Tesi Laurea Specialistica Chimica

Universita degli Studi di PerugiaFacolta di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di laurea in Scienze Chimiche

Tesi di Laurea Specialistica

Modulazione dell’attivita cataliticadi enzimi tramite interazione

con nanoparticelle

Laureanda: Relatore:Orsola Ripa Prof. Antonio Cipiciani

Correlatore:Dott.ssa Francesca Bellezza

Anno Accademico 2009/2010

a Marcello e Marella ♥

Premessa

La possibilita di regolare l’attivita catalitica delle proteine gioca un ruolo impor-

tante nella modulazione di processi cellulari vitali. Disfunzioni a livello dell’azione

svolta da enzimi e proteine sono la causa di disturbi e malattie per l’uomo, e la

capacita di regolare la funzione enzimatica e l’interazione tra sistemi proteici puo

fornire una promettente strategia per curare tali disturbi.

La struttura e la funzione di un enzima possono essere modulate tramite l’intera-

zione con nanoparticelle. Il ruolo chiave e svolto dalle proprieta del nanomateriale,

come la struttura, le dimensioni, la chimica superficiale, la carica e la forma.

Le nanoparticelle hanno alcuni vantaggi rispetto ad altre piccole molecole organi-

che: esse hanno una grande area superficiale (rapporto superficie/volume elevato)

che favorisce il legame con le proteine e le interazioni di tipo biologico. Le parti-

celle di dimensioni nanometriche possono entrare facilmente nelle cellule, cosa che

non e permessa ad alcune piccole molecole, anche di natura biologica. Inoltre, oggi

sono disponibili strategie sintetiche che permettono di ottenere nanoparticelle con

proprieta controllabili in termini di dimensioni, geometria e caratteristiche super-

ficiali, che siano integrabili con la complessita strutturale delle proteine. Il fiorente

sviluppo nel campo dei nanomateriali offre una nuova strada verso la modulazione

dell’attivita di proteine attraverso l’instaurarsi di interazioni superficiali tra i due

sistemi.

D’altra parte, la diffusione massiccia di questo tipo di materiali in numerosi ambi-

ti, che vanno dal biomedico all’alimentare, ha come conseguenza l’introduzione di

questo tipo di molecole nell’organismo. Proprio allo scopo di verificare e prevenire

eventuali effetti negativi e/o problemi di tossicita diventa fondamentale studiare

cosa succede a questi sistemi quando vengono a contatto con l’ambiente fisiologi-

co, con particolare attenzione verso gli enzimi, per capire il tipo di interazione che

eventualmente si instaura e verificare le ripercussioni sull’attivita catalitica della

proteina.

Solo conoscendo in modo preciso e da ogni punto di vista il sistema proteina-

nanoparticella si puo controllarlo, manipolarlo e utilizzarlo al meglio la dove ne-

cessario.

In questo lavoro e stata posta l’attenzione su due eme-proteine che svolgono un

ruolo molto importante nell’organismo: la mioglobina, la cui funzione principe e

legare reversibilmente l’ossigeno molecolare, e il citocromo C, enzima essenziale

della catena di trasporto mitocondriale degli elettroni.

Di entrambi e stata studiata l’attivita perossidasica, cioe la capacita di ossidare

substrati donatori di elettroni, in presenza di nanomateriali quali la silice e il fo-

sfato di zirconio. Il primo e un materiale molto diffuso e ampiamente utilizzato

mentre il secondo e un materiale di nuova sintesi.

Lo scopo del lavoro di tesi e stato capire come nanoparticelle cariche negativamen-

te in superficie interagiscono con la mioglobina e il citocromo C, che possiedono

carica netta differente a pH sperimentale, e vedere che ripercussioni ha tale inte-

razione sulla loro attivita perossidasica.

