RAPPORTO MICRORGANISMO-OSPITE
1. COMMENSALISMO (MICROBIOTI)2. SIMBIOSI MUTUALISTICA
(MICROBIOTI)3. PARASSITISMO (PATOGENI)
POPOLAZIONI MICROBICHE DEL CORPO UMANO
Microrganismi normalmente residenti
MICROBIOTA=FLORA MICROBICA
Quantità di microrganismi presenti in ufc/ml, ufc/g,ufc/cm2
COLON
Stomaco e Duodeno
Digiuno e Ileo
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE
500 SPECIE DIVERSE DI MICRORGANISMI
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che influenzano la composizione del microbiota
VELOCITA’ DEL FLUSSO
PRESENZA DI OSSIGENO
pH
SOSTANZE ANTIMICROBICHE
DIETA
Microbioti del tratto G-I nell’uomo adulto (Log n. batteri/g contenuto) stomaco digiuno ileo colon
AEROBIEnterobatteri 0 – 2 0 – 3 2 – 6 4 – 10Streptococchi 0 – 3 0 – 4 2 – 6 5 – 10Stafilococchi 0 – 2 0 – 3 2 – 5 4 – 7Lattobacilli 0 – 3 0 – 4 2 – 5 6 – 10Miceti 0 – 2 0 – 2 2 – 3 2 – 6ANAEROBIBatteroidi rari 0 – 2 3 – 7 10 – 12Bifidobatteri rari 0 – 3 3 – 5 8 – 12Cocchi rari 0 – 3 2 – 5 8 – 11Clostridi rari rari 2 – 4 6 - 11
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: da dove vengono?
il microbiota intestinale deriva dall’interazione tra ospite e ambiente
Isolauri E. et al, 2004, BP &RCG, 18, 299-313
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Specie più rappresentative
Bifidobatteri
- nel neonato il 90 % dei microbioti è rappresentato da Bifidobatteri;
- nell’individuo adulto i Bifidobatteri costituiscono solo il 50 %
E’ possibile suddividere i microbioti in tre gruppi in relazione al loro comportamento nei riguardi dell’ospite umano :-potenzialmente dannosi : Proteus, Staphylococcus, Clostridi, Veillonella, Prevotella, Candida-indifferenti o benefici: Bacteroides, batteri enterici, Enterococcus. -benefici : Lactobacillus, Eubacterium, Bifidobacterium
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Rapporti con l’ospite
Bifidobatteri
Lattobacilli
Gram positivi,
Anaerobi obbligati
Gram positivi,Anaerobi facoltativi
FUNZIONI NUTRITIVE-METABOLICHE
Sintesi e produzioneMetabolizza
1- vitamine del gruppo B 1- acidi biliari
2- vitamina K 2- farmaci
3- acidi grassi a catena corta(BUTIRRATO, PROPIONATOACETATO)
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?
MICROBIOTI E SISTEMA IMMUNE
1- importante ruolo nello SVILUPPO e OMEOSTASI del sistema immunitario2- produzione di s-IgA 3- mantiene uno stato permanente di INFIAMMAZIONE FISIOLOGICA
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?
Antagonismo con potenziali patogeniMicrobioti Patogeni
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?
Antagonismo con potenziali patogeni
Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens Servin A.L. FEMS Microb. Review , 2004, 28, 405-440
Rapporto Ospite-Microbiota
VANTAGGI PER L’OSPITE
1. Vitamine e fattori nutrizionali
2. Antagonismo con potenziali patogeni
3. Stimolazione del sistema immunitario
VANTAGGI PER I MICROBIOTI
1. Disponibilità di nutrienti
2. Condizioni ambientali ottimali (temp., pH, O2, aw)
SIMBIOSI MUTUALISTICA
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa faremmo senza di essi? Come valutare il microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali
•Studi condotti su animali germ-free (axenici)
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Come valutareil microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali
Colonie di E. coli in agar MC
La maggior parte delle specie batteriche del nostro microbiota intestinale sono scarsamente coltivabili in laboratorio
Metodi molecolari alternativi: 16S rRNA, PCR, FISH ecc.
