MEDICINA DI LABORATORIO:
MICROBIOLOGIA CLINICA
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. D’Annunzio” di Chieti-Pescara
tel 0871 541519 (541509)
e-mail: [email protected]
LABORATORIO DI
MICROBIOLOGIA CLINICA
Compito principale della Microbiologia Clinica, nell’ambito
della Medicina di Laboratorio, è quello di porre diagnosi
eziologica, ossia identificare l’agente patogeno
responsabile di una malattia infettiva allo scopo di
suggerire un appropriato trattamento terapeutico.
Altri obiettivi sono:
- valutare l’efficacia della terapia
- valutare la presenza di portatori sani (potenziale fonte
di contagio in comunità)
Il Laboratorio di Microbiologia fornisce:
sostanziale supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione
della patologia da infezione, sia quella sostenuta da patogeni primari (in
soggetti normoreattivi) che quella sostenuta da patogeni opportunisti o
condizionati (in soggetti con difese compromesse)
Diagnosi di laboratorio delle malattie infettive
Esigenza di utilizzare metodologie
scientificamente valide ed eseguibili in tempi
accettabili
Necessità di acquisire in tempi rapidi informazioni utili alla diagnosi ed alla
terapia
La Qualità del servizio diagnostico dipenderà
dall’equilibrio:
Consapevolezza delle urgenti
necessità cliniche
Capacità tecniche
Risorse finanziarie disponibili
FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA
• Rappresenta un momento cruciale nell’ambito del
processo di Laboratorio, durante la quale si compie il
46% degli errori
• Rappresenta un fondamentale momento di
interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate
al processo
• Significa occuparsi di come il laboratorio è in grado di
rispondere ai bisogni di chi vi si rivolge
FASE PRE-ANALITICA in MICROBIOLOGIA
1. Richiesta del Clinico (scelta degli esami)
2. Informazione e Preparazione del Paziente
3. Raccolta del campione
4. Identificazione del campione
5. Trasporto del campione
FASE ANALITICA
Quali strumenti ci possono aiutare a gestire la qualità nella fase pre-analitica?
• Una richiesta congua rispetto al quesito diagnostico (scheda ottica, informazioni varie…..)
• Un campione appropriato alla richiesta e rappresentativo della patologia sulla quale si indaga
• La conformità del prodotto in entrata che si realizza attraverso l’uso di protocolli (istruzioni su esami effettuati, modalità di prelievo, trasporto e conservazione)
Appropriatezza della fase pre-analitica
L’appropriatezza di tutta la fase preanalitica si traduce in maggiore
qualità del servizio diagnostico e maggiore sicurezza dell’operatore
Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo
nell’indagine microbiologica (che ha inizio al letto del malato con la
decisione di richiedere le indagini fino al momento dell’utilizzo dei
referti) ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può
assicurare la piena valorizzazione dell’indagine microbiologica.
Responsabilità del Clinico
• Raccogliere il campione in maniera “corretta”
• Identificare adeguatamente il campione
• Compilare in maniera adeguata il modulo di richiesta
• Inoltrare tempestivamente il campione al Laboratorio o, qualora
non fosse possibile, conservarlo con modalità idonee
Responsabilità del Microbiologo Clinico
• Definire precise linee guida sulle modalità di prelievo,
conservazione e trasporto specifiche per ogni tipo di campione
• Monitorare la loro osservanza e applicazione
• Le tabelle di prelievo e di conservazione dei campioni per
indagini batteriologiche", devono essere utili ai fini di assicurare
la "qualità" dei campioni destinati ad indagini microbiologiche,
con l’obiettivo di qualificare l’indagine microbiologica e il suo
contributo alla cura del paziente.
• Tutti gli operatori assicurano comunque la loro disponibilità a
fornire ulteriori chiarimenti o le indicazioni che, di volta in volta,
si dovessero rendere necessarie, in particolare per:
– indicazioni nella scelta delle indagini,
– modalità di raccolta,
– interpretazione dei risultati,
– informazioni epidemiologiche.
FASE PRE-ANALITICA
1. Richiesta degli esami di laboratorio
• Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica.
• Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato.
• Nella pratica clinica è indispensabile procedere alla:
– inquadramento clinico-epidemiologico dell’infezione
– individuazione dell’organo o degli organi interessati
– formulazione del sospetto diagnostico
– scelta del materiale patologico da inviare al laboratorio
• La limitazione delle risorse economiche già condiziona e condizionerà sempre più in futuro gli interventi medici. Dunque, la valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere tenuta in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso all’ausilio laboratoristico.
FASE PRE-ANALITICA
1. Richiesta degli esami di laboratorio
La richiesta di accertamenti microbiologici è giustificata:
• nella patologia infettiva ad etiologia definita, per diagnosi di forme clinicamente atipiche o iniziali, per la determinazione della sensibilità ai farmaci.
• nelle sindromi polietiologiche, per indicazioni terapeutiche (sempre, se in assenza di specifiche informazioni epidemiologiche).
• nella patologia infettiva del paziente immunocompromesso, per indicazioni terapeutiche (quasi sempre necessarie).
• in ogni caso, per valutazioni epidemiologiche indispensabili per lo studio della circolazione dei microrganismi e la identificazione dei fattori di rischio, l’adozione di idonee misure preventive, la definizione di un corretto approccio diagnostico e terapeutico.
Lo studio della Microbiologia Clinica deve
essere pertanto finalizzato alla:
• Acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilità che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione.
• Valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella eziopatogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacità di esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione - nelle popolazioni microbiche -dei determinanti genetici di resistenza, con acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.
