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TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamentoModena 18-19 novembre 2010

Varianti genomiche di significato incerto: criteri per la caratterizzazione e

l’identificazione delle classi di rischio

V. Calò, A. Russo

TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento

Analisi genetica per la sindrome HBOC

Storia familiare

Paziente con una forte storia familiare

Counseling Oncogenetico

Valutazione del rischio e counseling

• valutazione psicosociale e supporto

• Rischi del counseling

• Educazione

• Discussione del test genetico

IC

Test genetico

Esito test INDETERMINATO INCONCLUSIVO

IC DIAGNOSTICO

POSITIVO


CaOv25

50

75

85%

56%50%

20%

15%

10%

40%

1,6%

Moderato(Familiare)

Alto(Ereditario)

Medio (Sporadico)

CaOv

BRCA1

BRCA2

BRCA1

&

BRCA2

Range di Rischio

Rischio cumulativo di CaM e CaOv a 80 aa

CaM


ANALISI MUTAZIONALE

Campione di sangue periferico

Estrazione del DNA

Amplificazione genica di tutti gli esoni codificanti e delle zone di confine

esone- introne

dHPLC

Sequenziamento

automatico


ANALISI MUTAZIONALE

Campione di sangue periferico

Estrazione del DNA

Amplificazione genica di tutti gli esoni codificanti e delle zone di confine

esone- introne

dHPLC

Sequenziamento

automatico

dHPLC

WT

mutation

polymorphism

DS CAA TAA

Gln Lys


Affected

Female

Male

Death

BC 45

BC 39BC 40BC 50BC 53

BRCA2-R2034C

Esito del test Genetico : risultato INCONCLUSIVO

Famiglia

277Si

risultato INCONCLUSIVO

Variante di significato sconosciuto “incerto”(VUS)


Esito del test genetico: risultato INCONCLUSIVO

INCONCLUSIVOVUS identificata

TEST DIAGNOSTICO probando con forte

storia familiare (criteri HBOC)

Significato clinico

• Predisposizione genetica al CaM/CaO non confermata

• Rischio stimato sulla base della storia personale e familiare

• tutti i membri delle famiglie a rischio potrebbero essere inseriti nei programmi di sorveglianza


• 20-30% dei tests BRCA riportano una VUS;

• Di solito mutazioni missenso ma anche delezioni/inserzioni in-frame emutazioni silenti con possibile effetto sullo splicing;

• Non è prevedibile l’effetto sulla funzione della proteina;

• VUS nuove o rare da interpretare;

• Nella regione codificante del gene o nella regione intronica oppure nelleregioni 5’UTR o 3’UTR;

•Non sono state identificate VUS in entrambi i geni.

Risultato “Criptico”

Esito del test genetico:

risultato INCONCLUSIVO


Missense

Deletions/Insertion in frame

IVS

VUS20-30%

Frameshift

Nonsense

Splice (7%)

Missense (5%)

Rearrangement

Deleterius70/80%

Synonimus

Neutral 5%

Missense

25-30%

Small Insertions/

Deletions 1%

Rearrangements

3-5%

Synonim

3%

IVS

15%

Frameshift

30-40%Nonsense

15-20%

Tipo e frequenza delle mutazioni nei geni BRCA

Significato funzionale

Database BIC (Breast Cancer Information Core), 2007

Walsh et al.JAMA, March 22/29, 2006—Vol 295, No. 12


Una VUS può complicare più che migliorare il processo di valutazione del rischio.

Numero e tipi di parametri utili a studiarle.

Classificazione dei livelli di rischio dei portatori di VUS.

Interpretazione clinica delle VUS


Linee guida per lo studio delle VUS

http://cmgsweb.shared.hosting.zen.co.uk/BPGs/pdfs%20current%20bpgs/UV%20GUIDELINES%20ratified.pdf

Forniscono un set di standards stabiliti per assistere iricercatori nella determinazione del significato clinicodelle VUS nei test genetici


Linee guida per lo studio delle VUS

Greenblatt MS, Hum Mut, 2008

I database locus specifici (LSDB) sono collezioni accurate delle varianti di sequenza in un gene specifico che causa un disordine mendeliano o un cambio fenotipico. (Cotton , 2008)

Lo IARC (Unclassified Genetic Variants Working Group) ha individuato nel BIC database (http://research.nhgri.nih.gov/bic) il catalogo più adeguato per l’interpretazione delle VUS dei geni BRCA.