Indice

1 Interazione di enzimi con nanomateriali 1

1.1 Il ruolo delle nanotecnologie oggi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 L’interazione proteine-nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Modulazione dell’attivita catalitica con nanoparticelle . . . . . . . 6

1.4 Materiali nanostrutturati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.1 Silice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.4.2 α-Fosfato di zirconio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2 Emeproteine e attivita perossidasica 16

2.1 La catalisi enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.2 Le emeproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.2.1 Mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.2 Citocromo C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.2.3 Interazione di emeproteine con materiali nanostrutturati . . 27

2.3 Attivita perossidasica e studi cinetici . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina-

ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3 Scopo del lavoro 37

4 Risultati e discussione 40

4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-40 41

4.1.1 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 . . . 41

4.1.2 Spettri UV-Vis della mioglobina in presenza di SiO2 . . . . 45

i

INDICE

4.1.3 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 in

funzione della forza ionica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.4 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2-APTES 49

4.1.5 Stabilita della mioglobina all’inattivazione in presenza di

perossido di idrogeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.1.6 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemi mioglobina-

imidazolo e mioglobina-azide . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di silice Ludox TM-40 55

4.2.1 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 . . . 55

4.2.2 Spettri UV-Vis del citocromo C in presenza di SiO2 . . . . 58

4.2.3 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 in

funzione della forza ionica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.2.4 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2-APTES 60

4.2.5 Stabilita del citocromo C all’inattivazione in presenza di

perossido di idrogeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.3 Interazione di emeproteine con α-ZrP in forma nanostrutturata . . 62

4.3.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di α-ZrP . . 63

4.3.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di α-ZrP . . 67

5 Conclusioni 72

6 Parte sperimentale 75

6.1 Materiali utilizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

6.1.1 Funzionalizzazione della silice Ludox TM-40 . . . . . . . . . 75

6.1.2 Sintesi di nanoparticelle di α-ZrP . . . . . . . . . . . . . . . 76

6.2 Studi cinetici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

6.2.1 Studio dell’attivita catalitica di emeproteine in presenza di

nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

6.2.2 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM per la

proteina nativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

ii

INDICE

6.2.3 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM della pro-

teina adsorbita su nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . 78

6.3 Inattivazione della proteina in presenza di perossido di idrogeno . . 79

6.4 Spettroscopia UV-Vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

6.4.1 Spettri UV-Vis delle proteine nella forma nativa . . . . . . 79

6.4.2 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di silice . . . . . . 80

6.4.3 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di fosfato di zirconio 80

6.5 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemi mioglobina-

ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

Bibliografia 82

iii

Capitolo 1

Interazione di enzimi connanomateriali

1.1 Il ruolo delle nanotecnologie oggi

Le nanotecnologie si occupano della ricerca e sviluppo di sistemi nanostrutturati

e sono il ramo scientifico piu studiato e su cui si e investito moltissimo, a livello

mondiale, in questo inizio di secolo.

La capacita di lavorare a livello molecolare, atomo per atomo, e di manipolare

specifiche caratteristiche dei nanomateriali, quali proprieta fisiche, chimiche e bio-

logiche, offre una gamma di possibilita di sintesi di minuscole strutture, altamente

funzionalizzate, utilizzabili nell’ambito del drug delivery, in tecniche di imaging,

per la progettazione di biosensori, circuiti elettrici, microchips, switches moleco-

lari e anche analoghi per tessuti cutanei, ossa, muscoli e altri organi.

D’altra parte, i notevoli passi avanti fatti dalla medicina e dalle biotecnologie nel

campo della diagnostica e della cura di malattie dipendono da una approfondita

conoscenza dei processi biologici. Le malattie possono essere identificate sulla ba-

se di anomalie a livello molecolare e anche le cure progettate a partire da questo

stesso livello. Anche se esistono molti metodi diagnostici cosi come esistono gia

cure mirate, e auspicabile usare strumenti con dimensioni paragonabili a quelle

molecolari per capire meglio i meccanismi coinvolti nei processi. Questi strumen-

ti possono essere basati su nanoparticelle, nano-probs o altri nanomateriali, che

1

1.2 L’interazione proteine-nanoparticelle

possono essere usati per interagire col processo biologico d’interesse.