FASE PRE-ANALITICA
2. Informazione e preparazione del Paziente
Il Paziente deve essere adeguatamente istruito sulle corrette
modalità di prelievo, conservazione e trasporto del campione
biologico
Esempio:
Prelievo urine – tecnica del “mitto intermedio”
Prelievo dell’espettorato
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
Campione clinico: materiale biologico da esaminare per verificare
la presenza o assenza di specifici microrganismi patogeni
• Può essere prelevato da:
– siti sterili (sangue, midollo, liquido cefalo-rachidiano (liquor),
liquido pleurico/pericardico/peritoneale/articolare, vie respiratorie
inferiori, urine, tessuti profondi)
• ogni isolamento ha significato eziologico
– siti “contaminati” da flora autoctona (bocca, naso, vie
respiratorie superiori, feci, espettorato, tratto gastro-intestinale,
tratto genitale femminile, terzo distale dell’uretra, cute)
• i risultati vanno interpretati a seconda del caso
• necessaria una richiesta “mirata” del clinico, volta alla ricerca di uno o più specifici patogeni nel contesto dell’abbondante flora contaminante
• Ad ogni campione è associato un potenziale rischio biologico
per la salute degli operatori sanitari
Flora microbica “residente”
Tutte le superfici corporee “esposte” (a contatto con l’ambiente
circostante) (bocca, naso, intestino, cute, vie genitali femminili,
uretra) sono colonizzate da una flora “autoctona”
• Svantaggi
– può contaminare i campioni
– può causare malattia
• Vantaggi
– è in grado di proteggere dalle
infezioni prevenendo la
colonizzazione delle superfici epiteliali da parte dei patogeni
(resistenza alla colonizzazione)
– la riduzione (o rimozione) della flora “normale” mediante impiego di
antibiotici può causare superinfezioni, generalmente sostenute da
microrganismi resistenti
Tipologie di campione clinico
• Campione prelevato da una zona in cui
coesistono patogeni e flora residente
(tampone)
• Campione INDIRETTO: prelevato previo
passaggio in una zona con flora residente
(lavaggio bronco-alveolare)
• Campione DIRETTO: il patogeno è
localizzato in un sito normalmente sterile
ed una barriera (la cute, generalmente)
deve essere superata per la sua raccolta
(liquor, ago-aspirato)
• Campioni INUTILI a fini diagnostici: non
vanno prelevati in quanto non forniscono
alcuna indicazione (vomito, aspirato
gastrico, contenuto intestinale, etc.)
INSERIRE FIG 1/TAB 3 PAG 41 (CEVENINI)
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
L’attendibilità dell’esame batteriologico dipende da vari fattori, tra i
quali molto importante è l’adeguata raccolta (appropriatezza)
del campione.
In particolare, il campione dovrebbe essere:
A. raccolto nel momento giusto;
B. prelevato da un distretto corporeo rappresentativo della
patologia infettiva;
C. prelevato in quantità sufficiente da poter effettuare i tests
diagnostici necessari;
D. raccolto in maniera da evitare contaminazioni.
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
APPROPRIATEZZA del campione: “QUANDO”
A. Il campione dovrebbe essere prelevato nel momento giusto
– nella fase acuta della malattia (carica microbica maggiore)
– prima dell’inizio di una terapia antimicrobica, quando
possibile, o a distanza di almeno 48 h dalla sua sospensione
• gli antibiotici interferiscono con la crescita microbica e
influiscono sull’esito dei test di laboratorio per cui se non
è possibile interrompere il trattamento è necessario
segnalarlo al laboratorio, indicando anche lo schema
terapeutico.
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
APPROPRIATEZZA del campione: “DOVE”
B. Il campione deve essere prelevato da un distretto corporeo
rappresentativo dell’area infetta.
Esempio: La febbre tifoide ha un caratteristico decorso bimodale:
una fase precoce (1° e 2° settimana), caratterizzata da febbre e
costipazione, durante la quale la emocoltura è positiva nel 90-
100% dei casi, mentre la coprocoltura è frequentemente negativa;
una seconda fase (3° settimana), spesso diarroica, durante la
quale Salmonella typhi può essere isolata più frequentemente dalle
feci e con minore frequenza dal sangue.
Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia
naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca
del microrganismo nel sangue durante la 1° e 2° settimana e nelle feci
nella 3° e 4° settimana.
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
APPROPRIATEZZA del campione: “QUANTO”
C. Il campione deve essere prelevato in quantità sufficiente per
poter effettuare i tests diagnostici necessari.
Esempio:
Le batteriemie sono generalmente pauciparassitemiche. La
sensibilità dell’esame emocolturale è, quindi, influenzata dalla
quantità del campione prelevato e dalla frequenza di prelievo (max
3 prelievi/die)
“… Two blood culture sets (10 mL in both aerobic and anerobic
bottles) before administration of antibiotics is 98% sensitive …”
(J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 657-661)
Nel tifo e nella brucellosi la batteriemia è continua e, quindi, il
momento del prelievo è meno critico
FASE PRE-ANALITICA
3. Raccolta del campione clinico
APPROPRIATEZZA del campione: “COME”
D. Il campione deve essere raccolto in maniera da evitare
contaminazioni
Se il prelievo non viene eseguito con modalità rigorosamente
asettiche, altri microorganismi (flora “autoctona”) non responsabili della
patologia potrebbero contaminare i campioni e “falsare” così il risultato
delle indagini microbiologiche
Esempi:
- La ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata a mezzo di un
tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe.
- Nella raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la
contaminazione con la flora vaginale.
FASE PRE-ANALITICA
4. Identificazione del campione
Il contenitore deve essere opportunamente contrassegnato e
confezionato prima del suo trasporto.
I contenitori inviati in laboratorio debbono essere identificati con
l'etichetta riportante il relativo codice a barre ed accompagnati
da un foglio di richiesta indicante:
– Identificativo del paziente (nome, cognome, età, sesso)
– Provenienza anatomica del campione
– Nominativo del prelevatore
– Data ed ora di campionamento (informazione critica !)
