Cinetica enzimatica
Cenni alla cinetica delle reazioniCenni alla cinetica delle reazioni
• Velocita’ di reazione• Reazioni di I° e II° ordine• Molecolarita’ di una reazione• Molecolarita di una reazione• t1/2• Velocita’ e costanti di equilibrio
CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICAOVVERO:
LO STUDIO DELLA VELOCITA’ DI REAZIONE
FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI REAZIONE:
-Concentrazione del substrato
-Concentrazione dell’enzima
-pH
-Temperatura
-Inibitori, Attivatori
-Concentrazione dei Sali (forza ionica)Co ce t a o e de Sa ( o a o ca)
La velocità di una reazione i ti i f i d llenzimatica in funzione della
concentrazione del substratoconcentrazione del substrato
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
Teoria di Michaelis e Menten
Teoria di Briggs e Haldane
(Teoria dello “stato stazionario”)(Teoria dello stato stazionario )
E + S ES E + P
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
E + S ES E + P k1 k2
kDove: k2 = kcat
k-1 e se: k2 ≥ k-1
[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESd[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdtESd
1210 −−−==
[ ] [ ] [ ]ESEE =:conosostituend [ ] [ ] [ ]ESEE −= 0:con osostituend
[ ] [ ][ ]kk
SEES+
= 0 ma poiché: [ ]ESkv cat=[ ][ ]S
kkk
++ −
1
12p [ ]cat
[ ][ ]SEk 0[ ][ ][ ]S
kkk
SEkv cat
++
=−
1
12
0
k1
Questa è l’equazione di Michaelis-Menten, dove:12 kkK −+
1
12
kKM =
Equazione di Michaelis e Menten
[ ][ ]SEkv cat= 0
[ ]SKv
M +=
dove: [ ] max0 VEkcat =
La concentrazione del substrato alla quale max21 Vv =2
è denominata MK , la costante di Michaelis.
Notare che a basse [S] , dove [S] << KM :
[ ][ ]SEk cat [ ][ ]SEK
vM
cat0=
Poiché KS per la dissociazione di [ES] è uguale a si ha: 1
1
kk−
2k
E’ chiaro che quando k 1>> k2 l’equazione si semplifica a:
1
1
2
kkKK SM +=
E chiaro che quando k-1>> k2, l equazione si semplifica a:
SM KK =
[ ][ ]
:che ha si :Se max0 VEkcat =[ ][ ] :cui da max
SKSVv
M +=
[ ]
[ ] [ ]
,S
max
max
SVKS
VvKM =>>
[ ] [ ]
[ ]
, max
V
SK
vKSM
M ×=<<
[ ]2
, maxVvKS M ==
k1 k2
E + S ES E + Pk-1
Dove: k2 = kcat
e: 1
kk− = KS
<< k-1
1k[ ][ ][ ] SKES
SE= [ ]ESkv cat=[ ]ES
[ ] [ ] [ ] :cui da 0 ESEE −=
[ ] [ ][ ][ ]SKSEES
S += 0 e
[ ][ ][ ]SK
SEkvS
cat
+= 0
[ ]SK S + [ ]SKS +
Quest’ultima equazione è uguale a quella iniziale doveQuest ultima equazione è uguale a quella iniziale, dove KM è uguale alla costante di dissociazione del complesso enzima-substrato, KS .p , S
(D.L. Nelson, M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed., W.H. Freeman & Co., 2005)
Dato: [ ]max SVv = [ ][ ]
:reciprociiprendendoSK
vM +
=
[ ]111
:reciprociiprendendo
VSVKM +⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
fi di i k ( d i i i)
[ ] maxmax VSVv ⎟⎠
⎜⎝
Grafico di Lineweaver e Burk (o dei reciproci)
[ ] maxVSvKv M +−=
G fi di E di H f
[ ]S
Grafico di Eadie e Hofstee
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
(A. Fersht, Structure and mechanism in protein science, W.H. Freeman & Co., 1999)
Il significato dei parametri di Michaelis e Menten:g pkcat :
l li i di Mi h li M i i i è l- nel semplice meccanismo di Michaelis e Menten in cui vi è un solo complesso enzima-substrato e tutte gli steps di “binding” sono veloci, kcat è semplicemente la costante di I° ordine per la conversione chimica del complesso ES nel complesso EP;
- (per reazioni più complesse, kcat è una funzione di tutte le costanti di I° ordine e non può essere assegnata a un particolare processo eccetto quando intervengano delle g p p q gsemplificazioni;)
V- , questa quantità è detta anche numero di turnover
perché rappresenta il numero massimo di molecole di substrato [ ]0
max
EVkcat =
p ppconvertite in prodotto per sito attivo nell’unità di tempo (o il numero di volte che l’enzima ‘turns over’ per unità di tempo.
KKM :
sebbene alida per il semplice meccanismo di Michaelis e Menten o in casi in-sebbene valida per il semplice meccanismo di Michaelis e Menten o in casi in cui comunque KM = KS, la vera costante di dissociazione del complesso enzima-substrato, KM può essere considerata in qualche caso come una costante di di i idissociazione apparente.-KM è unica per ogni coppia enzima-substrato. Substrati differenti che reagiscono con uno stesso enzima hanno KM differenti; così come enzimi differenti che agiscono su uno stesso substrato hanno KM differenti.-In reazioni enzimatiche dove esistono più complessi ES, KM rappresenta comunque la quantità di enzima legato sotto qualsiasi forma al substrato.I i i i K è l i d l b ll l-In tutti i casi KM è la concentrazione del substrato alla quale:
maxVv =KM è una costante di dissociazione apparente che può essere considerata come la costante di dissociazione complessiva di tutte le specie di enzima legato.
2v =
kcat/KM:
quando << KM , ES si forma in quantità minima. Di conseguenza,[ ]S[ ] [ ]EE[ ] [ ]
[ ][ ] [ ][ ]SEKk
KSEkv
EE
catcat ×≈=
≈
0
0
In questo caso, kcat/KM è la costante apparente di secondo ordine della reazione enzimatica; la velocità della reazione varia direttamente in
[ ][ ]KK MM
della reazione enzimatica; la velocità della reazione varia direttamente in proporzione a quante volte enzima e substrato si incontrano in soluzione. Questa quantità è quindi una misura dell’efficienza catalitica dell’enzima.Vi è un limite superiore al valore di kcat/KM : esso non può essere più grande di k1, cioè la decomposizione di ES a dare E +P non può avvenire con maggior frequenza di quanto E ed S si uniscono a formare EScon maggior frequenza di quanto E ed S si uniscono a formare ES.Gli enzimi più efficienti hanno valori di kcat/KM prossimi al limite di diffusione di 108 -109 M-1 x sec-1.Praticamente l’enzima catalizza una reazione ogni volta che esso incontra una molecola di substrato.
kcat : numero di micromoli di S convertite in P per secondo da una micromole di enzima operante in condizioni saturanti di Suna micromole di enzima operante in condizioni saturanti di S.
k k k k k k
KS K K’
E + S ES ES’ ES” EP’ EP” E + Pk1 k2 k3 k4 k5 k6
k 1 k 2 k 3 k 4 k 5 k 6k-1 k-2 k-3 k-4 k-5 k-6
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
(D. Voet, J.G. Voet, Biochemistry, 3° ed., John Wiley & Sons, 2004)
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