Trattamenti conservativi in oncologia

ginecologica, qualità di vita e desiderio di salute

“Crioconservazione dei gameti e

del tessuto ovarico”

L. Gianaroli, S. Resta, M.C. Magli, A.P. Ferraretti

S.I.S.Me.R. - Unità di Medicina della Riproduzione - Bologna

www.iiarg.com www.sismer.it

Declino della fertilità femminile in relazione all’età

Lobo et al., Potential options for preservation of fertility in women, N Engl J Med 2005, 353: 64-73

La fertilità femminile può essere

compromessa da qualunque trattamento

che:

diminuisca il n° di follicoli primordiali

colpisca l’equilibrio ormonale

interferisca col funzionamento delle

ovaie, delle tube, dell’utero e della

cervice.

Indicazioni femminili e maschili alla preservazione

della fertilita’

Neoplasie

genitali o gonadiche

del sistema ematopoietico (LMC, LMA, LLA, Linfoma Hodgkin e non Hodgkin)

solide giovanili

Malattie

autoimmuni

LES

A. Reumatoide

Gromerulonefrite acuta

Malattia di Bechet

Altro

Anomalie cromosomiche (delezioni, Sindrome di Turner, Klinefelter)

Endometriosi

Cisti ovariche ricorrenti

“Social freezing”

Neoplasie

Le nuove strategie antitumorali

hanno portato negli ultimi anni ad

un aumento della sopravvivenza

media nelle giovani donne affette

da neoplasie ginecologiche e non,

ponendo l’attenzione sugli effetti

a lungo termine delle terapie

onco-soppressive e sulla qualità

di vita delle pazienti dopo il

trattamento.

Preservazione della fertilita’: indicazioni oncologiche

Età

Condizione ovarica

Tipo di patologia oncologica

Tipo di chemioterapia/radioterapia

Dosi e numero di cicli effettuati

Preservazione della fertilita’ femminile:

tossicita’ dei trattamenti oncologici

Early Menopause and Infertility

Ovarian Reserve ⇩⇩⇩

Primordial Follicle Count ⇩⇩⇩

• La probabilità stimata di

menopausa precoce è di circa il

25% a 30 anni.

Letourneau et al., Acute ovarian failure underestimates age-specific

reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy

for cancer, Cancer 2012, 118: 1933-9

• Danno diretto alle ovaie

• Danno all’asse ipotalamico-pituitario

• Dose dipendente

• Età dipendente

• Dipendente dalla zona irradiata

• Può anche colpire la funzione uterina

Chemioterapia Radioterapia

Preservazione della fertilita’ femminile:

tossicita’ dei trattamenti oncologici

AGENTI FARMACI MECCANISMI D’AZIONE

Alchilanti

Ciclofosfammide,

Mostarde Azotate,

Chloroethyl nitrosurea,

Melfalan, Tiotepa.

Si intercalano nei filamenti di DNA, interrompono la

sintesi di RNA e proteine.

Cisplatino e

analoghi

Cisplatino,

Carboplatino.

Interferiscono con la sintesi di DNA ma non con

quella di RNA e proteine

Alcaloidi della Vinca

(induttori di

aneuploidie)

Vincristina, Vinblastina. Si legano alla tubulina e causano dissociazione

dell’apparato dei microtubuli

Antimetaboliti

Metotressato,

Aminopiridina,

5-Fluorouracile,

Citarabina.

Agiscono come falsi substrati nelle reazioni di

sintesi del DNA e dell’RNA.

Inibitori delle

Topoisomerasi

(Radiomimetics)

Bleomicina,

Actinomicina,

Doxorubicina,

Daunorubicina

Interagiscono con il complesso DNA-enzima,

impedendo la rottura dei filamenti single strands di

DNA mediati dalla topoisomerasi I.

Nuovi agenti Paclitaxel. Agiscono sui microtubuli

Meccanismi d’azione dei farmaci antitumorali

Jeruss JS, Woodruff TK, Preservation of fertility in patients with cancer, N Engl J Med, 2009; 360: 902-11

Opzioni per la preservazione della fertilita’

Preservazione della fertilità maschile

Preservazione della fertilità maschile

Liquido seminale

Spermatozoi

Prelievo epididimario (MESA)

Prelievo testicolare (TESA)

Biopsia testicolare (TESE)

Prospettive future: liofilizzazione

epididimo

testicolo

Prelievo del fluido seminale dall’epididimo

M.E.S.A/TE.S.A

Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration

Testicular Sperm Aspiration

Prelievo di una minima quantità di tessuto

testicolare

TE.S.E.

