazione internazionale (Pescara, Bologna, Montreal, Bethesda), si propone attraverso lo studio delle iPSC (induced pluripotent stem cells) di individuare i meccanismi molecolari della tumore genesi (Leucemia Mieloide Cronica Giovanile nella sindrome di Down).
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5)“Human Ewing Sarcoma Family Tumor Revisited from Cancer Stem Cells to the Epigenetic Regulation: cross-‐talk between ncRNA and DNA methylation”
Studio che si propone di identificare un nuovo bio-‐marker utile per guidare l’impiego di farmaci intelligenti nel Sarcoma di Ewing. Il progetto partecipa alla selezione per il Bando Nazionale per la Ricerca Finalizzata 2011 del Ministero della Salute.
6)”Ruolo delle alte dosi di Ascorbato nel Killing in Vitro delle Cellule della Leucemia Acuta non-Linfoide. Valutazione dell’Effetto Tumoricida “in vivo” anche in Combinazione con ATRA ed Arsenico”
È una ricerca in fase di avanzato allestimento e pronta all’avvio presso i laboratori di Pescara e dell’Università di Siena e si basa sull’impiego ad altissime dosi della vitamina C nella cura delle leucemie.
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Descrizione e relazione del progetto di ricerca in fase di avanzato allestimento
“Ruolo delle alte dosi di ascorbato nel Killing in vitro delle cellule della leucemia acuta non-linfoide: valutazione dell’effetto tumoricida “in vivo” anche in combinazione con Atra ed Arsenico” In partnership con :
A.U.S.L. di PESCARA Dipartimento di Ematologia, Medicina Trasfusionale e Biotecnologie Via Renato Paolini, 47 65124 – Pescara Dipartimento di Scienze Mediche, Chirurgiche e Neuroscienza Polo Scientifico San Miniato Via Aldo Moro 2 53100 – Siena
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Il progetto di ricerca scientifica EFFETTO DELL’ASCORBATO AD ALTE DOSI NELLA LEUCEMIA PROMIELOCITICA (APL) E NELLA LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA (LAM) L’ascorbato (Vitamina C, acido ascorbico ; ASC) è una vitamina essenziale per l’uomo [1], dotata sia di attività antiossidante, che di effetti citotossici, alle concentrazioni più elevate [2-‐4]. E’ stato proposto che l’ascorbato promuova il metabolismo ossidativo, inibendo l’uso del piruvato per la glicolisi anaerobica [5] . Un effetto inibitorio sulla crescita cellulare, da parte dell’ascorbato, è stato osservato in almeno sette diverse linee cellulari [6,7-‐13]. Nella nostra esperienza, l’ascorbato (ASC) a concentrazioni variabili, da 3 a 5 mM è altamente citotossico per cellule di retinoblastoma umano in linea continua, come le Y79 [14]. Tutti i dati di letteratura concordano sul fatto che tale effetto citotossico, prodotto dall’ascorbato sulle diverse linee cellulari (essenzialmente tumorali), sia da mettere in relazione con la sua attività di pro ossidante [2, 15-‐21]. In particolare, quando ossidato (con Ossigeno), l’ascorbato genera, nei sistemi biologici, perossido di idrogeno (H2O2), uno dei ROS (specie reattive dell’ossigeno) [22-‐24] e questa azione è facilitata da cationi divalenti come il ferro e il rame [16, 25]. Molto verosimilmente, il perossido di idrogeno (H2O2) viene generato all’interno della cellula, durante l’ossidazione metabolica dell’ascorbato a deidroascorbato. Il perossido di idrogeno (H2O2) così prodotto, riduce i livelli cellulari di tioli ed inizia la perossidazione dei lipidi di membrana [26-‐30,31,32]. E’ pertanto concepibile che l’ascorbato possa presentare un’attività citotossica preferenziale per le cellule tumorali, sia perché esse lo captano attivamente, (dal medium extracellulare), sia perché l’ascorbato intracellulare produce, per reazione redox, H2O2, che, nelle cellule tumorali, non viene disattivata, come invece avviene nelle cellule normali, poiché le cellule tumorali presentano un contenuto notevolmente ridotto (da 10 a 100 volte inferiore) di catalasi, rispetto a quelle normali. [33-‐36] .Fig.1
RAZIONALE PER L’USO DELL’ASCORBATO NELLA LEUCEMIA PROMIELOCITICA ACUTA E NELLE LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE. La leucemia promielocitica acuta (APL) è un forma rara di leucemia acuta con decorso rapido e fatale se non viene prontamente trattata. L'uso dell'Acido trans-‐retinoico, come agente differenziante, ha modificato la prognosi di questa malattia, ma anche l' Arsenico triossido (ATO) nell'ultimo decennio si è imposto come farmaco molto efficace nella terapia delle recidive ed anche in prima linea. L'arsenico triossido (ATO) , da tempo utilizzato con successo nella cura della leucemia acuta promielocitica (APL), farmaco agisce con duplice meccanismo inducendo la differenziazione delle cellule tumorali o la morte cellulare in relazione al dosaggio impiegato. L'azione citotossica dell'ATO sulle cellule di APL è dovuto alla sua azione pro-‐ossidante, un meccanismo analogo a quello esercitato dall' ASC.