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Questioni aperte
•Gnotobioti
La funzione della maggior parte dei membri della comunità
microbica è sconosciuta
•Studio della comunità microbica nel suo complesso
•Interazioni tra i microbi e tra i microbi e l’ospite
•STRESS•ANTIBIOTICI•MALATTIE •BATTERI PATOGENI • VIRUS•DIETA
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che modificano la composizione della comunità microbica
CONSEGUENZE di un alterato microbiota intestinale
1. funzioni fisiologiche alterate
2. cattivo assorbimento di nutrienti
3. indebolimento delle difese immunitarie
4. infezioni
5. diarrea o stipsi
Clostridium difficile
MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa succede se si rivoltano contro l’ospite?
Batteri normalmente residenti Condizioni cliniche associate alla
flora microbica normale
PROBIOTICI
1882 - Metchinkoff Primi studi
alta concentrazione di LATTOBACILLI=
MAGGIORE SALUTE E LONGEVITÀ DELL’UOMO
1965 – Lilly e Stillwell Prima definizione:
“… è probiotico qualsiasi sostanza o microrganismo in grado di contribuire
all’equilibrio della flora batterica…”1998 – Salminen
“…PROBIOTICI come MICRORGANISMI vivipresenti nei cibi che hanno un effetto positivo sulla salute umana”
Using probiotics and prebiotics to improve gut health
Tuohy, K.M . et al Drug Discovery Today, 2003, 8 (15), 692-700
Batteri lattici- aggregato Lactobacillus acidophilus:
Lactobacillus gasseriLactobacillus crispatus
Lactobacillus amylovorusLactobacillus gallinarumLactobacillus johnsonii
- aggregato Lactobacillus casei:Lactobacillus paracasei
Lactobacillus rhamnosus- Lactobacillus reuteri
- Lactobacillus salivarius- Lactobacillus plantarum
- Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus- Streptococcus thermophilus
Bifidobatteri:- Bifidobacterium longum- Bifidobacterium bifidum- Bifidobacterium breve
- Bifidobacterium infantis- Bifidobacterium animalis
- Bifidobacterium lactis
Altri microrganismi:- Enterococcus faecium- Propionibacterium spp.
- Saccharomyces boulardi
acido e bile resistenza
sicurezza ed efficacia
difesa della mucosa intestinale;
antagonismo verso batteri patogeni
PROBIOTICI
Caratteristiche
Caratteristiche dei microrganismi probiotici
I microrganismi per essere considerati probiotici devono soddisfare i seguenti requisiti:
•essere di provenienza intestinale. I microrganismi probiotici devono essere normali componenti della microflora dell’intestino
umano in condizioni di salute;•essere assolutamente sicuri per l’impiego nell’uomo senza causare effetti collaterali specialmente in pazienti debilitati o
immunocompromessi;•essere attivi e vitali alle condizioni ambientali che sono presenti
a livello intestinale •essere resistenti ad un basso pH, al succo gastrico, alla bile ed al
succo pancreatico;•essere in grado quindi di persistere, almeno
temporaneamente,nell’intestino umano
Azione patogena dei batteri
Fattori di virulenza
1) Fattori di attacco2) Fattori di invasione e colonizzazione
3) Strategie per sfuggire ai meccanismi di difesadell’ospite
4) Danneggiamento dei tessuti
Rapporto Microrganismo –Ospite