Dati genetici, epidemiologici, patologici, in vitro e computazionali contribuiscono all’interpretazione delle VUS.(Couch et al., 2008, Goldgard et al., 2008, Hosfra et al., Spurdle et al., 2008, Tavtigian et al., 2008).

Un nuovo progetto di supporto è lo Human Variome Project (HVP).

Obiettivi : 1) standard per costruire i LSDB database,2) validazione, quantizzazione e interpretazione dei dati,3) trasparenza dei dati riportati

http://research.nhgri.nih.gov/bic


Classe Descrizione Strategie di Sorveglianza

1 Non patogenica (nessun significato clinico) p< 0.001

Sorveglianza come da risultato negativo

2 Bassa patogenicicità (Basso significato clinico)0.001< p > 0.049

Sorveglianza come da risultato negativo

3 Significato clinico incerto0.05 < p > 0.949

Strategia scelta in base alla storia familiare ed altri fattori di rischio

4Potenzialmente patogenica

0.95 < p > 0.99

Sorveglianza per pazienti ad alto rischio

5Alta Patogenicità

p>0.99Sorveglianza per

pazienti ad alto rischio

Sistema di classificazione proposto per le VUS

Plon SE , Hum Mut, 2008


Standard di qualità

Lo staff di lavoro dovrebbe avere i requisiti minimi di standard a livello internazionale (ISO 17025 e 15189).

Validazione dell’esecuzione del test di diagnostica molecolare.

Approccio oggettivo alla nomenclatura di tutte le varianti.


Nomenclatura della mutazione

Prima tappa per una corretta interpretazione della variante è la sequenza di riferimento da GeneBank secondo le linee guida della Human Genome Variation Society (HGVS). http://www.hgvs.org/mutnomen/

Nomenclatura stabile, significativa e inequivocabile.

http://www.hgvs.org/mutnomen/

http://www.hgvs.org/mutnomen/


Linee di evidenza

• Letteratura, database di mutazione e di SNPs

• Localizzazione della mutazione all’interno del gene

• Analisi della variante in un gruppo controllo

• Co-presenza di una mutazione deleteria

• Co-segregazione della variante e della malattia all’interno della famiglia

• Presenza varianti de-novo

• Predizione in silico- missenso e effetti di splicing

• Perdita di eterozigosità e dati patologici

• RNA/splicing studies

• Analisi biochimico/funzionale


Letteratura, database di mutazione e di SNP

Database dedicati: HGMD, OMIM, dbSNP/Ensembl, masoprattutto BIC database e per la letteratura PubMED, GoogleScholar oppure Web of Science.

HGMD studia malattie ereditarie. Ogni variante si presenta una sola volta.

OMIM include le varianti di sequenza identificate nel gene di interesse riportando l’autore chela identificata per la prima volta, la frequenza nelle popolazioni, il significato storico, ecc..

dbSNP/Ensemb è un catalogo generale della variazione del genoma in alcune specie e parte delgenoma. Le varianti includono SNP, inserzioni e delezioni, regioni che non variano.


Localizzazione della mutazione all’interno del gene

1 2 3 45 6 7 89 10 11 1415161718 2724

1920 21 22

23 25 26

BRCA1

BRCA2

Solo il 5% delle missenso nel dominio "ring finger" del gene BRCA1 sono patogene.

C

C

C

C

C

HC

C

znzn

III

I

II

C

N

19 20 21

241615131187652

17

18 2223

12 143 9 10

1

Ring domain BRCT domains

P

N C

P P


Analisi della variante in un gruppo controllo

Consente di escludere la patogenicità: se la variante ha una frequenza allelica superiore al 1% può essere considerata una variante polimorfica con significato clinico neutro.

- Omogeneità etnica e numerica della stratificazione del gruppo controllo. Tang TS., 1999

Judkins et al.,Mut Res., 2 005


Co-presenza in trans con una mutazione deleteria

Le VUS identificate in trans con mutazioni patologiche riducono in parte il rischio di malattia.(Hohenstein, 2001)

Tali dati sono relativamente disponibili.