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Numerosi dati suggeriscono che l’apoptosi indotta da As2O3 è mediata dalla generazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), in particolare da H2O2 come l'ASC. [37,38,39] Inoltre l’ascorbato sembra facilitare l’apoptosi indotta da As2O3 data la sua capacità di auto ossidazione, che conduce ad elevati livelli intracellulari di H2O2. Per queste analogie di funzionamento la combinazione di As2O3 e ascorbato può essere selettivamente tossica per le cellule cancerose senza produrre gravi effetti tossici sui tessuti normali. L' As2O3 e l’acido ascorbico hanno mostrato attività sinergica nelle HL-‐60 resistenti all’ As2O3 e nelle colture primarie di cellule di leucemia linfatica cronica (CLL), come pure in un modello di linfoma del topo nel quale il trattamento combinato aumentava in maniera significativa la sopravvivenza, mentre quello con solo As2O3 non presenta alcun effetto sulla sopravvivenza. Il Norris Comprehensive Cancer Center ha iniziato una sperimentazione clinica per lo studio degli effetti della combinazione di ascorbato e As2O3 nel trattamento della leucemia mieloide acuta (AML) che non risponde al trattamento o in cui la chemioterapia non può essere effettuata [40] Nel 2009 Yediou & coll. [41] riportano I risultati di uno studio in cui dimostrano che la combinazione di ascorbato e As2O3 riduce in maniera significativa (P < 0.05) la vitalità delle cellule HL-‐60, più di quanto non possa fare l’As2O3 da solo, molto probabilmente perché il trattamento combinato, con ascorbato e As2O3 esercita un doppio effetto, inducendo stress ossidativo e successiva inibizione della proliferazione con induzione di apoptosi. L’aggiunta di ascorbato all’ As2O3 può rivelarsi particolarmente utile per trattare i pazienti con AML intrinsecamente resistenti all’ As2O3, come pure nel superare le resistenze acquisite all’As2O3in pazienti con APL.
SCOPO DELLA RICERCA
Le prove dell’effetto citotossico dell’ascorbato sulle cellule tumorali, esistono da oltre cinquant’anni, anche se molta confusione c’è ancora su ruolo di questa molecola come antitumorale. Di fatto, per comprendere l’azione dell’ascorbato sulle cellule tumorali, è necessario distinguere tra le dosi fisiologiche e quelle farmacologiche, dove, per dosi “fisiologiche” si intendono quelle che possono essere raggiunte per somministrazione orale e che, normalmente, producono livelli plasmatici di ascorbato non superiori a 100 μM, mentre per dosi “farmacologiche” si intendono quelle che possono essere ottenute per somministrazione endovenosa e che, a seconda della dose impiegata, possono condurre a livelli plasmatici nell’ordine delle “millimoli” (dunque, concentrazioni da dieci a cento volte superiori a quelle “fisiologiche”. I dati della letteratura sono più che convincenti nel distinguere tra questi due dosaggi (e modi di somministrazione), in quanto, mentre alle dosi “fisiologiche” l’ascorbato ha una chiara e definita azione antiossidante, a quelle farmacologiche la sua azione è di tipo decisamente pro ossidante. Ferma restando l’esperienza già fatta con le cellule di retinoblastoma umano in linea continua (Y79), che chiaramente dimostrano l’effetto citotossico dell’ascorbato in concentrazioni 3 e 5 mM, nel mezzo di coltura, il presente progetto, sulla base dei dati di letteratura riportati, si propone di estendere la sperimentazione in vitro sulle alte dosi di ascorbato a patologie quali la Leucemia
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Promielocitica Acuta (APL ) ed alle Leucemie acute mieloidi. Queste due neoplasie ematologiche sembrano avere la sensibilità ad entrambi i farmaci capaci di generare la formazione di ROS (inclusa H2O2) all’interno della cellula, con conseguenti danni da ossidazione. Il presente progetto si propone di valutare l'effetto citotossico in vitro e successivamente in vivo dell'ASC ad alto dosaggio, dell'ATO e della combinazione dei due farmaci nella leucemia acuta promielocitica e nella leucemia mieloide acuta . 1° Fase In uno studio comparativo in vitro ci proponiamo di valutare: 1 -‐valutare l'attività citotossica dell'ascorbato a dosi elevate su linee cellulari di LAP e LAM 2-‐ valutare sulle stesse linee l'efficacia dell'ATO 3-‐dimostrare che l'ASC a dosi mM è significativamente più attivo dell'ATO 4-‐ dimostrare che la combinazione dei due farmaci è sinergica 5-‐dimostrare, attraverso test in vitro, il suo meccanismo di azione citotossico e proapoptotico sulle dell'ASC sullecellule leucemiche.