La scienza biomedica e le biotecnologie hanno beneficiato dei progressi tecnologici

raggiunti in molti campi e le nanotecnologie sono uno di questi, rappresentando

un’area molto importante e promettente anche per il futuro.

Le nanoparticelle hanno proprieta uniche che possono essere sfruttate in questo

ambito: possiedono proprieta elettroniche, ottiche, chimiche e magnetiche inusuali

rispetto ai materiali di dimensioni macro, hanno un elevato rapporto superficie-

volume e dimensioni paragonabili a quelle di importanti sistemi biologici (proteine,

DNA, membrane cellulari). Tutto questo permette loro di interagire in maniera

sofisticata e controllata a livello cellulare.

Negli ultimi anni, nanoparticelle di diverse dimensioni, composizione e funzionalita

superficiale sono state studiate per capirne l’interazione con proteine. I meccani-

smi d’interazione nanoparticella-proteina implicati sono, nella maggior parte dei

casi, interazioni idrofobiche, π − π ed elettrostatiche, che ovviamente possono

coesistere.


Lo studio del meccanismo di interazione di proteine con nanomateriali ha avuto

inizio negli anni ’50, quando cominciarono i primi tentativi di utilizzare enzimi

fuori dal loro ambiente naturale. Ad oggi l’interesse nel comprendere le forze che

regolano il legame proteina-solido non e soltanto rendere l’enzima piu stabile e

resistente al variare delle condizioni sperimentali in cui lavora, ma anche quello di

modulare l’attivita enzimatica tramite l’interazione con specifici nanomateriali.

Proprio per la sempre maggiore diffusione di tali sistemi in prodotti di tipo biome-

dico e di consumo, puo essere facile entrare in contatto con essi e diventa quindi

cruciale conoscere cosa accade quando nanoparticelle si trovano a contatto di li-

quidi biologici. Questo obiettivo puo essere raggiunto, step by step, partendo dallo

studio dell’interazione di nanomateriali con le proteine presenti nel nostro organi-

smo.

2


Una proteina puo interagire con nanoparticelle tramite adsorbimento o tramite

formazione di legami covalenti; in entrambi i casi e necessario capire quale parte

della proteina e coinvolta e nel caso di enzimi se il sito attivo e direttamente coin-

volto o meno.

In genere il processo di adsorbimento di proteine prevede piu passaggi:

1. deidratazione della superficie: consiste nel rilascio di molecole di acqua

dalla superficie della proteina e delle nanoparticelle; favorisce l’adsorbimento

su materiali idrofobici e sfavorisce quello su materiali idrofilici;

2. interazioni proteina-nanoparticelle: sono in genere interazioni elettro-

statiche o di Van der Waals;

3. cambiamenti strutturali della proteina: la struttura folded di una pro-

teina e il risultato del fatto che le interazioni idrofobiche tra i residui apolari

interni riescono a superare sia le repulsioni tra cariche dello stesso segno di

residui esterni sia la perdita di entropia dovuta alla struttura folded piu or-

dinata. A contatto con un nanomateriale idrofobico tale bilanciamento viene

meno e le interazioni idrofobiche tra i residui apolari interni sono sostituite

da quelle che si instaurano tra la macromolecola e il solido.

Puo verificarsi che le repulsioni tra cariche dello stesso segno di residui

esterni prevalgano e si abbia l’unfolding della proteina, con successivo au-

mento dell’area occupata da ciascuna molecola proteica sulla superficie del

nanomateriale.

4. interazioni laterali tra proteine adsorbite: sulla superficie delle na-

noparticelle possono legarsi piu unita proteiche in grado di interagire tra

loro sia in modo attrattivo che repulsivo. Tali interazioni sono fortemente

dipendenti dal grado di copertura della superficie.