– Diagnosi clinica presuntiva
– (eventuale) Schema del trattamento antibiotico in corso
FASE PRE-ANALITICA
5. Trasporto del campione
Al fine di ottenere la massima recovery dei microrganismi, il
campione deve essere trasportato:
in adeguati contenitori sterili, per assicurare la corretta esecuzione delle
indagini microbiologiche e consentire il corretto trasporto e manipolazione dal
campione;
rapidamente: il trasporto del campione frequentemente causa una riduzione
della vitalità dei microrganismi in esso presenti;
in adeguati terreni di trasporto, se necessario (es. tamponi), al fine di
mantenere inalterata la “facies” microbica del campione, conservandone le
caratteristiche possedute al momento del prelievo;
Terreni liquidi o semisolidi (agarizzati)
a temperatura “controllata”:generalmente a +4 C, occasionalmente a
temperatura ambiente
Trasporto in sistemi “dedicati”, come nel caso della ricerca di
germi anaerobi
FASE PRE-ANALITICA
5. Trasporto del campione
L’invio deve inoltre avvenire garantendo la sicurezza nel trasporto
e l’isolamento del campione, per evitare dispersione del materiale
biologico e l’eventuale contaminazione di altri materiali, di
attrezzature e del personale che dovrà manipolare il campione
stesso
– trasportare il campione nelle apposite buste di plastica a due
scomparti: uno per il campione biologico, l’altro per il modulo di
richiesta debitamente compilato
Nel caso in cui fosse impossibile inviare immediatamente il
campione al Laboratorio, la conservazione dello stesso deve
avvenire secondo le indicazioni fornite dal Microbiologo:
– Ad esempio: feci e urine (+4°C per max 6-8 ore)
Qualora ci fosse la necessità di inviare campioni in orario diverso,
è bene prendere accordi con il Laboratorio prima della sua raccolta
ed invio
Criteri per definire un campione “non
idoneo” per una diagnosi microbiologica (non conformità nella fase pre-analitica)
Campione non identificabile:
Modulo di richiesta esame mancante od incompleto
Contenitore impropriamente identificato od anonimo
Campione contaminato da flora orofaringea
Impropria conservazione e/o trasporto (tempo, temperatura,
contenitore)
contenitore non sterile
contenitore non perfettamente chiuso o danneggiato (rischio
biologico per tutti gli operatori: per chi preleva, chi trasporta e chi
analizza il materiale)
trasporto ritardato (urine: > 1h a RT; campioni per gonorrea: >1h
non in terreno di trasporto)
Campione inviato in quantità insufficiente (ricerca micobatteri) o non
idoneo (prelevato in paziente antibiotizzato; saliva vs escreato)
Riflessioni … sulla fase pre-analitica
Il contributo di chi richiede e preleva i campioni alla qualità degli esami
di laboratorio dipende sia dalla consapevolezza del fenomeno che
nella capacità di attenersi a quella serie di norme che permettono di
ridurre al minimo i fattori che possono modificare il risultato finale delle
analisi.
Un campione non idoneo può infatti causare il mancato isolamento del
microorganismo responsabile dell’infezione.
Inoltre, si evitano in tal modo "dispersioni" di germi patogeni, specie
quelli resistenti (MRSA, Pseudomonas spp), che vanno indirettamente
ad incrementare l'incidenza delle infezioni nosocomiali.
Il risultato dell'esame batteriologico sarà qualitativamente valido e più
rapido.
In ultima analisi, gli operatori coinvolti nella fase pre-analitica
sono responsabili della qualità del percorso diagnostico del
paziente … almeno fino all’arrivo del campione in Laboratorio !
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:
A. Esame microscopico (batterioscopico)
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico
• Campioni “a fresco” oppure fissati (al calore o chimicamente)
• La scelta del tipo di microscopia dipende dal patogeno presente:
– microscopia in campo oscuro • il condensatore illumina obliquamente l’oggetto in modo che le
strutture cellulari riflettano la luce verso l’occhio dell’operatore, a differenza dell’ambiente circostante. Ricerca di spirochete (T. pallidum) nelle lesioni cutanee associate alla sifilide.
– microscopia in contrasto di fase • Le differenze nell’indice di rifrazione nei campioni sono convertite in
differenze nella intensità della luce nell’immagine. Consente la visualizzazione di strutture in campioni non colorati (funghi e parassiti, ma anche batteri).
– microscopia in fluorescenza• le molecole fluorescenti assorbono luce ad una e la riemettono ad
una più lunga. Tale differenza viene rilevata dall’impiego di filtri. Utile per l’identificazione di batteri e funghi.
• Spesso si utilizzano colorazioni “dedicate”
– Gram, alcool-acido resistenza (Ziehl Nielsen)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico (“a fresco”)
Si esegue soprattutto per la ricerca di microrganismi difficilmente
colorabili con le tecniche disponibili, evidenziabili invece in
campo oscuro:
– ricerca di Spirochete (Treponema, Borrelia)
– ricerca di Leptospire
Osservazione in campo oscuro: Treponema pallidum
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico (previa colorazione)
• Campioni fissati (al calore o chimicamente)
• Fornisce indicazioni riguardo:
– Idoneità del campione (espettorato: neutrofili / cellule squamose)
– Numero e percentuale di polimorfonucleati neutrofili
– Presenza/assenza di microrganismi (batteri, funghi, parassiti)
• Colorazione del campione con tecnica di Gram:
– morfologia (cocchi, bastoncelli,cocco-bacilli, lanceolata)
– disposizione (catenelle, clusters, diplococchi)
– quantità assoluta di batteri presenti
– percentuale relativa di Gram+ e Gram-
– localizzazione in sede intra- od extra-cellulare
• Specifiche colorazioni:
• colorazione di Ziehl Nielsen (bacilli alcool-acido resistenti)
• verde malachite (endospore batteriche)
• colorazione di Albert (granuli metacromatici o volutina)
• colorazione di Leifson (flagelli)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico previa colorazione
Colorazioni SEMPLICI, che prevedono l’impiego di un solocolorante:
– cristalvioletto
– fucsina basica
– blu di metilene
Colorazioni DIFFERENZIALI, che prevedono l’impiego dipiù di un colorante:
– Colorazione di Gram
– Colorazione di Ziehl-Neelsen
Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (1 di 2)
Partendo da una sospensione batterica (brodocoltura) centro di un vetrino pulito
Se si preleva il materiale (colonie) da terreno agarizzato, aggiungere una goccia di soluzione tampone (PBS) al campione
La fissazione garantisce che: i) il materiale venga
disteso ed essiccato non venga allontanato dal
vetrino nel corso dei successivi lavaggi; ii) le cellule
vengano uccise per coagulazione (sicurezza
biologica e maggiore penetrazione ai coloranti)
Le colorazioni in microbiologiaAllestimento di un preparato (fissazione) (2 di 2)
Aiutandosi con un’ansa, stemperare il campione nel tampone/brodo e stenderlo fino a coprire circa la metà della superficie del vetrino (preparazione dello smear)
Lasciare essiccare il preparato all’aria o forzatamente (bunsen).