Parassitismo
1) Penetrazione all’interno dell’ospite 2) colonizzazione dei tessuti dell’ospite 3) resistenza ai meccanismi di difesa 4) malattia
PATOGENICITA’ E VIRULENZAPATOGENICITA’ E
VIRULENZA
Malattia infettiva
E’ “LA RISULTANTE” TRA L’AZIONE PATOGENA DEL MICRORGANISMO E LA
RISPOSTA DIFENSIVA DELL’OSPITE
BATTERI ADESINE
Streptococcus pyogenes Proteina F
Streptococcus mutans Glicosil transferasi
Streptococcus salivarius Acidi Lipoteicoici
Streptococcus pneumoniae Proteine di superficie
Staphylococcus aureus Proteine di superficie
Neisseria gonorrhoeae Pili
E. coli Enterotossigeno Pili tipo I
E. Coli Uropatogeno Pili tipo I
Bordetella pertussis Pili
Vibrio cholerae Pili
Treponema pallidum Peptide della membrana esterna
Mycoplasma Proteina di membrana
Fattori di attacco dei batteri alle cellule dei tessuti ospite
Adesione dei batteri ai tessuti dell’ospite
Rapporto tra i batteri patogeni e le cellule dell’ospite
INVASINE BATTERI ATTIVITA
Ialuronidasi Streptococci, staphylococci e clostridi Ac.ialuronico
Collagenasi Clostridium Collagene
Neuraminidasi Vibrio cholerae e Shigella dysenteriae Acido neuraminico
Coagulasi Staphylococcus aureus Fibrinogeno/Fibrina
Chinasi Staphylococci e streptococci Plasminogeno/Plasmina
Leucocidine Staphylococcus aureus Antifagocitaria
Streptolisine Streptococcus pyogenes Antifagocitaria
Emolisine Streptococci, staphylococci e clostridia Fosfolipasi
Lecitinasi Clostridium perfringens lecitine
Fosfolipasi Clostridium perfringens fosfolipidi
Fattori di invasione e colonizzazione
DIFESE COSTITUTIVE
Difese innate, non specifiche,
Pronte per l’uso
DIFESE COSTITUTIVE DELL’OSPITE
1. Barriere anatomiche,ecc.
2. Proteine, peptidi, enzimi antimicrobici
3. Risposta infiammatoria (Fagocitosi)
Fagociti professionalineutrofili
macrofagi
INGLOBARE E DISTRUGGERE I MICRORGANISMI
Fasi della fagocitosi
•RICONOSCIMENTO
•INGESTIONE E FORMAZIONE DEL
FAGOSOMA
•FORMAZIONE DEL FAGOLISOSOMA
•DIGESTIONE
Fase di riconoscimentoFase di riconoscimento
IgG FcR
CR
OPSONIZZAZIONE
OPSONIZZAZIONE
OPSONINA, IgG
Microbo invasore
Recettore FcR
Facilita il processo di riconoscimento
OPSON= SALSA
FRAMMENTO Fc
FAGOCITA
Respiratory BurstEsplosione respiratoria
2O2
- + H2O2
.OH + OH- + 1O2
Glucose +NADP+
G-6-P-dehydrogenase
Pentose-P
+ NADPH
NADPH + O2
Cytochrome b558
NADP++ O2
-
2O2
- + 2H+
Superoxide dismutase
H2O2 + 1O2
Produzione di radicali tossici dell’ossigeno
Esplosione respiratoriaEsplosione respiratoria
H2O2 + O2-2O2
- + 2H+
Superoxide dismutase
H2 O2 + Cl-
myeloperoxidaseOCl- + H2O
H2O + O2-2 H2 O2
catalase
2OCL- + H2O1O2
-+ Cl-+ H2O
Batteri
Caratteristiche delle esotossine
• Natura proteica
• Alto potere immunogeno
• Attività enzimatica
• Azione citotossica (specifica o ampia)
• Azione a “lungo raggio”
• E’ possibile ottenere dei tossoidi
AZIONE TOSSICA DEI BATTERI
TOSSINE
Cholera toxin(A-5B)
Diphtheria toxin (A/B)
Pertussis toxin (A-5B)
E. coli heat-labile toxin LT (A-5B)
E. coli heat stable toxin ST
Shiga toxin (A/5B)
Pseudomonas Exotoxin A (A/B)
Botulinum toxin (A/B)
Tetanus toxin(A/B)
Anthrax toxin LF (A2+B)
