UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA

Mycobacterium spp

Mycobacterium tuberculosis complex

M. canetti

M. tuberculosis

M. africanum

M. microti

M. bovis (classical)

M. caprae

M. pinnipedii

• Aerobio/anaerobio facoltativo;

• Acido/alcool resistenti (parete);

• Cresce molto lentamente (tempo di

replicazione 12-24 h);

• Tutti i membri causano processi

immunopatologici (granuloma) e

sintomi di malattia simili;

99

,9%

id

en

tity

rR

NA

dopo la metà del sec. XIX c’era la convinzione la cura della tubercolosi

poteva avvalersi di particolari ambienti climatici, vita igienica, aria pura,

riposo e opportune diete. I primi sanatori vennero realizzati in zone

montane, in Gran Bretagna, Germania e Svizzera per la cura della

tubercolosi polmonare. Il primo sanatorio realizzato in Italia, all'inizio del

sec. XX, fu opera di un giovane medico, Ausonio Zubiani, e venne creato

nella pineta di Sondalo, in Valtellina.

Testimonianze archeologiche della tubercolosi

• Lesioni ossee in scheletri fossili risalenti a circa 8000 a.C.

• Degenerazioni riconducibili alla tubercolosi in mummie egizie del 2500 a.C.

• Rinvenimento di batteri con caratteristiche simili al M. tuberculosis in lesioni ossee di una mummia di un bimbo inca del 700 a.C.

• Rilevazione di DNA di MTB complex in tessuto osseo di un bisonte estinto, datato 15000 A.C.

4

• Nel XVII secolo e nei primi

anni del 1800 la Tubercolosi è

considerata in Occidente la

principale causa di morte.

• A Londra, nel 1651, è

responsabile del 20% di tutte

le morti.

• Nel 1801 ha un’incidenza di

700 casi su 100.000 abitanti

DROUAIS,The National Gallery

5

marchesa di Pompadour 1721-64

6Chopin Modigliani Moliere Paganini

Amenophis IV Nefertiti Carlo II Napoleone IILuigi XIII AntoinettePoisson

“The Captain among these Men of Death”(“The Life and death of Mr. Badman”, John Bunyan 1628-1688)

E’ una malattia infettiva contagiosa ad

andamento cronico;

Si trasmette da persona a persona per

via aerea;

La forma più comune di Tubercolosi e

l’unica contagiosa è quella polmonare,

caratterizzata da tosse, espettorazione,

emottisi, febbre ed astenia;

Se non trattata, presenta una mortalità

sino al 50%;

Nella maggior parte dei soggetti si

presenta in forma latente

La tubercolosi

7

• Tisi, deperimento, mal sottile, piaga

bianca sono i termini che sono stati usati,

nel corso della storia, per definire la

TUBERCOLOSI . La sua esistenza si

registra da 15000 o 20000 anni ed è

generalmente accettato che il

microorganismo che ne è la causa prenda

origine da altri organismi più primitivi dello

stesso genere

Tubercolosi, scabbia, sifilide Tornano

le malattie della povertà I casi dell'ospedale Gemelli a Roma e della scuola Da

Vinci a Milano fanno emergere un problema serio. Il

contagio parte dall'impossibilità del sistema (a causa dei

tagli) a fare prevenzione nelle classi sociali più deboli. Il

ministero minimizza, ma i medici che lavorano per strada

con i derelitti dicono che il fenomeno è preoccupante

L'allarme del medico di strada:

"Rischio contagio"

Micobatteri

• Bacilli sottili alcol acido resistenti

• Immobili

• Aerobi obbligati

Parete cellulare: ricca di lipidi

• resistenza a fattori ambientali (essicamento)

• tempo di replicazione (12-24 ore)

• caratteristiche di crescita in vitro (colonie visibili dopo 40 gg)

• Antigenicità (componente proteica)

Cell wall

La parete è molto complessa e ricca di lipidi

La struttura della parete è alla base di:

- alcool-acido-resistenza

- lenta crescita

- resistenza a molti detergenti e antibiotici

- proprietà antigeniche (PPDs)

- tendenza alla aggregazione (dimicolyltrealosio)

P

Lip

o-a

rabin

o-m

ann

an

o

Peptidoglicano

P

Arabinogalactano

Glicolipidi di superficie

Acidi micolici

Proteine

Lipidi : 60% del peso secco della parete cellulare

30% del peso secco del corpo batterico.