Fissare il preparato esponendo il vetrino (lato non contenente il campione) per 4-5 volte direttamente alla fiamma
Hans Christian Joachim Gram
Nato a Copenhagen il
13 Settembre1853.
Batteriologo danese. Nel
1884 mise a punto la
colorazione omonima nel
tentativo di differenziare
Klebsiella pneumoniae
dagli pneumococchi
Colorazione di GramTecnica
1. Fissare gli strisci al calore
2. Coprire con cristalvioletto per 1-2 min
3. Lavare con acqua. Non asciugare
4. Coprire con la soluzione iodio-iodurata di Lugol per 1-2 min
5. Lavare con acqua. Non asciugare
6. Decolorare per 10 sec con alcool-acetone
7. Lavare con acqua. Non asciugare
8. Coprire con safranina (2.5% in alcool 95%) per 1-2 min
9. Lavare con acqua e lasciare asciugare
Colorazione di Gram: colorazione regressiva e differenziale
Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all’interno della cellula. Il decolorante condensa, per disidratazione, la struttura peptidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene “catturato” dalla parete cellulare.
Nei batteri Gram- il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna della parete cellulare, permettendo così il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica.
Colorazione di GramPrincipio
I batteri Gram+ (Staphylococcusspp, Streptococcus spp, etc) appaiono colorati in blu
(Staphylococcus epidermidis)
I batteri Gram- (E. coli, P. aeruginosa, Neisseriaceae, etc.) appaiono colorati in rosso
(Escherichia coli)
Colorazione di GramOsservazione microscopica
Batteri Gram+ possono apparire come Gram- in presenza di colture vecchie, quando morti, od in presenza di danni alla parete per azione di antibiotici
Trichomonas vaginalis (protozoo) è Gram+
Candida albicans (lievito), Aspergillus fumigatus (muffa) sono Gram+
Occasionalmente, anche Mycobacterium tuberculosis è Gram+ (oppure Gram-variabile)
Colorazione di GramCasi particolari
Idoneità del campione da sottoporre a coltura
Diagnosi eziologica presuntiva (suggestiva)
meningiti e polmoniti batteriche, batteriuria, gonorrea ed infezioni piogene
Suggerire la necessità di attuare tecniche di coltivazione “non routinarie”
anaerobi, funghi
Ausilio nella interpretazione dell’esame colturale
angina di Vincent (spirochete, fusobatteri)
paziente antibiotizzato
Informazioni sulla natura dell’infezione
infezioni poli/mono-microbiche
Colorazione di GramUtilità clinica (1 di 2)
Quindi:
La conoscenza del risultato di una colorazione di Gram può salvare una vita !
Tuttavia:
La colorazione di Gram non deve essere effettuata su campioni clinici (feci, escreato) in cui la flora patogena non può essere differenziata da quella commensale
La colorazione di Gram non è utile per la rilevazione di:
Legionella spp. (immunofluorescenza)
bacilli acido-resistenti (micobatteri, Nocardia spp.) (Ziehl-Neelsen)
Colorazione di GramUtilità clinica (2 di 2)
Colorazione di GramL’eccezione
La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i
batteri.
Mycobacterium tuberculosis, M. leprae
incapacità di colorare la cellula per la natura
“cerosa” dell’involucro esterno, altamente
impermeabile ai coloranti
colorazione di Ziehl-Nielsen
Mycobacterium spp.Parete cellulare
Composizione: Grosse quantità di glicolipidi:
acido micolico (60%)
complessi lipidi-arabinogalattani
lipoarabinomannani
Scarso petidoglicano
Funzioni: Condiziona la forma e previene la lisi osmotica
(peptidoglicano)
Inibisce ingresso composti chimici crescita lenta
maggiore resistenza agli agenti chimici
maggiore resistenza alla fagocitosi
Mediante l’acido micolico, induce la sintesi di citochine (TNF- )
Colorazioni:
Ziehl-Neelsen, Kinyoun
Step 1:
versare la fucsina fenicata (fucsina basica in acqua, alcool e fenolo)
Step 2:
fare evaporare il colorante
alla fiamma per 5 min
lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2)
Step 3:
Decolorare (2 min, circa) con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante
Lavare con acqua
Step 4:
Contrastare con blu di metileneper 1-2 min
Lavare con acqua
Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2)
Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono
colorati in rosso
Gli organismi non acido-resistenti risulteranno
colorati in blu
Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica
Le colorazioni in MicrobiologiaColorazioni speciali
La colorazione negativa consiste nella
colorazione di sottofondo con un colorante acido
(nero nigrosina). Viene usata quando un
organismo od una sua struttura non viene colorata
facilmente (esempio, la capsula).
La colorazione delle spore richiede calore per
facilitare la penetrazione del colorante (verde di
malachite, fucsina fenicata) attraverso gli
involucri sporali.
La colorazione dei flagelli impiega un
mordenzante (precipitazione dei sali dell’acido
tannico) per evidenziare la struttura flagellare
altrimenti invisibile (d: 12-30 nm)
Le colorazioni in MicrobiologiaColorazione di flagelli
Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori
(da: Di Bonaventura et al., J. Clin. Microbiol., 1997)
Diagnosi DIRETTA
A. Esame microscopico
Le informazioni desunte dall’esame microscopico possono
consentire una diagnosi presuntiva e, comunque, risultano
importanti per orientare l’iter diagnostico (es. scelta dei terreni
colturali per l’isolamento)
TUTTAVIA:
L’esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche
qualora si esamini:
– un materiale normalmente sterile o comunque proveniente
da zone non in comunicazione con l’esterno (liquido cefalo-
rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale
purulento proveniente da raccolte chiuse)
– un materiale nella cui popolazione batterica “normale” non
siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o
tintoriali del batterio osservato
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA = volta a stabilire la presenza dell’agentepatogeno mediante:
A. Esame microscopico (batterioscopico)
B. Esame colturale (isolamento)
C. Ricerca di antigeni
D. Ricerca di sequenze geniche
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento)
Quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in
sistemi artificiali (in vitro) denominati terreni di coltura.
