Università degli Studi di Napoli “Federico II”

PhD Thesis in

Novel Technologies for Materials, Sensors and Imaging

XXII cycle

Single Photon Counting X-Ray Micro-Imaging

of Biological Samples

Paola Maria Frallicciardi

Supervisor:

Prof. Paolo Russo

Academic Year 2009–2010

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Sintesi Tesi di Dottorato:

“Single Photon Counting X-Ray Micro-Imaging of Biological Samples”

Questa tesi verte su applicazioni di micro-imaging planare, real-time e sulla tecnica della

tomografia computerizzata (computed tomography, CT), su campioni biologici, in vivo e

post-mortem. In particolare, si confrontano due rivelatori di raggi X il cui funzionamento si basa su

differenti tecnologie di rivelazione della radiazione, per applicazioni di imaging biologico: un

rivelatore a conteggio di singolo fotone (single photon counting, SPC) e un rivelatore flat panel

(FP) ad integrazione di carica.

La motivazione per un tale studio nasce da quelli che sono i potenziali vantaggi della

tecnologia a conteggio di singolo fotone. Infatti, questa modalità di rivelazione consente un

efficiente abbattimento del rumore elettronico, un rigetto degli eventi di scattering e l’immunità

dagli effetti di afterglow tipici dei rivelatori con sensore scintillatore, e questo grazie alla presenza

di uno schema di read-out capace di discriminare fotoni con energia superiore ad una soglia

impostata. Ciò significa che, durante l’esposizione, il segnale cresce ma non il rumore, portando ad

eccellenti valori dei parametri che valutano la qualità dell’immagine, come il rapporto

segnale-rumore (signal-to-noise ratio, SNR) e il rapporto contrasto-rumore (contrast-to-noise ratio,

CNR). Nella tecnologia di conteggio di singolo fotone, ciascun fotone interagente è contato come

singolo evento, indipendentemente dalla sua energia, così che ai fotoni di bassa energia è attribuito

un peso uguale che a quelli di alta energia. Questo si traduce in un alto contrasto (C) anche per

oggetti poco attenuanti, come tessuti molli presenti in un organismo o piccoli campioni biologici.

Al contrario, i rivelatori ad integrazione di carica (e i flat panel come esponenti di questa classe di

rivelatori) integrano sia il segnale che il rumore e ai fotoni di energia maggiore si attribuisce un

peso superiore. Questi fotoni “duri”, d’altro canto, contribuiscono di meno alla rivelabilità (SNR) e

alla visibilità (C) dei campioni a basso contrasto dal momento che l’attenuazione di un materiale,

generalmente, diminuisce all’aumentare del’energia.

Dunque, scopo della tesi è, in primo luogo, di dimostrare la possibilità di un imaging a raggi

X, di elevata qualità, sia planare che tomografico, oltre che real-time, con particolare interesse per

piccoli campioni biologici, utilizzando un rivelatore con tecnologia a SPC. Dal momento che questa

tecnologia può vedersi come alternativa ai più largamente utilizzati sistemi ad integrazione di

carica, è stato realizzato un confronto con un flat panel, in termini di alcuni parametri di qualità

dell’immagine (SNR, C, CNR), per applicazioni su campioni biologici.

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L’attività di ricerca è stata portata avanti in collaborazione con l’Istituto di Fisica

Sperimentale Applicata (Institute of Experimental and Applied Physics, IEAP) della Czech

Technical University (CTU) di Praga (Repubblica Ceca).

In fig. 1 sono mostrate due fotografie dei sistemi radiografici/tomografici utilizzati: quello

presente presso lo IEAP - dotato di tubo radiogeno con microfocus di 5 µm e anodo in tungsteno – e

quello realizzato presso il laboratorio di Fisica Medica del Dipartimento di Scienze Fisiche di

Napoli – provvisto di tubo radiogeno con mini-fuoco di 35 µm e anodo in molibdeno. Il rivelatore

digitale a conteggio di singolo fotone utilizzato è un rivelatore sperimentale, sviluppato presso il

CERN di Ginevra, della serie Medipix2 (www.cern.ch/medipix), impiegante un sensore di silicio

suddiviso in 256x256 pixel quadrati di area 55x55 µm2, spesso 300 µm. Ciascuna cella dei pixel di

questo rivelatore è dotata di un contatore a 13 bit, un amplificatore e un discriminatore a doppia

soglia. La scelta della soglia energetica (o, anche, della finestra energetica) in cui lavorare evita il

conteggio di falsi segnali e di eventi indesiderati e la presenza di un discriminatore in ogni pixel

riduce l’influenza del rumore. Il rivelatore ad integrazione di energia, utilizzato pereffettuare un

confronto, è, invece, un rivelatore indiretto flat-panel, accoppiato con uno strato scintillatore di

CsI:Tl e dotato di un array di fotodiodi (CMOS) realizzato da 2240x2344 pixels quadrati di lato

pari a 55 µm, per un’area sensibile di 120x120 mm2.