Acidi micolici e LAM formano le CERE

Proteine: 15% della parete cellulare (attività antigenica,

attivazione della CMI)

PPD: derivato proteico purificato

Nonostante si conoscano circa 100 specie di micobatteri,

più del 95% di tutte le infezioni nell’uomo sono causate

soltanto da 7 specie:

M. tuberculosis

M. leprae

M. avium complex (M. avium, M. intracellulare)

M. kansasii

M. fortuitum

M. chelonae

M. abscessus

Mycobacterium tuberculosis

Bacillo di Koch

Premio Nobel, 1905

Patogenesi

1. Si contrae per via inalatoria ma anche da

2. Cibi contaminati ( es latte non pastorizzato da

animali infetti da tubercolosi bovina

3. Raramente attraverso la cute ( da abrasioni)

Con un colpo di tosse si liberano bacilli e si

calcola che meno di 10 bacilli sono

sufficienti stabilire l’infezione polmonare in

un ospite suscettibile

La possibilità di acquisire l’infezione dipende da:

1.Numero di bacilli presenti nelle secrezioni

respiratore

2.Efficienza dei colpi di tosse

3.Vicinanza con la persona malata

4.Adeguatezza della ventilazione nell’area

• A livello globale si calcola che

• Un terzo della popolazione mondiale è

infetta e

• 30 milioni di persone hanno la malattia

attiva

InfezioneInalazione bacilli tubercolari

lesioni primarie: lobo medio dx; lobo inf. sn)

tubercolosi primaria

asintomatica

sintomatica

Guarigione tubercolosi secondaria (endogena/esogena)

polmonare (apici)

pleurica

tracheo-bronchiale

digestiva

miliare

isolata d’organo

(SNC, rene, app. genitale, ossa)

continuità

ingestione

via ematica

evoluzione

Cronicizzazione

Tubercolosi primaria • Goccioline inalate con micobatteri si depositano negli

alveoli polmonari nei lobi medio e inferiore

• I micobatteri vengono fagocitati ( questa battaglia può

durare giorni o decenni)

• I micobatteri non vengono uccisi e si moltiplicano e

attivano la risposta T helper 1 e termina con l’attivazione

dei macrofagi

• Se la risposta Th è efficiente l’infezione viene controllata

e la malattia guarisce (evidente solo risposta positiva

alla tubercolina)

Inalazione aerosols infetti

fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari

blocco fusione lisosoma-fagosoma (fattore cordale) = patogeni

intracellulari

attivazione risposta immune cellulo-mediata (T CD4+ e CD8+)

Attivazione T CD4+

• produzione di anticorpi (non proteggenti a causa della localizzazione

intracellulare di BK)

• Produzione di IFN-g e IL-2 attivazione dei macrofagi macrofagi

attivati possono fagocitare e uccidere i micobatteri.

Attivazione T CD8+

• Lisi di cellule fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione

Risposta immune specifica

Granuloma

• L’attività della risposta immunitaria si manifesta con una

struttura detta granuloma

costituita da:

• Linfociti

• Macrofagi

• Macrofagi attivati

• Fibroblasti

• Cellule giganti

Granuloma

Se il granuloma si accresce la natura distruttiva della

risposta porta alla necrosi che compare al centro della

lesione ( NECROSI CASEOSA)

• Il granuloma si può risolvere con esito favorevole se la

risposta immunitaria blocca la replica dei Micobatteri e

la lesione si risolve con esito fibrotico

• I micobatteri o muoiono o possono andare incontro a

uno stato di quiescenza

• Quindi si possono avere

• riattivazioni anche dopo molti anni

• La riattivazione si attribuisce a un declino dell’immunità

• I nuovi foci di infezione sono al livello dell’ apice del

polmone con granulomi diffusi e grosse aree di necrosi

caseosa con formazione di una cavità polmonare e

disseminazione bronchiale

• Sembra che la induzione di una massiccia risposta DTH

contribuisca alla natura distruttiva del micobatterio

• Il bacillo persiste vivo nell’organismo del paziente infetto senza che compaiano sintomi.