I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico:
• LIQUIDI (brodo). Composizione del brodo “normale”:
• peptone (digestione parziale di proteine animali) 0,5%
• estratto di carne 0,3%
• NaCl (per rendere isotonico il terreno)
• tampone fosfato (PBS; pH 7,0)
• H2O
• SOLIDI (brodo normale solidificato con agar). L’agar:
• polisaccaride acido (70% agarosio, 30% agaropectina) estratto da
alghe rosse del genere Gelidium
• addizionato al brodo in quantità pari a 1,5-2%
• liquido a temperature 80 C, gelifica a 42-47 C
• non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri
Diagnosi DIRETTA
B. Esame colturale (isolamento)
I terreni di coltura si distinguono in base allo stato chimico:
• Composizione DEFINITA:
• molto costosi, utilizzati esclusivamente per l’identificazione
di batteri con particolari esigenze nutrizionali
• Composizione INDEFINITA:
• contengono sostanze naturali quali peptone, siero, liquido
ascitico, sangue, estratto di lievito etc.
TERRENI DI COLTURA
Terreni minimi
Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali
inorganici, aggiunti in concentrazione nota
Terreni di arricchimento
Caratterizzati dall’aggiunta di:
• sangue
• siero
• estratto di lievito
• infusi di cuore e cervello
• carboidrati
• amminoacidi
Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeniparticolarmente “esigenti” dal punto di vista nutritivo
TERRENI DI COLTURA
Terreni selettivi
Contengono agenti selettivi quali:
• coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica)
• antibiotici, con attività batteriostatica/battericida nei confronti dei
microrganismi “contaminanti” (flora autoctona)
Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si
isolano in campioni contaminati da flora microbica residente
(cute, faringe, naso, intestino, vagina)
TERRENI DI COLTURA
Terreni differenziali
• Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di pH (rosso fenolo, blu
di bromofenolo), che consentono di distinguere tra microrganismi in grado
di fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie
e alla loro morfologia. Esempio: agar sale mannite o terreno di Chapman.
• Contengono sangue (5%, di montone o di cavallo) utilizzato perevidenziare la capacità emolitica di alcuni batteri:
α-emolisi = emolisi parziale, con formazione di un alone verdeintorno alla colonia (degradazione di bilirubina a biliverdina)
β-emolisi = emolisi completa, con formazione di un alonetrasparente intorno alla colonia
γ-emolisi = mancanza di emolisi
TERRENI DI COLTURA
Terreni differenziali
Mannitol Salt Agar (agar sale-mannite, Chapman
agar): terreno selettivo (per gli stafilococchi) e
differenziale (S. aureus fermentante vs
Staphylococcus spp non fermentanti).
Agar sangue (5% sangue di montone) (sheep
blood agar, SBA): evidente β-emolisi.
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
TEMPERATURA
• Psicrofili -10°C a +20°C (L. monocytogenes, 5-8°C)
• Mesofili +10 a +50 C
• Termofili +40 a +70 C
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
OSSIGENO
Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico
Anaerobi facoltativi: crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie
Anaerobi obbligati: crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico
Microaerofili: crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di
ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO2
FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA
BATTERICA
Aerobiobbligati
Aerobi facoltativi
Anaerobi obbligati
Anaerobi facoltativi
Microaerofili
OSSIGENO
CRESCITA IN ANAEROBIOSI
I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido,
depositandosi sul fondo come sedimento.
Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali.
Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici
(tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l’ossigeno
atmosferico fino ad esaurirlo.
Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche
(bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono
umidificate, producono CO2 e H2 e successivamente H2O con scomparsa
dell’ossigeno.
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
pH
– Acidofili:
• crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)
• funghi e lieviti (pH 5 - 6)
– Neutrofili:
• crescono tra pH 6 – 8
• maggior parte dei batteri
– Alcalofili:
• crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)
FATTORI CHE INFLUENZANO LA
CRESCITA BATTERICA
PRESSIONE OSMOTICA
I microrganismi replicano generalmente meglio in un
terreno con concentrazione osmotica più bassa della
propria, in quanto questa condizione permette la
penetrazione dell’acqua all’interno della cellula.
La pressione osmotica del terreno può essere modificata in
base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio
Alofili: crescono ad elevate [saline]
(generalmente 1 M), tollerando elevate
pressioni osmotiche (es. stafilococchi)
CRESCITA BATTERICA
IN TERRENO LIQUIDO
Gran parte dei batteri patogeni ha un tempo di duplicazione
nell’ordine dei 40-60 min. In particolare:
• Escherichia coli (in vitro) 20-30 min
• Escherichia coli (in vivo) 12 ore
• Mycobacterium tuberculosis (in vitro) 18 ore
• Treponema pallidum (in vitro) 33 ore
ISOLAMENTO BATTERICO
E’ necessario tenere conto del sito di provenienza del campione:
• pus
• liquido cefalo rachidiano
• sangue
generalmente contengono un solo tipo di microrganismo
• materiale fecale
• tamponi oro-faringei
• altri materiali biologici
generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al
patogeno o ai patogeni responsabili dell’infezione
ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE
TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN
SUPERFICIE
• Utilizzare terreni solidi (agarizzati) preparati in piastre di Petri
• Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare
al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo
con soluzione fisiologica o brodo sterile)
• Mediante l’utilizzo di una spatola o di un’ansa, distribuire il
materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la
formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e
colonie isolate nell’ultimo tratto
• Successivamente, prelevare sterilmente i batteri di una colonia
isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed
allestire una coltura pura
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA: IDENTIFICAZIONE
Una volta che dal campione biologico si sia verificata, su terrenisolidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate siprocede alla identificazione:
• ID PRESUNTIVA
– caratteri microscopici» colorazioni (forma, organizzazione)
– caratteri macroscopici» aspetto coloniale
• ID FINALE (DEFINITIVA)
– biochimica
– immunologica
– molecolare
ID “presuntiva” dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)
Forma Rilievo
piatto
sopraelevato
convesso
umbonato
sottile, allungatoeffusopuntiforme
circolare
filamentosa
rizoide
irregolare
d < 1 mm
irregolare, a filo intrecciato
irregolare, ramificata
ID “presuntiva” dei microrganismi
Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)
Superficie Margine
intero
ondulato
eroso
filamentoso
arricciato
liscia
radiata
rugosa
concentrica
rilevata ondulata
anelli concentrici
raggrinzita
DIAGNOSI DIRETTA
Identificazione dei microrganismi
1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA
La determinazione di “specie” si basa sulla capacità delmicrorganismo in esame di:
– metabolizzare zuccheri per via ossidativa (via aerobica) o per viafermentativa (via anaerobica)
– produrre specifici enzimi
– produrre specifici prodotti metabolici
Utilizzo di metodi “manuali” od “automatizzati”.