Bordetella pertussis AC toxin (A/B) and Bacillus anthracis
Tossina difterica
Prodotta da Corynebacterium diphtheriae
•Tossina di tipo A/B
•Pm 60KDa
•535 aminoacidi
Azione tossica
Interagisce con recettori cellulari
Meccanismo d’azione della tossina difterca
Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite
Basi genetiche e molecolari dei fattori di virulenza
Cromosoma principale
Plasmidi
Batteriofagi
Trasposoni
Fattori di virulenza
Evoluzione patogena dell’Escherichia coli
GENOMICA EVOLUTIVA
E. coli virulento
E. coli non virulento
DNA batterico
DNA batterico
1. Trasferimento genetico.
ConiugazioneTrasduzione
Trasformazione
2. Cambiament
o di virulenza.
Plasmidi
3. Malattie intestinali:
dovute ai geni per i fattori di virulenza
Adesine
Invasine
Enterotossine
Citotossine
Endotossina (LPS)
Endotossina o LPS
Attività tossica dei batteri
ENDOTOSSINE ESOTOSSINE
NATURA CHIMICALipopolisaccaride(mw =
10kDa)Proteine (mw = 50-
1000kDa)
Relazione con la cellula batterica
Parte della membrana esterna Estracellulare, diffusibile
Termoresistenza si no
ANTIGENICITA SI SI
FORMAZIONE DI TOSSOIDI
No SI
POTENZA Relativamente bassa (>100μg) Relativamente alta (1 μg)
SPECIFICITA bassa alta
ATTIVITAENZIMATICA
No solitamente
PIROGENICITA SI occasionalmente
Fattori di virulenza dello Staphylococcus aureus
Siti di infezione e malattie provocate da S. aureus
Staphylococcus aureus è un patogeno molto versatile
PATOGENICITA’ DI S.AUREUS
• Lo S. aureus è causa di lesioni superficiali della pelle quali:
• Impetigine• Ectima• Infezioni dei follicoli dei capelli• Infezione secondaria delle ferite della pelle • Sindrome di desquamazione cutanea da
stafilococco• Sindrome da shock tossico• Scarlattina da stafilococco
Inoltre lo S. aureus è in grado di determinare infezioni più gravi come:
polmonitemastiteflebite
meningiteinfezioni del tratto urinario
osteomieliteendocardite
Lo S. aureus è una causa importante di infezioni ospedaliere;
è anche causa di intossicazioni alimentari dovute al rilascio di enterotossine negli alimenti.
TOSSINE PRODOTTE DA S.AUREUS-tossina: shock settico
β, -tossina: ruolo sconosciuto
-tossina e leucocidina: la prima emolitica, la seconda necrotica
Enterotossine: emesi
TSST-1: shock tossico
ET: sindrome da desquamazione cutanea
Esotossine batteriche
FOLLICOLITE
Colonizzazione: adesine Invasione: Invasine: stafilochinasi
Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidine
Resistenza alla risposta immune: coagulasi Azione tossica: tossine citotossiche (emolisina e leucocidine)
POLMONITE Colonizzzione: adesine
Invasione: Invasine: stafilochinasi, ialuronidasi
Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidina, emolisina, carotenoidi,
superossido-dismutasi, catalasi, crescita a basso pH Resistenza alla resposta immune: coagulasi, variazione antigenica
Azione tossica: Tossine citotossiche (emolisine e leucocidine)
POSSIBILI FATTORI DI VIRULENZA ESPRESSI DURANTE LA PATOGENESI DI ALCUNE INFEZIONI DI Staphylococcus aureus
I POSTULATI DI KOCH
• Alcuni microrganismi patogeni non sono coltivabili• Poiché alcuni patogeni crescono solo in un ospite umano, il
loro studio richiederebbe la sperimentazione sull’uomo• Alcune specie commensali possono avere un ruolo patogeno• ….• …..