La comprensione e il controllo dei fenomeni che regolano l’interazione tra una

proteina e un materiale nanostrutturato e molto complesso.

3


Altri fattori importanti che influenzano il modo in cui una proteina si adsorbe su

una superficie solida sono:

• proprieta e stabilita della proteina: le proteine possono essere suddivise

in due grandi classi, proteine hard e soft. Questa terminologia e utile per

descrivere la tendenza di una proteina a subire cambiamenti strutturali piu

o meno significativi quando si adsorbe su superfici solide.

Le proteine hard hanno elevata stabilita strutturale e tendono ad interagire

con materiali superficialmente idrofobici, a meno che non ci siano forze di

attrazione elettrostatica. A seguito dell’adsorbimento, interazioni di questo

tipo inducono sulla proteina hard variazioni conformazionali poco significa-

tive. A questa classe appartengo per esempio l’α-chimotripsina , il lisozima

e il citocromo C (CytC).

Le proteine soft hanno una bassa stabilita strutturale e maggiore flessibilita;

ne sono un esempio l’emoglobina (Hb), la mioglobina (Mb) e l’albumina

(HSA). Esse si adsorbono piu facilmente su superfici idrofiliche anche in pre-

senza di repulsione elettrostatica, grazie al guadagno entropico dovuto ad

alterazioni conformazionali indotte dall’interazione;

• fattori termodinamici: oltre alla natura della proteina il processo di in-

terazione tiene conto dell’energia messa in gioco.

Termodinamicamente, l’adsorbimento e determinato dalla variazione di ener-

gia libera che, a temperatura ambiente, e correlata a fattori entalpici ed en-

tropici. I primi dipendono dalla intensita delle forze attrattive e/o repulsive

(elettrostatiche, idrofobiche e di Van der Waals) che regolano la formazione

del sistema proteina-nanomateriale. I fattori entropici sono legati al rilascio

dell’acqua di idratazione della proteina e delle nanoparticelle e ad un even-

tuale riduzione di ordine nella struttura proteica dovuto all’unfolding che lo

stabilirsi dell’interazione puo causare;

• condizioni sperimentali: note le caratteristiche strutturali della protei-

4


na e del nanomateriale, e possibile ottimizzare l’adsorbimento variando le

condizioni sperimentali. In particolare l’interazione tra i due sistemi e in-

fluenzata dal pH e dalla temperatura.

Un aumento della temperatura puo avere un effetto sulla stabilita e sulla

struttura conformazionale della proteina. Pur essendo una possibile causa

di denaturazione, la variazione di temperatura puo essere utilizzata per de-

finire le driving-forces responsabili dell’adsorbimento. La variazione della

percentuale di proteina adsorbita all’aumentare della temperatura indica se

il processo e endotermico o esotermico: una diminuzione della percentuale

di adsorbimento corrisponde ad un processo esotermico (∆H < 0) mentre,

un aumento corrisponde ad un processo endotermico (∆H > 0). In quest’ul-

timo caso, dato che il processo e spontaneo, si deve verificare un aumento di

entropia dovuto, ad esempio, a variazioni conformazionali.

Le proteine soft risentono maggiormente di variazioni di temperatura ri-

spetto alle hard, perche le modifiche strutturali che subiscono favoriscono il

processo da un punto di vista entropico.

Anche il pH ha un ruolo fondamentale sui processi di interazione proteine-

nanomateriali. Il massimo valore di proteina adsorbita si ottiene, in genere,

a un valore di pH prossimo a quello del punto isoelettrico (pI) della proteina:

quando il pH uguaglia il pI la proteina non ha una carica superficiale netta

e risente meno delle repulsioni laterali tra molecole adsorbite, favorendo un

miglior impaccamento.

