Dove? Quale funzione? Con chi?

Approcci genomici: Profili di espressione genica (Microarray). Location analysis (ChIP on chip e ChIP-Seq).

Fattori trascrizionali (2500 nei mammiferi). Cofattori. Modificazioni istoniche. Modificazioni dei fattori trascrizionali Modificazioni dei cofattori

cloni di DNA in piastre

-amplificazione tramite PCR -purificazione -fissaggio su vetrino

RNA da popolazione 1

RNA da popolazione 2

-trascrizione inversa -marcatura con fluorofori dei rispettivi cDNA

ibridazione sul vetrino

(procedure robotizzate)

laser 1 laser 2

eccitazione

emissione

scansione nei due canali

-combinazione e analisi d’immagine -analisi bioinformatica

Il chip Affymetrix© -migliaia di oligonucleotidi(PM) (e corrispondentimismatch (MM))sintetizzati sul chip -ogni gene e’ rappresentato da un set di 11-16 oligonucleotidi (probe set) PM+MM

preparazione del campione da ibridare (cRNA biotinilato)

immagine della scansione del chip (monocolore)

Analisi PCR di siti CCAAT

Fissaggio delle cellule con formaldeide

Rottura della cromatina per sonicazione

IP con anticorpo anti-NF-Y

Eliminazione dei legami covalenti

Precipitazione dei frammenti di DNA

Immunoprecipitazione della cromatina - ChIP

1254 1600 3000

400

α-NF-Y

α-C

tl

input

hnRNPA1

NF-YA

1

2

3

4

5

6

X z

y

X

Ibridizazione su vetrino

Precipitazione dei frammenti di DNA

ChIP on chip

5 X z

y

Ligazione di linkers 7

400 1254

X z

y

Ampificazione per PCR X

z

y

8

Isole CpG (Frammenti genomici)

Promotori (Frammenti PCR)

Cromosomi (Oligonucloetidi)

Marcatura Cy3/Cy5 9

10

Analisi genomica dei siti di interazione

11

The CCAAT box is a frequent promoter element.

TFx

TF1 TF2

TATA CCAAT

TFy

INR

-100 -30

DPE

YC YC

YB YB + YB

YC YC YB

In vitro binding: strong (Kd 10-11) and specific.

C. Romier

ChIP on chip

H3-ac

H3-K4-m3

NF-Y

Pol II

mRNA

H3-ac

H3-K4-m3

NF-Y

Pol II

mRNA

20

40

60

80

100

NF-Y+

20

40

60

80

100

H3K4me3-

NF-Y+

H3K9-14ac+

H3K4me3+

NF-Y+

H3K4me3+

NF-Y+

H3K9-14ac+ NF-Y+

NF-Y+

H3K4me3-

NF-Y+

H3K9-14ac+

H3K4me3+

NF-Y+

H3K4me3+

NF-Y+

H3K9-14ac+ NF-Y+

Promoters

Genes

% T

otal

%

Tot

al

P A

Correlation between NF-Y, histone marks and expression

HeLa S3 cells 59% P 31% A

tss

ACTIVE CHROMATIN CONTEXT REPRESSIVE CHROMATIN CONTEXT

K9Ac K4me3

NF-Y

K20me3 K27me3

NF-Y

tss

THE MOLECULAR MACHINERY FOR H3K4me3 & H3K79me2 REQUIRES H2B K120 MONOUBIQUITINATION

CCAAT H2B

NF - Y The image cann

CCAAT H2B

CCAAT

H2B

NF - Y NF - Y The image cann NF - NF - NF-Y -

Ub Ub

RAD6,E3??

CCAAT NF - Y Ub CCAAT NF - Y Ub

MLL/SET K4m3

Ub Ub

K79m2 DOT1L

CCAAT NF - Y Ub

hBRE1

CCAAT NF - Y Ub

hBRE1

hBRE1 hBRE1 Ub Ub

TFs GENOME PROMOTERS PROMOTERS WITH NF-Y PSFM SCORE>0.8 %

NF-Y 21747 5493 25.26

PROMOTERS ( -500 +100 ) PROMOTERS WITH NF-Y PSFM SCORE>0.8 % p-VALUE

E2F1 6102 2183 35.78 5.11E-106

NANOG 343 163 47.52 9.61E-020

KLF4 2966 900 30.34 6.52E-012

SOX2 178 78 43.82 2.07E-008

ESRRB 1240 383 30.89 1.76E-006

OCT4 660 193 29.24 8.07E-003

CTCF 1308 301 23.01 9.72E-001

STAT3 320 101 31.56 4.35E-003

SALL4 1940 368 18.97 2.00E-000

NF-Y Matrix is enriched in the targets of ESC “core” TFs

Chen X. et al. Cell. 2008 Jun 13;133(6):1106-17

PubMed PSFM ChIP on chip PSFM

1)

NF-YB

NF-YA

NF-YC

NANOG

SOX2 OCT4

L S

50 37

KLF4

SALL4

A growing network of TFs in ESC.

Targets???

Different isoforms have different expression patternsn and transcriptional activities.

ΔNp63α is essential for keratinocyte growth “potential” (Stemness?).

KO mice have defects in stratified epithelia and limb development.

AEC and EEC patients have defects in skin, ectrodactily and cleft lip and palate.

Skin development and differentiation

Biological process Molecular function

Cellular component

1 2 3 4

Gene Set Analysis Toolkit http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt

1159 gene id

biological process

development 141 genes P=7.8e-3

heart development 7 genes P=2.16e-3

intracellular signaling cascade 93 genes P=3e-3

I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade 152 genes P=6.52e-3

response to DNA damage 26 genes P=9.72e-3

steroid hormone receptor activity 8 genes P=9.33e-3

regulation of cell cycle 43 genes P=6.29e-3

transcription 179 genes P=1.06e-4

RNA processing 39 genes P=5.63e-3

RNA splicing 19 genes P=9.32e-3

cellular process

signal transduction

physiological process

metabolism

response to stimulus

molecular function

receptor activity

ACTL6A

SMARCA4

CEBPβ

RUNX1 SP1

CITED2

TFAP2A

CLOCK

PCAF

IRF1

LEF1

ALX4

NOTCH1

SMAD7

MTA2

TP53

CHD4

NR4A2

RARβ

SUPT3H

TWIST1

HOXA5

MEIS1

HOXD13

RB1

PRDM2

ZEB1

RREB1

PML

CCNT1

HHEX

RERE

ZMYND8

E2F5

HEXIM1

CHAF1A

E4F1

SMAD9 GTF2H3

GTF2H4

ING4

PPARδ

TAF5L

PLAGL1

SMARCD2

GTF2A1

p63

C/EBPβ/δ

NOTCH1

SMAD7 LEF1 SALL4

PPARδ/α

p53

RB1 E2F5

terminal differentiation

growth/differentiation

TGFb and WNT signaling stemness

permeability barrier wound healing

cell cycle

response to DNA damage

Carol Imbriano

DSBB U. Milano Roberto Mantovani

Giacomo Donati

Michele Ceribelli (U. Modena) Valentina Basile

Serena Borrelli

Claudia Forni

Raffaella Gatta

Diletta Dolfini

Mario Minuzzo

Giulio Pavesi

NF-Y

Silvia Pozzi Nicoletta Cordani

Daniele Merico Bioinformatics

p63

FUS-CHOP

Andrea Fossati

Alessandra Viganò

Federico Zambelli