Testicular Sperm Extraction

Liofilizzazione

Kusakabe et al., Mouse and human spermatozoa can be freeze-dried without damaging their chromosomes, Hum Reprod 2008, 23:233-239

Il cariotipo non

mostrava aberrazioni

numeriche o strutturali.

Il processo di liofilizzazione non causa danno ai cromosomi spermatici.

Spermatozoi reidratati da

2 donatori sono stati

iniettati in ovociti

enucleati di topo.

I cromosomi degli spermatozoi

sono stati analizzati alla prima

divisione dello zigote.

La maggior parte aveva una

costituzione normale.

Liofilizzazione vs congelamento

30 campioni di sperma

Conta

Motilità

Morfologia

Vitalità

Frammentazione DNA

Birifrangenza

Due aliquote per ciascun campione

Criopreservazione in

N2 liquido

Liofilizzazione

Lo scopo dello studio era di confrontare la liofilizzazione con la

tecnica consolidata del congelamento in azoto liquido.

Gianaroli et al., DNA integrity is maintained after freeze-drying of human spermatozoa, Fert Stert 2012, 97: 1067-1073

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Motilità Vitalità

fresco

Reidratato

Scongelato

Gianaroli et al., DNA integrity is maintained after freeze-drying of human spermatozoa, Fert Stert 2012, 97: 1067-1073

%

Conta/ ml

62±44 x 106

48±29 x 106

55±31 x 106

a

a

b

b

Nessuna variazione significativa nella conta

Calo significativo nella motilità e vitalità spermatica dopo lo scongelamento

Nessuna motilità, nè vitalità dopo la reidratazione.

abP<0.001

Liofilizzazione vs congelamento

Liofilizzazione

- Sebbene la vitalità degli spermatozoi e la loro motilità siano totalmente

compromesse dopo la liofilizzazione, la struttura della cromatina

spermatica non è alterata rispetto al campione fresco. A differenza del

congelameto in azoto liquido, la procedura non altera l’integrità del DNA.

-Le caratteristiche di birifrangenza sono per lo più ben conservate negli

spermatozoi reidratati , suggerendo che le strutture protoplasmatiche

delle teste degli spermatozoi non siano alterate. Al contrario, la

proporzione di cellule spermatiche con una birifrangenza anomala della

testa aumenta incredibilmente dopo lo scongelamento.

- La conservazione dell’integrità del DNA, che risulta superiore in

confronto con la crioconservazione in azoto liquido, spinge a considerare

un’applicazione clinica della liofilizzazione.

Gonado-protezione ormonale (e.g. analoghi GnRH)

– L’efficacia della protezione delle gonadi attraverso la manipolazione ormonale è stata valutata solo in studi molto piccoli riguardanti pazienti oncologici maschi.

– L’evidenza suggerisce che la terapia ormonale negli uomini non è efficace nel preservare la fertilità qualora siano stati sottoposti a chemioterapia altamente sterilizzante.

Meistrich ML, Shetty G, Hormonal suppression for fertility preservation in males and females, Reproduction 2008, 136: 691-701

...alternative

Potenziali opzioni future (non ancora testate nell’uomo)

– Crioconservazione del tessuto testicolare e re-impianto

– Innesto di testicolo in topi SCID

Jahnukainen K, Stukenborg JB, Clinical review: Present and future prospects of male fertility preservation for children and adolescents,

J Clin Endocrinol Metab 2012, 97: 4341-51

Jahnukainen et al., Autologous ectopic grafting of cryopreserved testicular tissue preserves the fertility of prepubescent monkeys that

receive sterilizing cytotoxic therapy, Cancer Res 2012, 72: 5174-8

Preservazione della fertilità femminile

Crioconservazione di ovociti

L’azione protettiva del crioprotettore dipende:

dal tempo di esposizione al crioprotettore

(deve essere abbastanza lungo da permettere una sufficiente disidratazione della cellula ma non troppo dal momento che si può alterare il pH intracellulare)

dalla temperatura alla quale avviene l’esposizione

(la cellula è esposta inizialmente a basse concentrazioni di crioprotettore a T ambiente in modo da creare il giusto gradiente di concentrazione che da inizio alla deidratazione e ad un ingresso più lento del crioprotettore stesso)

dallo stadio maturativo dell’ ovocita

Lo scopo dei crioprotettori è ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio che

possono danneggiare in maniera irreversibile le strutture citoplasmatiche e

di membrana

Criopreservazione di ovociti – possibili danni

Zona pellucida hardening

Polar body degeneration/fusion

Membrane permeability

Oocyte ageing

Meiotic spindle depolymerization

Cytoplasmic and Cytoskeletron damage

Impact on oocyte physiology

Congelamento lento

Le metodiche utilizzate per crioconservare gli ovociti si dividono in:

Vitrificazione

Utilizzo del crioprotettore PROH

Richiede un congelatore

programmabile

Tempo necessario circa 2 ore

Tecnica ormai consolidata

Utilizzo dei crioprotettori DMSO e Etilen

Glicole ad alta concentrazione

Non richiede uno strumento specifico

Tempo necessario circa 15 minuti a

supporto (in genere 2-3 ovociti)

Metodica relativamente recente

Crioconservazione di ovociti

La prima gravidanza al mondo ottenuta da un ovocita

congelato con protocollo di vitrificazione venne riportata

presso il S.I.S.Me.R. nel 1999 (Kuleshova et al., 1999)

Il tempo ottimale di congelamento è tra 39 e 40 ore dopo

la somministrazione dell’ hCG.

Accanto all’ottimizzazione del

protocollo di congelamento degli

ovociti, è stato dimostrato che il

tempo che intercorre tra la

somministrazione dell’ hCG e il

congelamento degli ovociti gioca

un ruolo fondamentale nello

sviluppo embrionale e nel

successo della gravidanza

(S.I.S.Me.R.)

Fattori importanti per la crioconservazione di ovociti

Ferraretti et al., Factors affecting thawed oocyte viability suggest a customized policy of embryo transfer, Fert Steril 2010, 94: 1308-1313

Ovociti scongelati hanno comunque minor probabilità di essere fertilizzati e

svilupparsi in zigoti di buona qualità e, conseguentemente, in embrioni

rispetto ad ovociti freschi, indipendentemente dall’età della paziente.

I ridotti tassi di fertilizzazione e di

cleavage che si osservano negli

ovociti congelati rispetto ai freschi

suggeriscono che, sebbene gli ovociti

sopravvivano allo scongelamento, il

processo di congelamento lento ha un

impatto negativo sul potenziale di

sviluppo dell’ovocita stesso.

Ovociti congelati PROH vs freschi

Magli et al., Impact of oocyte cryopreservation on embryo development, Fert Steril 2010, 93: 510-516

Ovociti vitrificati vs freschi

Cobo et al., Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method, Fert Steril 2008, 89: 1657-1664

Slow-freezing Vitrification

No. cycles 852 140

Age 35,3 ± 3,2 36,7 ± 4,1

Survival Rate (%) 2855/4148 (68,8) 593/844 (70,3)

Fertilization Rate (%) 1688/2252 (74,9) 378/506 (74,7)

Cleavage rate (%) 1465/1688 (86,8) 332/378 (87,8)

4CGr1 (+2) (%) 352/1465 (24)a 131/332 (39,5)a

6-8CGr1 (+3) (%) 192/842 (22,8)b 113/234 (48,3)b

No. Transferred cycles (%) 705 (82,7) 104 (74,3)

OOCYTE CRYOPRESERVATION SISMER experience 2004-2012

a,b P<0.001

Clinical pregnancy rate

Implantation rate (FHB)

Spontaneous abortion rate

%

Slow-freezing Vitrification

0

10

20

30

40

14,9%a

23,1%a

a) P<0.05

OOCYTE CRYOPRESERVATION SISMER experience 2004-2012

105/705 25/104 125/1380 25/202 27/105 9/25

9,1% 12,4%

25,7% 36%

Crioconservazione del tessuto ovarico

Consente di crioconservare frammenti ovarici in pazienti

oncologiche (anche pediatriche) indipendentemente dallo stadio

del ciclo mestruale.

Consente di ottenere centinaia di follicoli primordiali contenenti

ovociti immaturi, che risultano molto resistenti ai processi di

congelamento e scongelamento.

Non presuppone alcuna stimolazione ormonale dell’ovaio

Rappresenta una possibile alternativa nei casi di tumori estrogeno-

dipendenti.

A fronte di tali indubbi vantaggi, lo svantaggio principale

nell’utilizzo di tessuto ovarico congelato riguarda la bassa qualità

ovocitaria, nonchè il rischio di trasferire cellule residue

cancerogene.

Crioconservazione del tessuto ovarico

La corticale ovarica è una struttura estremamente complessa che

comprende diversi istotipi cellulari e follicoli in vari stadi di sviluppo con

cellule di diverse dimensioni (cellule tecali, cellule della granulosa, ovociti),

strutture extracellulari compatte (cellule dello stroma) e formazioni cavitate

(antro-follicolari, vasi sanguigni).