• Il sistema immunitario è in grado di controllare il batterio ma non riesce ad eliminarlo completamente.

• Le persone con TB latente non sono infettive e non possono trasmettere la malattia.

• Si stima che i soggetti con TB latente abbiano il 5% di probabilità di sviluppare la malattia durante tutto il corso della vita.

• Quando il sistema immunitario, per diverse ragioni, non riesce a contenere la moltiplicazione del bacillo, si sviluppa la TB attiva.

• Alcune persone sviluppano la malattia poche settimane dopo l’infezione, mentre altre possono sviluppare la malattia dopo molti anni in cui l’infezione si presentava in forma latente.

INFEZIONE

INFEZIONE

LATENTETB ATTIVA

(MALATTIA)

30

Tubercolosi: lesione istopatologica specifica

Inalazione bacilli

Infiammazione aspecifica

Richiamo macrofagi alveolari

Attivazione risposta T helper

GRANULOMA

TUBERCOLO

FOCOLAIO DI GHON

COMPLESSO DI GHON

Cellule coinvolte

MACROFAGI (ISTIOCITI, CELLULE EPITELIOIDI, CELLULE GIGANTI DI LANGHANS)

LIFOCITI T CD4+, CD8+

FIBROBLASTI (Tessuto cicatriziale, calcificazioni)

Sensibilizzazione (risposta immune specifica)

zona centrale con materiale necrotico

caseoso (materiale eosinofilico amorfo),

circondata da cellule epitelioidi (istiociti) e

linfociti

tipica cellula di Langhans (nucleo a ferro di

cavallo)

GRANULOMA:

al centro = istiociti-cellule epitelioidi + bacilli tubercolari

In periferia = linfociti, fibroblasti

TUBERCOLO:

Granuloma + necrosi caseosa centrale

TUBERCOLO

FOCOLAIO DI GHON

lesione grigio-biancastra di 1-1.5 cm (espressione macroscopica del

granuloma o tubercolo)

COMPLESSO DI GHON (= complesso primario o di Ranke)

Evoluzione possibile del focolatio di Ghon, con interessamento dei

linfonodi peribronchiali o tracheobronchiali

.

Visibile all’esame radiografico

Tali lesioni possono andare incontro a calcificazioni

o fibrosi (accrescimento del tessuto connettivo)

(da Anton Ghon (1866-1936), a Czech pathologist)

Tubercolosi: evoluzione delle lesioni

Guarigione:

cicatrizazione

calcificazione

Lesioni evolutive: necrosi tissutale (caseificazione)

caverne tubercolari

superinfezione delle caverne (Aspergillus sp)

lesioni per diffusione per contiguità

lesioni per diffusione ematogena

con/senza bacilli vivi all’interno

Necrosi o caverne

Evoluzione: NECROSI CASEOSA

Necrosi caseosa

Fibroblasti

Necrosi

Cellule

polmonari

Infezione latenteImmunopatologia

Sviluppo risposta immunitaria specifica.

Formazione del granuloma

Riattivazione

90-95%

5%

5%

In circa il 20-50%

delle persone

esposte si

sviluppa

l’infezione.

Circa il 50%

delle

persone

esposte NON

si infetta.

37

Infezione

Inalazione bacilli tubercolari

lesioni primarie: lobo medio dx; lobo sup sn (sede inf.); lobo inf. sn (sede sup)

tubercolosi primaria

asintomatica

sintomatica

Guarigione tubercolosi secondaria (endogena/esogena)

polmonare (apici)

pleurica

tracheo-bronchiale

digestiva

miliare

isolata d’organo

(SNC, rene, app. genitale, ossa)

continuità

ingestione

via ematica

evoluzione

Cronicizzazione

Tubercolo, focolaio di Ghon, complesso di Ghon

Necrosi caseosa, caverne

40

CELLULAR IMMUNE

RESPONSE

MYCOBACTERIAL INFECTIONS

Deficit immunitari:InfezioneTerapia (Cortisone)Povertà

I fattori che interferiscono con lo sviluppo di una risposta immunitaria (cellulare) favoriscono le patologie

causate da micobatteri.