Figura 1 (a) Sistema per microtomografia presente presso lo IEAP costituito da un tubo radiogeno con microfuoco (5 µm @ 4 W), un alloggiamento per il campione, un disco girevole in cui sono posizionati fogli di Al per la calibrazione STC - segnale/spessore - che equalizzi la risposta dei pixels del rivelatore e il rivelatore (Medipix2 nella foto). Campione e rivelatore possono essere spostati nelle tre direzioni, attraverso motori controllati da un software dedicato. Il campione, inoltre, ha possibilità di rotazione, per consentire acquisizioni tomografiche. Durante le misure effettuate la distanza sorgente-rivelatore è stata mantenuta al valore di 62 cm. (b) Sistema per microtomografia assemblato presso il laboratorio di Fisica Medica del Dipartimento di Scienze Fisiche di Napoli, costituito da un tubo radiogeno con microfuoco (35 µm), un alloggiamento per il campione e il rivelatore (Medipix2 nella foto). Campione e rivelatore possono essere spostati nelle due direzioni x-y, attraverso motori controllati manualmente o da un software dedicato. Il campione, inoltre, ha possibilità di rotazione, per consentire acquisizioni tomografiche. La distanza sorgente-rivelatore è stata mantenuta al valore di 35.2 cm nel sistema con Medipix2 e di 35.9 cm nel sistema con il flat-panel.

Relativamente alla qualità delle immagini, è stato, inoltre, testato un algoritmo di

equalizzazione della risposta dei pixel del rivelatore, la calibrazione segnale-spessore

a b

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(signal to-thickness calibration, STC)1 che consiste nel calibrare la risposta dei singoli pixels del

rivelatore, valutando la dipendenza dei conteggi registrati da ciascuno di essi dallo spessore di un

certo materiale attraversato dal fascio. I risultati ottenuti applicando tale algoritmo sono stati

confrontati con la ben nota tecnica della correzione di flat field (flat field correction, FFC)

tipicamente usata nello X-ray imaging. Il confronto è stato realizzato utilizzando entrambi i

rivelatori. I campioni scelti per lo studio sono sia fantocci simulanti tessuti umani a diversa

attenuazione sia piccoli animali (in vivo ed ex-vivo). In tutti i casi studiati, la nuova tecnica di

correzione delle immagini risulta in una superiore qualità dell’immagine radiografica e nella

completa correzione degli artefatti da beam hardening nelle immagini tomografiche, rispetto alla

tecnica comune di FFC.

Nella prima fase di lavoro è stato utilizzato il rivelatore Medipix2 SPC per l’acquisizione di

immagini planari di insetti, piante, semi, etc., raggiungendo un livello di risoluzione spaziale di

circa 4 µm ed un’elevata qualità di immagine. Dettagli anatomici di piccole dimensioni come il

sistema di respirazione, la struttura delle antenne e la peluria sul corpo di insetti, o la struttura di

canali di una foglia provvista di stomata sono stati visualizzati in altissimo dettaglio sfruttando la

tecnica del contrasto di fase. Infatti, le favorevoli condizioni sperimentali – 5 µm di spot focale,

l’ottima geometria sorgente-campione e campione-rivelatore e la piccola dimensione del pixel del

rivelatore (55µm) – hanno reso osservabili gli effetti di fase che aumentano il contrasto ai bordi e

alle interfacce di oggetti a diverso indice di rifrazione seppure a simile attenuazione.

In fig. 2(a) è mostrata la radiografia di una formica ad elevato contrasto realizzata con

Medipix2 in regime di phase contrast. Nel profilo orizzontale di fig. 3(c), valutato sulla regione

evidenziata nel dettaglio di fig. 2(b), si distinguono chiaramente l’over-shooting e l’under-shooting

in corrispondenza delle frange di diffrazione presenti ai bordi del campione.

Il breve tempo di read-out di Medipix2, l’elevato rate di acquisizione (100 kHz count-rate

per pixel) e la possibilità di impostare in modo arbitrario il tempo di acquisizione, rende Medipix2

adatto per imaging real-time di campioni in movimento ad un ragionevole frame-rate di pochi

frames per secondo. Questo rivelatore rappresenta uno strumento non invasivo per indagini in-vivo

sulla vita di piccoli insetti e consente agli entomologi di seguire un campione biologico attraverso il

suo completo processo evolutivo per studi longitudinali. Come esempio di imaging real-time

in-vivo, sono state acquisite immagini planari di un parassita vivo, in movimento nel suo ambiente

naturale (il corpo del suo ospite), con un frame-rate di 2 frames/s, con elevata risoluzione di

contrasto.