Identificazione possibile in tempi rapidi (4 - 6 h).
ID BIOCHIMICAMetodo manuale: API (BioMérieux) Identification System
Anaerobes (Rapid ID 32 A)
Enterobacteriaceae (ID 32 E)
Gram Negative Rods (ID32 GN)
Staphylococci (ID32 STAPH )
Streptococci (Rapid ID32 STREP)
Yeasts (ID32 C)
La fermentazione degli zuccheri e l’utilizzazione di
altri substrati (ureasi, indolo, gelatina, etc.) viene
evidenziata da un indicatore di pH responsabile
della reazione colorimetrica.
ID BIOCHIMICAMetodo automatizzato: VITEK (BioMérieux)
Gram-positives (GP)
Gram-negatives (GN)
Yeasts (YST)
Bacillus spp. (BCL)
Anaerobes, Corynebacterium (ANC)
Neisseria, Haemophilus (NH)
Due tipologie di card: per la identificazione (30 pozzetti/card contenenti dei substrati biochimici in
forma disidratata) e l’antibiogramma.
Non sono richiesti reagenti addizionali, riducendo così il rischio di omissione o di errore.
Il database del VITEK copre oltre 300 specie sia di origine clinica che industriale.
Possibilità di generare reports statistici epidemiologici (es. frequenza di antibiotico-resistenze)
Identificazione batterica:Flow charts contenenti dati derivanti dall’osservazione
Gram e dai tests biochimici importanti nella
identificazione di specie.
Identificazione dei microrganismi
1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA
Ha come obiettivo finale quello di ricerca ANTIGENI microbicidirettamente nel campione biologico esaminato.
Le tecniche di identificazione sierologica che prevedono l’impiego dianticorpi comprendono:
A. Reazione di agglutinazione
B. Reazione di immunofluorescenza
C. Tecniche immunoenzimatiche (ELISA)
D. Western blot
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICAA. REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE
Agglutinazione su vetrino
Prevede l’impiego di anticorpi, ottenuti in un animale
immunizzato, messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni
solubili
Agglutinazione al lattice (AL)
Utilizzato per evidenziare gli antigeni polisaccaridici della
capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in
grado di legare gli anticorpi in più punti. Per il test si utilizzano
anticorpi legati (adsorbiti) a particelle di lattice (adsorbimento in
fase solida).
Tecniche immunologiche rapide vengono frequentemente
utilizzate per la ricerca di antigeni batterici (S. pneumoniae, H.
influenzae, E. coli, N. meningitidis) nel liquor (o sul suo
centrifugato).
Un campione di fluido cerebrospinale viene
sottoposto a ricerca di Haemophilus
influenzae. Il campione viene mescolato con
una sospensione di particelle di lattice
ricoperte di anticorpi specifici, diretti contro la
capsula di H. influenzae. L’interazione tra
antigene e anticorpi causa un’immediata
agglutinazione di particelle (epifenomeno)
visibile ad occhio nudo.negativo positivo
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA
Il fluorocromo (ad es. fluoresceina) che quando viene eccitato da una
luce ad una certa lunghezza d’onda (UV) emette una luce ad una
lunghezza d’onda maggiore (nel visibile).
I fluorocromi possono essere legati ad anticorpi modificando la loro capacità di legarsi ad uno specifico antigene:
• Anticorpi monoclonali (MAb)
– Prodotti da cellule di ibridoma
– Riconoscono un singolo epitopo
• Due tipi di immunofluorescenza: diretta e indiretta
Il limite della tecnica è rappresentato dalla
necessità di una adeguata consistenza
(concentrazione) del batterio ricercato.
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA B. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA
IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA
Si utilizza un anticorpo coniugato con fluoresceina isotiocianato, che
sia specifico per l’antigene in esame.
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
Si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma non
coniugato, che viene riconosciuto da un secondo anticorpo coniugato
e diretto contro regioni costanti delle immunoglobuline della specie
in cui è stato prodotto il primo anticorpo.
Test con anticorpi fluorescenti per la ricerca e l’identificazione di antigeni microbici (o tessutali) o di anticorpi
diretti contro entrambi. Nel test diretto, l’anticorpo marcato con colorante fluorescente è applicato su una
sezione di tessuto contenente l’antigene, quindi l’anticorpo in eccesso viene lavato e l’anticorpo rimasto
legato viene visualizzato attraverso microscopio a fluorescenza. Nel test indiretto, l’antigene è rilevato
mediante aggiunta di un anticorpo non marcato e successivamente con un anti-anticorpo marcato con una
sostanza fluorescente, che amplifica il segnale (se il primo anticorpo è umano, il secondo anticorpo sarà un
anticorpo contro le immunoglobuline umane, prodotto in una specie diversa da quella umana).
IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
A) Treponema pallidum; B) Chlamydia trachomatis; C) Helicobacter pylori
A B
C
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA C. TEST IMMUNOENZIMATICO
(ELISA: enzyme-linked immunodsorbent assay)
Si ricopre la superficie plastica di un pozzetto (micropiastra) con anticorpispecifici contro l’antigene.
Si aggiunge l’antigene che viene poi evidenziato da anticorpi, anch’essicontro l’antigene ricercato, legati covalentemente ad un enzima(perossidasi, fosfatasi alcalina, -galattosidasi) (sandwich ELISA)
La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche, attraverso lavalutazione dell’intensità del colore prodotto in risposta alla conversioneenzimatica del relativo substrato cromogeno.
La reale concentrazione dell’antigene viene determinata per confronto condiluizioni standard dell’antigene stesso.
ELISA test
Saggio immunologico su fase solida (test immunoenzimatico, ELISA).
(a) L’antigene test e’ aggiunto all’anticorpo-1 in fase solida ed il legame e’ evidenziato
aggiungendo un secondo anticorpo marcato con l’enzima e valutando l’enzima legato (ad
esempio perossidasi o fosfatasi alcalina) attraverso una reazione colorimetrica o
luminometrica. (b) L’anticorpo da saggiare viene aggiunto all’antigene in fase solida ed e’
rilevato aggiungendo un’anti-immunoglobulina marcata con enzima che usa un’anti-
immunoglobulina fluorescente per rilevare l’anticorpo legato.