Campione

fresco

Campione

congelato/scongelato

Tecnica di prelievo di tessuto corticale ovarico

- Congelamento

lento

- Vitrificazione

S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59–67

Vitrificazione del tessuto ovarico

Frammenti per

analisi

Biopsia del tessuto

corticale ovarico

Tessuto tagliato in

piccoli frammenti

I frammenti attraversano

differenti concentrazioni di

soluzione di vitrificazione

I frammenti vengono posti in

un cryotube vuoto

Il cryotube chiuso è immerso

in azoto liquido

Due sono gli approcci per quanto riguarda l’autotrapianto di tessuto ovarico:

Sonmezer et al., Orthotopic and heterotopic ovarian tissue transplantation, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2010, 24: 113-26

- TRAPIANTO ORTOTOPICO, in cui i frammenti di corticale sono trapiantati nella

loro localizzazione originaria (fossetta ovarica).

S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59–67

Donnez et al., Live birth after allografting of ovarian cortex between genetically non-identical sisters, Hum Rep 2012, 26:1384-8

Crioconservazione del tessuto ovarico

-TRAPIANTO ETEROTOPICO, dove i frammenti possono essere trapiantati

sottocute in vari siti (braccio, avambraccio, zona sovra-pubica).

Crioconservazione del tessuto ovarico

- Minore invasività intervento

- Facile accesso

- Ripresa della funzionalità endocrina

MA

- Implicazioni psicologiche

- Risultati dubbi sulla possibilità di gravidanza

Oktay et al., Four spontaneous pregnancies and three live births following subcutaneous transplantation of frozen banked ovarian tissue: what is the

explanation?, Fertil Steril 2011,95: 804.e7-10

Kim SS, Assessment of long term endocrine function after transplantation of frozen-thawed human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal

follow-up study, J Assisted Reprod Genet 2012, 29: 489-93

Crioconservazione del tessuto ovarico: studi funzionali

S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation”, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59–67

Dopo il trapianto di tessuto

ovarico crioconservato i

livelli di FSH sierico si

abbassano fino a livelli

normali, simili a quelli

ottenuti con il trapianto di

tessuto ovarico fresco.

Crioconservazione del tessuto ovarico in SISMeR

Anno Pazienti

1997 1

1998 1

1999 1

2000 1

2001 3

2002 2

2003 -

2004 1

2005 1

2006 -

2007 -

2008 -

2009 1

2010 -

2011 1

2012 1

TOT=14 PZ

Ad oggi in tutto il mondo

sono nati più di 20 bambini

da trapianto di tessuto

ovarico, fresco o congelato. S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility

Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59–67

In alcuni casi il tessuto

ovarico trapiantato ha

permesso una ripresa della

funzionalità ovarica per più

di 7 anni. Andersen et al., Long-term duration of function of ovarian tissue

transplants: case reports, Reprod Biomed Online 2012 25: 128-32

Crioconservazione del tessuto ovarico: risultati clinici

S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol

Hum Reprod 2012, 18: 59–67

REDUCED OVARIAN RESERVE

Wallace Kelsey Model

Wallace and Kelsey. Human Ovarian Reserve from Conception to the Menopause

PLoS One. 2010; 5(1): e8772.

Xenotrapianto: tessuto ovarico umano in topi SCID.

Kim et al., Assessment of the integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after xenotransplantation”, Hum Reprod 2005, 20:

2502-8

Nottola et al., Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural study, Fertil Steril 2008, 90: 23-32

..alternative

Coltura e IVM di follicoli primordiali: “2 step culture system”:

coltura di tessuto seguita da isolamento di follicoli e coltura

degli stessi. In alternativa, utilizzo di una matrice di supporto

3D. Abir et al., In vitro maturation of human primordial ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth evaluation,

Histol. Histopatho 2006, 21: 887-98

Picton et al., The in vitro growth and maturation of follicles, Reproduction 2008, 136: 703-15

Telfer et al., A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin, Hum Rep

2008, 23: 1151-8

Woodruff TK, Preserving fertility during cancer treatment, Nat Med 2009, 15: 1124-5

Conclusioni

Il futuro riproduttivo dei pazienti oncologici può essere tutelato grazie alle

tecniche di preservazione della fertilità esistenti, tenendo in conto il tipo di

patologia, il tipo di trattamento, il tempo a disposizione, l’età del paziente e le

prospettive future.

Sicuramente la maggior esperienza per quanto riguarda la preservazione

della fertilità femminile si ha nel campo della crioconservazione degli ovociti,

ma per i casi in cui ciò non sia possibile, la crioconservazione del tessuto

ovarico offre una speranza di un futuro riproduttivo, anche se i dati sono

limitati ed è ancora considerata una tecnica sperimentale.

Conclusioni

Risulta fondamentale stabilire una stretta

collaborazione tra gli oncologi, gli specialisti di

medicina della riproduzione e il team biologico,

nell’ottica di offrire al paziente la migliore

opzione possibile.