MATERIALI E METODI
Per lo studio vengono usate cellule leucemiche in linea continua derivate da leucemia promielocitica acuta (HL60, NB4 e altre linee cellulari di derivazione mieloide). Le cellule tumorali in linea continua, esposte a dosi crescenti di ASC e ATO, da soli e in combinazione, vengono successivamente analizzate mediante il Trypan Blue Exclusion Test. Questo test consente di contare le cellule morte per effetto citotossico, ma non fornisce dati sulla vitalità e sull’apoptosi. Vitalità e apoptosi possono, al contrario, essere studiate con la tecnica della doppia colorazione nucleare, nella quale i nuclei delle cellule vive vengono colorati da una sostanza fluorescente blu (Hoechst), capace di penetrare attraverso membrane cellulari intatte, mentre i nuclei delle cellule morte vengono colorati con un tracciante rosso (Propridio Ioduro), in grado di attraversare soltanto le membrane delle cellule morte. Dalla combinazione di queste colorazioni, si evince lo stato di vitalità cellulare. Metodi più recenti ed avanzati consentono di effettuare questo tipo di indagine usando la citometria a flusso. In particolare, citofluorimetri a flusso di recente progettazione (MUSE – Merck Millipore), minimo ingombro e rapidità di esecuzione (30 – 60” per test), consentono oggi lo studio della vitalità cellulare e dell’apoptosi su grandi quantitativi di campioni, in tempi molto contenuti e con minima spesa.
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Linee cellulari HL-‐60 (APL) e di LAM coltivate in vitro sono esposte a dose crescenti di ATO e ASC da soli o in combinazione. Il conteggio cellulare viene effettuato manualmente mediante la tecnica del Trypan Blue exclusion test. Il conteggio cellulare e lo studio della vitalità/ apoptosi vengono effettuate in citofluorimetria ( citofluorimetro Muse Merck-‐Millipore) . Le linee cellulari sono coltivate in RPM supplementato da antibiotici, glutammina FBS al 20% a 37°C in 5% CO2 e 95% di aria. ln fase di crescita esponenziale le cellule vengono contate in citofluorimetria e con e con la tecnica de Trypan Blue Exsclusion . Al termine della incubazione le cellule vengono diluite e portate alla concentrazione di 2-‐5x 105/ml. ,in una piastra da 12 o 24 pozzetti ciascuno dei quali contiene 1 ml della sospensione cellulare. Quattro diluizioni di 2,4,6,8 μg/ml di ATO sono usate a partire da una soluzione stock del commercio di 1mg/ml ( TRISENOX), aggiungendo quindi 2,4,6,8 μl di TRISENOX a 1 ml di terreno di coltura contenete 2-‐5x105 cellule. Una soluzione 1M di ASC è preparata per ogni esperimento ed aliquote di 1,3,5,7μl di questa soluzione stock sono aggiunti a quattro differenti pozzetti contenenti terreno di coltura con 2-‐5x105 cellule. ad una concentrazione finale di 1,3,5,7 mM . Aliquote di 1ml di terreno di coltura contenente 2-‐5x105 cellule sono poste in 12 pozzetti con l'aggiunta di quattro concentrazioni differenti di ATO (2,4,6,8 μg/ml) e di ASC ( 1,3,5,7mM). Le cellule vengono incubate per un periodo di 18-‐24h. Un campione di controllo senza farmaci viene allestito in contemporanea. Al temine dell'incubazione viene effettuato il conteggio ed i test di vitalità. Ciascun esperimento sarà ripetuto almeno due volte. I risultati vengono valutati mediante analisi statistica considerando come parametri , la media, l'errore standard, la deviazione standard e l'intervallo di confidenza al 95% (IC95%) della percentuale di cellule viventi al temine di ciascun esperimento. ULTERIORI FASI DI STUDIO 2° fase. Lo studio prevede la sperimentazione dell'ASC e.v. ad alte dosi ,da solo o in combinazione con l'ATO, su topi da esperimento al fine di saggiarne la tossicità in vivo, l'efficacia e la dose massima tollerata. 3° fase. La sperimentazione prevede il trasferimento dell'esperienza su pazienti affetti dalle suddette patologie , secondo le direttive previste dalla good clinical practice, mediante l'impiego di alte dosi di Ascorbato per ev. o in alternativa mediante la somministrazione orale di ascorbato liposomiale.