1 La Signal-to-Counts Correction (STC) è stata implementata dal gruppo di Fisica Sperimentale e Applicata dello IEAP (J. Jakubek, NIM - A, vol. 576, 223-234, 2007).

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(a) (b) (c)

Figura 2 Radiografia in contrasto di fase realizzata con Medipix2 di una formica (a), di un dettaglio della testa (b) in cui è chiaramente visibile la presenza di frange chiare e scure che risaltano il contorno; (c) profilo orizzontale relativo alla regione evidenziata nel dettaglio. L’asse delle ordinate è una scala in spessori equivalenti: in ciascun pixel è riportato lo spessore del materiale utilizzato per la calibrazione STC che dà luogo alla stessa attenuazione dovuta al campione (mm), ottenuta dalla STC. Ingrandimento M = 9.1x; corrente del tubo I = 200 µA; tensione del tubo V = 40 kV; tempo di acquisizione Tacq = 100 s.

Inoltre, una serie di immagini planari, acquisite in differenti periodi di tempo, mostra il

campione vivente in diversi stadi della sua evoluzione naturale, dallo stadio di pupa a quello di

insetto adulto, rendendo chiaramente visibili i cambiamenti morfologici nell’anatomia del corpo

dell’animale (fig. 3 a-d).

(a) (b) (c) (d) Figura 3 Immagini sequenziali dell'evoluzione di un parassita all'interno del suo ospite (una cameraria ohridella). Il parassita si nutre delle strutture interne del suo ospite (a) fino a svuotarlo completamente uccidendolo (b). La sua forma si allunga e si assottiglia con il passare dei giorni (c), fino alla completa metamorfosi in insetto adulto (d).

Inoltre, è stato effettuato micro-imaging 3D a raggi X per visualizzare il parassita vivo

all’interno del suo ospite. La microtomografia è stata realizzata ricostruendo, mediante l’algoritmo

iterativo OSEM (Ordered Subset Expectation Maximization), 180 proiezioni acquisite su 180°,

ognuna per un tempo di 10 s. Il voxel di ricostruzione ha le dimensioni di 17x17x21 µm3. In fig. 4 è

mostrata una fettina sagittale del campione biologico.

La risoluzioni spaziale e di contrasto ottenute, sia in immagini 2D che 3D, si può ritenere

adeguata a rivelare i principali cambiamenti morfologici nella anatomia esterna, così come per

l’osservazione di strutture interne nell’anatomia di piccoli insetti e campioni organici. Le dinamiche

dei processi biologici, così come l’evoluzione e la metamorfosi, possono essere seguite in maniera

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soddisfacente. La possibilità di imaging tomografico consente sia il taglio virtuale del campione in

fettine tomografiche bidimensionali sia una visualizzazione completa del modello tridimensionale

per indagini non invasive.

Figura 4 Fettina tomografica sagittale di un insetto fillominatore (cameraria ohridella) al cui interno vive un parassita. Il voxel ha dimensioni di 17x17x21 µm3, l’ingrandimento M nelle proiezioni planari è di 3.1x. La ricostruzione è stata realizzata con l’algoritmo iterativo OSEM, utilizzando 180 proiezioni da 10 s su 180°. Tensione del tubo V = 40 kVp, corrente del tubo I = 250 µA.

I risultati ottenuti con la tecnologia di SPC sono confrontabili con quelli raggiunti con i

moderni sistemi ad integrazione di energia che si servono di grandi strutture quali i sincrotroni, ma,

in aggiunta, consentono indagini di routine altamente sensibili in semplici laboratori.

Il confronto rivelatore SPC/rivelatore flat panel è stato realizzato, in termini di qualità delle

immagini, sia su radiografie (2D) sia su tomografie (3D), utilizzando e fantocci e campioni

biologici nelle stesse condizioni sperimentali (geometria, energia del fascio X, esposizione, etc.), e

mostra, in tutti i casi studiati, una performance superiore del rivelatore a conteggio di singolo fotone

rispetto al rivelatore flat panel. Si è osservato che la tecnica di SPC abbassa significativamente le

fluttuazioni nel segnale, permettendo una superiore qualità di immagine in un ampio range di

attenuazioni e per basse energie dei raggi X (voltaggio del tubo radiogeno impostato a 40 kVp),

come si usa nell’imaging biologico.

Riassumendo i risultati ottenuti, si può credere che un rivelatore basato su tecnologia a

conteggio di singolo fotone consenta imaging a raggi X di elevata qualità. Oltre a ciò, la qualità

dell’immagine ottenuta risulta superiore se confrontata con un rivelatore flat panel ad integrazione

di carica, per imaging planare e tomografico.