Gli individui sieropositivi per il virus HIV presentano un rischio 113 volte più elevato rispetto ai sieronegativi di sviluppare una Tubercolosi conclamata, mentre per quelli con AIDS conclamato è di 170 volte superiore;

Epidemiologia

• Serbatoio: uomo con TBC aperta

• Trasmissione: inalazione di aerosol

• Soggetti a rischio: contatti di pz, tossicodipendenti,

senzatetto, alcolizzati, carcerati, pz AIDS

La TBC primaria può evolvere in:

A) Guarigione, spesso con calcificazione, senza

distribuzione. Lo sviluppo della CMI è mostrata

con il test di Mantoux positivo.

• PPD> a 10mm.

B) TBC primaria progressiva:

Si può sviluppare da una

distribuzione locale attraverso

il polmone e diffondersi fino alle pleure.

C) TBC miliare: distribuzione: linfa--> sangue

--> reni, cervello,

o può rimanere senza sintomi, passare al

successivo stadio latente.

Clinica

• TBC primaria in immunocompetente : per di più asintomatica o paucisintomatica (febbre e malessere)

• TBC primaria in persone a rischio: TBC polmonare progressiva primaria (febbre, tosse, espettorazione, emottisi, dispnea)

TBC secondaria (= post primaria): tosse cronica, espettorazione, emottisi, febbre, dispnea, dolore toracico, anoressia, dimagrimento, consunzione

TBC extrapolmonare: può colpire vari organi e apparati: linfonodi 25%, pleura 20%, tratto genito-urinario 15%, ossa 10%, meningi 5%.

TBC miliare: piccole lesioni a forma di seme di miglio, che si diffondonorapidamente dai polmoni ai visceri

Diagnosi

Esame microscopico

Esame colturale

Test molecolari

Immunodiagnosi

Il Mycobacterium tuberculosis

• non si colora con la colorazione diGRAM

e

• non cresce nei normali terreni di coltura

quindi…..

….occorre richiedere specificamente la

ricerca di BK !

Esame microscopico: tutte le

colorazioni sfruttano la ALCOOL

ACIDO RESISTENZA

evidenziazione BAAR (bacilli alcool

acido resistenti = AFB)

Ziehl-Neelsen (carbolfucsina a caldo)

colorazioni

utilizzate:

fucsina fenicata(scaldare il vetrino fino

ad evaporazione ma senza lasciarlo

seccare).

decolorare con la soluzione di alcool-

acido per circa 2 minuti, fino a quando

non scompare il colorante.

eseguire la colorazione di contrasto con

blu di metilene per 1-2 minuti.

risciacquare, scolare e seccare all'aria per

1-2 minuti.

esaminare al MICROSCOPIO

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Ziehl Neelsen

micobatteri = batteri rossi in campo blu

BAAR: bacilli alcool acido resistenti

Valutazione Ziehl-Neelsen(Kent and Kubuka, 1985, CDC)

BAAR/campi

0 / 300

1-2 / 300

1-9 / 100

1-9 / 10

1-9 / 1

> 9 / 1

Referto

Negativo per BAAR

Dubbio: ripetizione

Positivo per BAAR + - - -

Positivo per BAAR + + - -

Positivo per BAAR + + + -

Positivo per BAAR + + + +

si leggono 300 campi a 1000 ingrandimenti

L’esame microscopico non fornisce alcuna

informazione riguardo alla vitalità dei

micobatteri osservati: in pazienti in terapia è

possibile il reperto di esame microscopico

positivo ed esame colturale negativo

)

… inoltre …

Esame colturale

Sensibilità: 10 – 100 BAAR/ml campione biologico

Decontaminazione

Fluidificazione

Semina in terreni solidi

Semina in terreni liquidi

Esame colturale

Decontaminazione:

NaOH al 10%

Fluidificazione:

N-acetilcisteina

Terreni solidi

A base di uovo:

Lowenstein-JensenPetragnani

Sintetici (agarizzati):

Middlebrook 7H10 -7H11

altre componenti:asparagina, verde malachite, glicerolo

Terreni solidi

• crescita lenta e/o difficile ( 37°C)

colonie secche rugose gialle

• rilevazione colture miste

• analisi morfologia colonie

• determinazione carica

Identificazione

IDENTIFICAZIONE

uso di sonde

oligonucleotidiche:

Sequenziamento

genomico

Morfologia delle colonie

Prove biochimiche

TRADIZIONALE MOLECOLARE

Identificazione molecolare

Si basa su:

presenza nel genoma di sequenze

nucleotidiche altamente conservate

specie-specifiche

uso di sonde oligonucleotidiche: breve sequenze di

nucleotidi complementari alla sequenza target

Immunodiagnosi

test alla tubercolina

Tubercolina è costituita da proteine liberate

nel terreno di coltura e un derivato

proteico purificato della tubercolina

è utilizzato per il test cutaneo

ELISPOT per IFN-g

Test della tubercolina = intradermoreazione di Mantoux

n.b.: PPD, Purified Proteic Derivative

PPD 0,1 mg = 5UT per via intadermica

valutazione della reazione dopo 48 h

misurazione del diametro della lesione (infiltrato =

nodulo)

Positivo

Tubercolosi attiva

Infezione latente

Esposizione recente a M. tuberculosis

Esposizione a micobatteri ambientali

Vaccinazione con BCG

Test alla tubercolina

IFN-g

T

T

T T

T

T

ELISA

QuantiFERON®-TB GOLD Test

3 antigeni: ESAT-6, CFP-10, TB7.7

Terapia, profilassi, controllo

Isoniazide rifampicina

pirazinamide

etambutolo

(per 9 mesi, 2 volte a

settimana)

Chemioprofilassi:

isoniazide (per 1

anno).

Prevenzione, Trattamento e Controllo

Mycobacterium tuberculosis

Nel 1908 A. Calmette e C.

Guerin selezionano, dopo 231

passaggi continui su patata

biliata (13 anni), un ceppo di

M. bovis attenuato per la

virulenza che costituisce

ancora l’unico vaccino anti-TB

231 passaggi

M. bovis

78

IL VACCINO BCG

• Nel 1921 il primo bambino

è stato vaccinato con BCG;

• L’OMS suggerisce l’immunizzazione

con BCG subito dopo la nascita in tutti

le regioni ad alta endemia di TB;

• Efficace contro le forme di meningiti

tubercolari e TB miliare nei bambini

• Ogni anno oltre 120 milioni di

persone ricevono BCG, in oltre 200

nazioni;

• Si stima che 3 miliardi di persone al

mondo siano vaccinate con BCG; 79

Immunoprofilassi:

Vaccino a germi vivi ed attenuati, BCG

(Bacillo di Calmette e Gueren, M. bovis attenuato su

patata glicerinata e biliata).

Controllare dopo la vaccinazione il PPD.

Prevenzione, Trattamento e Controllo

Problema attuale:

ceppi MDRTB (multidrug resistant TB)resistenti a Isoniazide e Rifampicina

e soprattutto XDRTB (extensively multidrug resistant TB)resistenti a Isoniazide e Rifampicina +

chinolonici (kanamicina, amikacina)

N.B:

81Comstock G.W. (1988) Identification of an effective vaccine

against tuberculosis. Amer Rev Respir Dis 138:479-480

• Elevata variabilità

nell’attività protettiva in

aree geografiche

differenti;

• BCG non protegge nei

confronti della TB

negli adulti;

Livelli di protezione indotta da BCG negli

adulti

82

TB ATTIVA

TB LATENTE

TUBERCOLOSI NEL MONDO

Ogni giorno:

125.000 persone si infettano con M. tuberculosis

27000 persone si ammalano di TB attiva;

circa 5000 muoiono di TB.

300,000 persone si infettano ogni anno con ceppi MDR-TB

83