Un altro fattore molto importante e la forza ionica del mezzo in cui avviene

l’interazione: essa puo avere un effetto drammatico su processo di adsorbi-

mento. Valori elevati di forza ionica favoriscono l’adsorbimento in condizioni

di repulsione elettrostatica tra proteina e solido e lo inibiscono se c’e attra-

zione elettrostatica. In generale, una marcata dipendenza dell’adsorbimento

dalla forza ionica indica un forte contributo da parte di interazioni di tipo

elettrostatico.

5

1.3 Modulazione dell’attivita catalitica con nanoparticelle

1.3 Modulazione dell’attivita catalitica con nanopar-ticelle

L’importanza che l’interazione tra una proteina e nanoparticelle puo avere in am-

bito biologico nel modulare l’attivita enzimatica e dimostrata dal sempre crescente

numero di lavori di letteratura che riguardano tale argomento e dagli ottimi risul-

tati raggiunti [1].

Nell’ambito di tale tematica particolare interesse e stato rivolto allo studio di na-

noparticelle di natura inorganica. Ad esempio, nanoparticelle di silice di diverse

dimensioni sono state utilizzate per indagare l’effetto su proteine quali il lisozima

[2], la ribonucleasi A [3] e l’anidrasi carbonica [4].

Il tipo di interazione, la struttura e la capacita catalitica della proteina adsorbita

sono fortemente influenzate dalle dimensioni della silice. Un differente raggio di

curvatura influenza l’assorbimento che a sua volta induce cambiamenti conforma-

zionali diversi e quindi modifiche sull’attivita dell’enzima. Nel caso del lisozima,

nanoparticelle di dimensioni piu grandi (100 nm di diametro) stabiliscono intera-

zioni piu forti con la proteina (4 nm di diametro), causando un maggiore unfolding

con conseguente diminuzione di attivita enzimatica (Figura 1.1) [2].

Figura 1.1: Adsorbimento del lisozima su nanoparticelle di silice di diversedimensioni.

Inoltre, la funzionalizzabilita superficiale delle nanoparticelle offre una gamma

di possibilita per lo studio dei processi che avvengono all’interfaccia proteina-

nanoparticella.

6


Ad esempio, sono stati messi a punto sistemi costituiti da un core di nanoparti-

celle d’oro, ricoperti da un monostrato organico con diversi gruppi superficiali e

denominati MMPC (Figura 1.2): questi sistemi hanno un diametro di circa 6 nm

e sono in grado di interagire con biomolecole come la chimotripsina [5] [6].

Figura 1.2: a) Struttura chimotripsina. b) Dimensioni relative dellachimotripsina e delle nanoparticelle MMPC. c) MMPC anionici e cationici.

In base alla carica dei gruppi funzionali superficiali gli MMPCs hanno un effetto

diverso sulla proteina: quelli di tipo anionico inibiscono la chimotripsina a causa

delle cariche negative terminali complementari a quelle localizzate attorno a sito

attivo dell’enzima. (Figura 1.3).

Figura 1.3: Rappresentazione dell’interazione tra la chimotripsina enanoparticelle di oro funzionalizzate in superficie.

7


L’attivita catalitica della chimotripsina si puo quindi modulare attraverso l’inte-

razione con diversi tipi MMPC.

L’interazione nanoparticelle-proteine puo pertanto essere messa a punto modifi-

cando la superficie del nanomateriale: in questo modo si puo ottimizzare l’attivita

catalitica dell’enzima di interesse in base al tipo di applicazione desiderata.

Particelle di CdSe, derivatizzate sulla superficie con gruppi terminali diversi, sono

un altro esempio interessante [7]: tre situazioni possibili sono illustrate nella Fi-

gura 1.4.

Figura 1.4: Modalita d’interazione della chimotripsina al variare dei legandipresenti sulla superficie di nanoparticelle di CdSe

Cambiando la natura del legando superficiale cambia il comportamento della pro-

teina. Nel caso a) la chimotripsina si lega alle nanoparticelle ma l’interazione

determina l’unfolding con conseguente denaturazione; nel caso b) la proteina non

si lega mentre, nel caso c), l’enzima si lega mantenendo inalterata la sua struttura

e attivita.