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Fig.1 (A) Nella reazione 1 l’ascorbato (AscH2) reagisce col ferro ferrico (Fe3+) per produrre ferro ferroso (Fe2+) e radicale ascorbato (Asc.2). Nella reazione 2, la classica reazione di Fenton genera radicale idrossile (OH.) dall’H2O2 (B) Meccanismo proposto per la formazione di radicale ascorbato e H2O2 nel fluido extracellulare, in confronto con il sangue. Dopo somministrazione orale e parenterale, l’acido ascorbico raggiunge concentrazioni equivalenti nel sangue (parte sinistra del diagramma) e nel fluido extracellulare (parte destra). Nel fluido extracellulare, una molecola di acido ascorbico perde un elettrone e forma radicale ascorbato. Questo elettrone, successivamente, riduce un metallo all’interno di una proteina, con riduzione di Fe3+ a Fe2+. Il complesso (Fe-Proteina) dona un elettrone all’Ossigeno molecolare, formando anione superossido (O2.2), con successiva “dismutazione” a H2O2. Nel sangue (lato sinistro), queste reazioni sono smorzate o inibite (frecce segmentate). La comparsa di radicale ascorbato è inibita da proteine riducenti legate alla membrana dei globuli rossi e/o dalle grosse proteine plasmatiche che non si distribuiscono nello spazio extracellulare. Enzimi dei globuli rossi, come la Glutation per ossidasi e la catalasi, distruggono la H2O2 in modo tale che nel sangue non se ne possa trovare. Le identità delle proteine contenenti metalli, sono sconosciute. Reproduced from (59) with permission of The National Academy of Sciences, Washington DC. Bibliografia
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CELL FACTORY A PESCARA Negli ultimi anni la Commissione Europea è intervenuta pesantemente sul tema della manipolazione cellulare estensiva e quindi anche sulla produzione in laboratorio delle CIK cells e delle cellule staminali. È stata introdotta una regolamentazione estremamente restrittiva che equipara a tutti gli effetti le cellule manipolate per uso terapeutico ad un farmaco. Ne consegue che la produzione in laboratorio di tali cellule dovrà essere uniformata alle rigide prescrizioni di una produzione di tipo industriale. Le cellule prodotte dovranno quindi essere necessariamente di grado farmaceutico. Sono stati così messi “fuorilegge” numerosi laboratori, come quello di Pescara, che fabbricavano sperimentalmente cellule per l’immunoterapia e per la medicina rigenerativa. Tali attività sono oggi consentite esclusivamente all’interno di laboratori appositi dotati di “clean rooms” organizzati come piccole officine farmaceutiche denominate “Cell Factory” in grado di operare secondo gli stringenti ed esclusivi requisiti delle “Good Manufacturing Practice” (GMP). La ASL di Pescara, grazie ad un finanziamento iniziale della Regione Abruzzo, ha in corso di allestimento una “Cell Factory”. La consegna del manufatto avverrà nella seconda metà del 2014 a cui seguirà da subito l’inizio dell’attività operativa.
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