41 VUS del gene BRCA1 furono escluse perché in trans con mutazioni patogene e vennero considerati SNPs di significato clinico neutro.

(Judkins et al.,C anRes, 2005)

Tavtigian S.V. et al, Fam Cancer 2006


Co-segregazione della variante all’interno della famiglia

• Provenienza etnica• Tempo lungo per l’analisi• Eredità poligenica• Penetranza/ espressivià/ fenocopie• Perdita di informazione clinica• Misura piccola della famiglia

Easton D.F. et al Am. J.Hum. Genet 2007Goldgar D.E. et al Am. J.Hum. Genet 2004


Conservazione degli aa tra le specie:varianti missenso

Programmi disponibili di analisi in silico; Clustal, SIFT, Polyphen, Align GVGD etc..

Tavtigian S.V. et al, Hum. Mutat. 2008 Fleming, M.A et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003Ramirez, C.J et al, Oncogene 2004 Abkevich, V. et al, J. Med. Genet. 2004 Spearman, A.D. et al, J. Clin. Oncol. 2008


Effetti di predizione in silico dello splicing

Programmi disponibili dell’analisi in silico: Splicing sequences finder; EMBL

alternative splicing site; Fruitfly etc

www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2 www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html www.umd.be/SSF


Considerazioni sulle IVS

• Tessuto valido e appropiato per lo studio dell’RNA.

• L’espressione biallelica confermata dagli studi in vitro di RNA ne esclude la patogenicità.

• Pochi programmi consentono in base al sito intronico di analizzare la sequenza consensus.

AGGURAGU CTRAYY YYYYYYYYYYYYNCAG5’ 3’

EX1 INTRONE EX2

EX1 EX2 Porzione di un mRNA

SITO DI SPLICING 5’

SITO DI SPLICING 3’

Sito donatore GU

Sito accettore GU

Punto di ramificazione A

Bonatti et al., 2006,Spurdle S. et al., 2008


Perdita di eterozigosità (LOH)

I tumori BRCA-pos. presentano LOH più frequentemente delleforme sporadiche.(Chenevix-Trench, G. et al .,Can Res. 2006; Osorio A. et al., Int.J. Cancer 2002; Osorio A. et al Hum Mut.,2007)

LOH può sostenere la patogenicità della VUS identificata.

Svantaggio: disponibilità del tessuto e incosistenza dell’assenza diLOH.


Dati patologici: tumori BRCA1- e BRCA2-correlati

CaM associato a BRCA1 è spesso ER, PgR e HER2 neg., più spesso basal like, con conte mitotiche alte e alto grado istologico.(Hofstra R.M. et al Hum. Mutat. 2008;; Foulkes W.D. et al J.N.C.I 2003; Turner N. et al Nat. Rev. Cancer 2004)

CaM associati a BRCA2 sono di alto grado, hanno fenotipi luminali e raramente overesprimono HER2.(Spearman A.D. et al J.C.O. 2008; Bane A.L. et al ,Am J. Surg. Pathol. 2007)


Valutazione dei metodi funzionali

I metodi biochimico-funzionali valutano l’impatto dei cambiamentiamminoacidici nelle proteine BRCA1 e BRCA2.

E’ stato necessario sviluppare metodi multipli in funzione dispecifiche funzioni delle proteine in specifici domini.

Svantaggio:

- E’ raro che il laboratorio di diagnostica si occupi di analisi in vitro.

- Sensibilità e specifità dei metodi variano nei studi in vitro.


Metodo funzionale per BRCA1/BRCA2

BRCA1• Metodo dell’attività trascrizionale

• Attività di ubiquitina ligasi BARD1 correlata

BRCA2• Metodo di riparo per ricombinazione omologa

• Amplificazione del centrosoma

Carvalho MA et al., 2007; Couch FJ et al.,2008; Farrugia S et al., 2008)


Valutazione degli effetti funzionali delle VUS

Couch F.J. Et al., Human Mutation, 2008


Sito di allineamento Align-GVGD

Variazione di Grantham (GV)GV=0: posizione è invarianteGV> ~60: sostituzione non conservativa è tollerata

Deviazione di Grantham (GD)GD=0: sostituzione è all’interno del range osservato di variazioneGD> ~60: sostituzione è non-conservativa all’interno del range divariazione