Il marcatore nei saggi ELISA può essere una sonda fluorescente piuttosto che un enzima.
IDENTIFICAZIONE SIEROLOGICA D. WESTERN BLOT
– Separazione degli antigeni su gel di poliacrilammide in
base al peso molecolare (elettroforesi)
– Trasferimento degli antigeni (bande elettroforetiche) su
membrana di nitrocellulosa
– Incubazione degli antigeni con l’anticorpo specifico
– Esposizione ad un anticorpo secondario (anti-anticorpo
primario) marcato con un enzima (perossidasi)
– La formazione di immunocomplessi (e quindi la
presenza dell’antigene ricercato) viene evidenziata
dall’aggiunta di un substrato sul quale agisce l’enzima,
che provoca la precipitazione di colorante
Identificazione dei microrganismi
1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) colorazione di Gram
colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Identificazione molecolare
Tests molecolari
• Le biotecnologie hanno fornito strumenti diagnostici
molto potenti per:
– la ricerca rapida e l’identificazione di patogeni
umani
– la tipizzazione dei microrganismi a fini
epidemiologici
– la ricerca di microrganismi non coltivabili oppure a
lenta crescita
– la determinazione dell’antibiotico-sensibilità
– l’indagine diagnostica su campioni negativi
all’esame colturale
IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE:
SONDE MOLECOLARI
Sonde specifiche a DNA per geni che identificano uno specifico
patogeno
Le sonde legano il DNA complementare presente nel campione
(ibridazione), indicando la presenza del patogeno
Permettono di individuare anche esigue quantità di acidi nucleici (elevata sensibilità)
La reazione di ibridazione può essere condotta su diverse tipologie di campioni:
– colonie batteriche
– preparazioni di DNA purificato
– campioni clinici
<La digestione del DNA per mezzo di
enzimi di restrizione, seguita da
ibridazione con differenti sonde
geniche genera patterns specie-
specifici (ossia caratteristici di una
specie microbica).
Principali tecniche di ibridazione
degli acidi nucleici
Il DNA target denaturato (singolo filamento) viene direttamente immobilizzato su un
supporto solido (p. es., membrana di nitrocellulosa) ed ibridato con una specifica
sonda a DNA a singolo filamento marcata, per facilitarne la successiva rivelazione
(dot blot). In alternativa, differenti frammenti di DNA con diverso peso possono
essere separati attraverso elettroforesi su gel di agarosio, denaturati e poi trasferiti
su membrane per l’ibridazione con sonda e rilevazione (Southern blot). Se si
utilizzano molecole di RNA separate con elettroforesi si parla di Northern blot.
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI DIRETTA: ANTIBIOGRAMMA
Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, siprocede alla determinazione della sensibilità/resistenzadell’isolato agli antibiotici (antibiogramma).
Tests di antibiotico-sensibilità
Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.
I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.
I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati.
I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.
• MIC (Concentrazione Minima Inibente) è unamisura quantitativa dell’attività di un antibioticoverso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in gradodi inibire la crescita batterica visibile.
• NCCLS (National Committee for ClinicalLaboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).
• Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)
Tests di antibiotico-sensibilità Definizioni
Interpretazione dei risultati
BREAKPOINTS
I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a:
– Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti)
dall’antibiotico
– Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in
vivo (risoluzione del caso clinico)
Sensibilità
Una infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato può essere
trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell’antibiotico
testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica.
Sensibilità Intermedia
Gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e
tessutali di antibiotico per i quali l’efficacia potrebbe essere più
bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa
categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli
antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle
urine) o quando l’antibiotico può essere utilizzato a
concentrazioni più alte di quelle normali ( -lattamici).
Resistenza
Questa categoria predice il possibile fallimento dell’antibiotico
testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali
concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dall’antibiotico in
seguito a somministrazione di dosi normali.
Tecniche per la determinazione
in vitro dell’antibiotico-sensibilita’
• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)
• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)
• Agar diluizione
• Sistemi Automatizzati
ANTIBIOGRAMMAMetodo della brodo diluizione
• Preparare una soluzione madre di antibiotico
• Allestire diluizioni seriali 2-fold dell’antibiotico in brodo Mueller-Hinton
• Preparare un inoculo a DO uguale a 0.125 (0.5 McFarland)
• Seminare ogni diluizione di antibiotico con l’inoculostandardizzato
• Incubare a 37 C per 16-18 ore
• Seminare un pozzetto “controllo” (senza antibiotico)
MC-FARLAND
STANDARDS
• La scala degli standards di Mc-Farland è rappresentata da una serie
di fiale contenenti BaSO4, di opacità differenti, che permettono la
valutazione della densità delle sospensioni batteriche
• La densità di una sospensione batterica è valutata per confronto con
una sospensione di opacità nota contenuta in una fiala dello stesso
diametro
MC-FARLAND
STANDARD
1 La concentrazione batterica varia secondo le dimensioni dei
microrganismi2 I valori corrispondono alle densità ottiche delle sospensioni batteriche
e non a quelle delle particelle di BaSO4
Standard
Concentrazione
batterica 1
x 106
Densità ottica
teorica 2
a 550 nm
0.5
1
2
3
4
5
150
300
600
900
1200
1500
0.125
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Brodo diluizioneNCCLS-breakpoints
Piperacillina 16 32-64 128
Cefazolina 8 16 32
Cefotaxime 8 16-32 64
Cefpodoxime 2 4 8
Imipenem 4 8 16
Vancomicina 4 8-16 32
Gentamicina 4 8 16
ANTIBIOTICO S I R
S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza
Tecniche per la determinazione
in vitro dell’antibiotico-sensibilita’
• Brodo diluizione (micro- e macrometodo)
• Diffusione in agar (Kirby-Bauer)
• Agar diluizione
• Sistemi Automatizzati
ANTIBIOGRAMMATecnica di Kirby-Bauer
• Sospendere 4-5 colonie in 4 ml di brodo
• Incubare a 37 C per 18 ore
• Immergere un tampone nella brodocoltura e scaricarlo contro la paretedella provetta
• Strisciare il tampone sulla piastra in modo uniforme ruotando la piastradi 60
• Applicare i dischi a distanza maggiore di 25 mm dal bordo della piastrae ad distanza tra i centri dei dischi non inferiore a 24 mm
• Capovolgere la piastra ed incubarla a 37 C per 16-18 ore
• Misurare gli aloni di inibizione
Diffusione in agar
(Kirby-Bauer)
1. Allestimento brodocoltura
da coltura pura
2. Semina brodocoltura
3. Apposizione dischetti
antibiotizzati
4. Incubazione (37°C, 18-24h)
5. Misurazione diametro alone
di inibizione
1
2
3
4
5
Attività battericida di un antibiotico
• Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi
• Focolaio di infezione situato in distretti anatomici
difficilmente accessibili all’antibiotico
• Concentrazione Minima Battericida (MBC):
La più bassa concentrazione di antibiotico in grado di
inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1
germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) della
popolazione iniziale.