Critiche
Chiave molecolare 1. L’inattivazione dei gene o dei geni sospettati del carattere
di virulenza deve fare diminuire la virulenza in modo sostanziale
2. La sostituzione del gene mutato con il gene originario ripristina la virulenza
3. Il gene /i geni per il fattore/fattori di virulenza deve essere espresso durante la patogenesi
4. Gli anticorpi diretti contro il prodotto del gene hanno un’azione protettiva
DIFESA SPECIFICA
CARATTERISTICHE DEL SISTEMA IMMUNITARIO
1.SPECIFICITA’
2.MEMORIA
3.CAPACITA’ DI DISCRIMINARE TRA SELF E NON SELF
NON IMMEDIATAMENTE DISPONIBILE
SISTEMA IMMUNITARIO
Immunità umorale
Immunità cellulo-mediata
LINFOCITI B
LINFOCITI T
Sistema immunitario
Immunità umorale Immunità cellulo-mediata
Linfociti B Plasmacellule
ANTICORPI
Linfociti T
Regolazione
CITOTOSSICITA’
Produzione di Interleuchine
Caratteristiche degli antigeni
1.Alto peso molecolare ( proteine, zuccheri)
2.Complessità chimica
3.Non-self
Molecole o strutture microbiche con caratteristiche antigeniche:
LPS, flagelli, pili, peptidoglicano, capside, esotossine ecc.
Difesa costitutiva Difesa immunitaria
Caratteristiche della difesa costitutiva e della difesa
immunitaria
Caratteristiche della difesa costitutiva e della difesa
immunitaria
Nessuna memoria
Antigene independente
Immediatamente disponibile
Non specifico
Antigene dipendente
Periodo di adattamento
Specifico
Sviluppo di memoria immunitaria
Anatomia del sistema immunitario
Ruolo dei Macrofagi nella risposta immune
I macrofagi sono cellule APC (Antigen Presenting cell)
Macrofagi=APC cellule presentanti l’antigene
IMMUNITA’ CELLULO -MEDIATA
• Linfociti TH (CD4) • Linfociti Tc (CD8): Linfociti citotossici
• distruzione delle cellule infette
• rigetto trapianti• distruzione delle cellule
tumorali
TH1: ATTIVAZIONE DEI
MACROFAGI E DELLE CELLULE NATURAL KILLER
TH2: ATTIVAZIONE
IMMUNITA’ UMORALE
I linfociti T CD8-citotossici- possono interagire direttamente con l’antigene
LINFOCITI T CD8 CITOTOSSICI
ANTICORPIIMMUNITA’ UMORALE
Struttura degli anticorpi
• Catena leggera:– VL & CL
– Catena pesante– VH & CH1 - CH3
(o CH4) CH1
VL
CL
VH
CH2 CH3
Hinge Region
Carbohydrate
Disulfide bond
Regione cerniera
Classi delle Immunoglobuline
• IgG – catene pesanti Gamma
• IgM - catene pesanti Mu
• IgA - catene pesanti Alpha
• IgD - catene pesanti Delta
• IgE - catene pesanti Epsilon
Rapporto tra Struttura/Funzionenegli anticorpi
Fab sito di legame per l’antigene
Sito di legame del
ComplementoSito di legame per i recettori del
frammento Fc Frammento FC
Risposta primaria
Risposta secondaria
Sistema del complemento
Complesso MAC
Membrane Attack
Complex
Citotossicità cellula-mediata anticorpo dipendente ADCC
Superantigene prodotto da S.aureus
Stimolazione incontrollata dei linfocitiT
IMMUNIZZAZIONE
ATTIVA
IMMUNIZZAZIONE
PASSIVA
naturale
artificiale
naturale
artificiale
naturale
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