Website http://agvd.iarc.fr

Modelli integrati: Allineamento GVGD

Grantham, R. et al, Science 1974 Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008

Easton, D.F. et al, Am. J. Hum. Genet. 2007

TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamentoTavtigian et al., 2008

Modelli integrati: Allineamento GVGD

o Metodo alternativo e multifattoriale esteso per la classificazione delle VUS (GVGD+AR+ERS)

o migliore stima del rischio genetico

AR= ascertainment ratio Misura del rischio genetico strettamente correlata ad un’ ODDS RATIO ma applicata a varianti rare

ERS= enrichment ratio Correlata a misure della variazione dei codoni, legata a pressione evolutiva selettiva

Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008


Modelli integrati basati sulla combinazione di variabili differenti

Osservazioni epidemiologiche dirette: analisi di cosegregazione,analisi di casi-controllo, storia personale e familiare, copresenza dimalattia e mutazione.

Misure indirette: conservazione dell’aa, severità del cambio aa,evidenze dei metodi funzionali.

Goldgard D.E. et al, Am.J.Hum.Genet. 2004


Modello integrato: VUS Predict

• Allineamento GVGD

• VUS Predict (storia personale, dati patologici, genotipo)

VUS

L22ST37KK45Q Non conservata Neutra

PatogenicaAltamente conservata

Cambi aa patogeni

C39R, C61G, C44S e C44Y

A-GVGD conferma che la sostituzione missenso è patogena

VUS Predict assegna una percentuale in favore dell’effetto deleterio

Sweet K., Senter L. et al , Breast Cancer Res Treat 2010


Il problema delle mutazioni VUS

Non sempre è possibile effettuare tutti gli step per ogni variante.

Tutte le analisi riassumono i risultati e decidono la probabilepatogenicità.

OBIETTIVO: offrire a tutti i pazienti la stessa

qualità di cura!


Giannini G. et al JCO 2008

• Sostituzione non riportata nel BIC;• Allineamento con 9 sequenze ortologhe;• LOH (probando, zie affette da CaM e CaO); non riscontrata nelcampione controllo ;• Tutte queste osservazioni supportano la possibilità che lavariante H1686Q è …... patogena.

BRCA1 5177 T>A; H1686Q


Y179C, F486L, N550H

C. Augello, Ann Oncol. 2006, Judkins ea lMutation Research, 2005, Judkins et al. Cancer Res,2005

VARIANTE

NON

CLASSIFICATA

Aminoacido

WT

Variazione

Aminoacidica

Y179C

F486L

N550Hc

c

c

Caligo M.A. Hum. Mut, 2008


VARIANTI DI SIGNIFICATO CLINICO INCERTO

Variante di

sequenzaEsone NT Codone

Sostituzione

di base

Sostituzione

aminoacidica

Tipo di

Mutazione

N°

Pts

N° volte

in BIC

Y179C 8 655 179 A to G Tyr/Cys M 1 54

A622V 10 2093 622 C to T Ala/Val M 1 1

A521T 11 1680 521 G to A Ala/Thr M 2 2

V740L 11 2337 740 G to C Val/Leu M 1 1

Variante di

sequenza

Eson

eNT Codone

Sostituzione

di base

Sostituzione

aminoacidica

Tipo di

Mutazione

N°

Pts

N° volte

in BIC

A22T 2 292 22 G to A Ala/Thr M 1 0

IVS2-7T>A 3 296-7 - T To A - IVS 1 2

Y42C 3 353 42 A to G Tyr/Cys M 1 141

T200I 7 827 200 C to T Thr/Ile M 1 0

A2466V 14 7625 2466 C to T Ala/Val M 1 48

T3013I 23 9266 3013 C to T Thr/Ile M 1 53

IVS24-16T>C 25 9485 - T to C - IVS 2 6

IVS25-12T>G 26 9484 - T to C - IVS 1 1

BRCA1

BRCA2


Rappresentazione dell’approccio multi-determinanteper la classificazione clinica delle BRCA-VUS

Calò V., et al ., Cancers 2010


Rappresentazione schematica di un possibile metodo di analisi multi-parametrica suggerito

Calò V., et al . Cancers 2010

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