MBC/MIC – killing quotient
Tasso di uccisione = MBC / MIC
1-4 per antibiotici battericidi
(beta-lattamici, chinoloni)
>4 per antibiotici batteriostatici
(sulfamidici, tetracicline)
DIAGNOSI BATTERIOLOGICA
DIAGNOSI INDIRETTA = volta a rilevare una risposta immuneumorale specifica dell’ospite all’agente infettivo:
A. Reazione di fissazione del Complemento
B. Reazione di agglutinazione
C. Test immunoenzimatico (ELISA)
D. Saggio in immunofluorescenza
E. Saggio radioimmunologico
Diagnosi INDIRETTA
• La diagnosi INDIRETTA è, ovviamente, più tardiva di quella
DIRETTA in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando
si sia sviluppata già la reattività immunitaria dell’ospite. Ciò
non è sempre possibile, come nel caso di pazienti anergici.
• Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico,
pertanto, soltanto quando l’isolamento del microrganismo
sia difficoltoso, fallito, o non possibile.
• L’accertamento indiretto non comportando l’isolamento del
germe, preclude la possibilità di saggiare la sensibilità
dell’agente etiologico verso i farmaci antimicrobici.
Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
PRINCIPIO: capacità del Complemento di legarsi agli immunocomplessi
METODICA:
- il siero del paziente viene “scomplementato” (privato del Complemento) (30 min, 56 C)
- il siero (diluizioni del-) inattivato viene cimentato con l’antigene , in presenza di Complemento “fresco” (di coniglio) aggiunto in quantità nota
- se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene ed il Complemento si lega all’immunocomplesso.
- si aggiunge, quindi, un sistema rivelatore (eritrociti di montone + anticorpi anti-eritrociti di montone):
• se il siero del paziente è positivo (cioè contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti rimangono integri, in quanto il Complemento siè legato al primo immunocomplesso
• se il siero del paziente è negativo (cioè non contiene anticorpi control’antigene) gli eritrociti vengono lisati, in quanto il Complemento si legaall’immunocomplesso eritrocita+anticorpo anti-eritrocita
La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina
Un classico esempio applicativo della FC è la reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide
Nella reazione FC la lisi del globulo rosso indica una reazione negativa, l’assenza di lisi e’ un
test positivo per la presenza di anticorpi.
Questa figura mostra una reazione FC per evidenziare anticorpi verso Coxiella burnetii (agente
eziologico della polmonite atipica). Nella linea superiore usando diluizioni di un siero in fase
acuta, il complemento e’ stato fissato solo nei primi 5 pozzetti (il titolo dell’anticorpo e’ 1/32),
mentre con il siero convalescente nella seconda linea non c’e’ lisi dei globuli rossi per tutte le
diluizioni di siero e quindi il titolo dell’anticorpo e’ uguale o maggiore di 1/512. Questo dimostra
che un aumento di 4 volte nel titolo del siero tra la fase acuta e di convalescenza e’ indicativo
dell’infezione da Coxiella burnetii.
Diagnosi INDIRETTAA. REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
Diagnosi INDIRETTA
B. TEST DI AGGLUTINAZIONE
• L’antigene corpuscolato consiste di una sospensione
di microrganismi, celule (emazie) o particelle uniformi
(lattice) sulle quali siano adsorbiti gli antigeni
• Diluzioni scalari (2-fold) del siero vengono cimentate
con una quantità fissa di antigene
• In presenza di siero positivo, ossia contenete gli
anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi
immuni che risultano visibili
Diagnosi INDIRETTA
B. TEST DI AGGLUTINAZIONE
Titolo anticorpale = reciproco della più
alta diluizione positiva all’agglutinazione
Diagnosi INDIRETTA
C. REAZIONE DI IMMUNOFLUORESCENZA
IF INDIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto ed il siero,
opportunamente diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.
Successivamente si aggiungono anticorpi anti-immunoglobuline umane,
prodotti in animali e coniugati con isotiocianato di fluoresceina.
IF DIRETTA: Sul vetrino viene fissato l’antigene noto marcato con un
fluorocromo (isotiocianato di fluorescina) ed il siero, opportunamente
diluito, viene messo ad incubare con l’antigene.
Se il campione è positivo, all’osservazione al microscopia a fluorescenza
esso risulterà fluorescente grazie alla formazione dell’immunocomplesso
marcato (fluorocromo associato all’antigene).
D. Test immunoenzimatico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)
Si impiega l’antigene fissato su una superficie di plastica (piastra)per catturare e separare l’anticorpo specifico dagli altri anticorpipresenti nel siero del paziente.
L’anticorpo fissato viene poi evidenziato da un anticorpo anti-IgGumane legato covalentemente ad un enzima (perossidasi, fosfatasialcalina, -galattosidasi).
La quantificazione avviene con tecniche spettrofotometriche,attraverso la valutazione dell’intensità del colore prodotto inrisposta alla conversione enzimatica del relativo substratocromogeno.
La reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata perconfronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso
E. SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO
(Radioimmunoassay, RIA)
• Marcatura dell’anticorpo (antigene)
• Rivelazione del corrispondente antigene
(anticorpo)
• Competizione tra molecole marcate e non-
– Un antigene purificato marcato con un
radioisotopo compete con un antigene
standard non marcato per il legame con
l’anticorpo
• Viene misurata la quantità di radioattività
associata all’anticorpo
Top Related