Anche alcuni amminoacidi sono stati utilizzati come legandi per modificare la su-

perficie di nanoparticelle di oro in modo da modulare l’attivita della chimotripsina.

Le nanoparticelle possono avere un ruolo chiave anche nei processi di riconoscimen-

8

1.4 Materiali nanostrutturati

to e di interazione tra proteine che sono alla base di complesse funzioni cellulari,

quali l’apoptosi e l’angiogenesi. Ad esempio nanoparticelle di oro possono inibire

l’interazione tra il CytC e la citocromo C perossidasi se funzionalizzate con gruppi

tiolato con linker PEG biocompatibili e gruppi amminici terminali [8].


La scelta del materiale da far interagire con una proteina va fatta in base alle

caratteristiche che esso possiede, al tipo di reazione che si vuole studiare e alle

condizioni sperimentali. Alcuni parametri sono considerati fondamentali:

• il tipo, la distribuzione e la densita dei gruppi funzionali superficiali; questi

fattori influenzano l’adsorbimento e la stabilita del sistema che si forma;

• area superficiale: si preferiscono nanomateriali con ampia area superficiale

cosi da garantire un maggiore carico di proteina;

• rapporto idrofobicita/idrofilia della matrice: essa influisce sulle interazioni

non covalenti, l’adsorbimento, la distribuzione e la disponibilita di substrato

e prodotto;

• forma e grandezza delle nanoparticelle.

I materiali studiati in questo lavoro di tesi sono di tipo inorganico e sono molto

diffusi, sia in ambito di ricerca che dal punto di vista applicativo: questo, insieme

alle caratteristiche che essi possiedono, e tra i motivi per cui e interessante capire

cosa succede quando essi entrano in contatto con enzimi presenti nell’organismo

per fare luce anche sulla loro eventuale pericolosita per l’uomo.

1.4.1 Silice

La silice e da molti anni tra i nanomateriali piu utilizzati nella ricerca e nella

progettazione di sistemi con applicazioni in diversi campi.

9


Essa puo essere sintetizzata tramite diverse tecniche preparative sotto forma di

nanoparticelle e film trasparenti. Le tecniche sintetiche piu comuni prevedono un

approccio di tipo bottom-up e sono:

• metodo di stober [9]: il metodo piu utilizzato per la sintesi di silice col-

loidale in forma nanometrica e con dimensioni inferiori a 100 nm.

Il processo prevede l’idrolisi di un precursore, in genere tetraetossisilano

(TEOS), in una miscela di etanolo, acqua e idrossido di ammonio; durante

la reazione si forma acido silicico e quando la sua concentrazione supera la

solubilita in etanolo esso aggrega in modo omogeneo e forma particelle di

silice con diametro che va da meno di 10 nm a 1 µm. Le dimensioni delle par-

ticelle possono essere controllate ottimizzando alcuni parametri sperimentali

come la concentrazione e la temperatura.

La presenza di alcool e di condizioni di pH basiche fanno si che questa tecnica

sintetica sia poco compatibile con la formazione di bio-coniugati in quanto, in

queste condizioni, la proteina puo subire denaturazione; esistono comunque

altri approcci che cercano di limitare tale inconveniente;

• metodo delle micelle inverse: una micro-emulsione di acqua in olio

(W/O) crea aggregati di surfattanti anfifilici termodinamicamente stabili.

All’interno di questi aggregati si crea una zona idrofilica e le nano goccioline

di acqua fanno da micro-reattore: e qui che si formano le nanoparticelle a

partire dal’idrolisi di silani precursori. Il diametro delle nanoparticelle in

crescita e controllato dalla grandezza delle gocce di acqua e dal rapporto

acqua/surfattante.

Questa procedura richiede un tempo di reazione piu lungo rispetto al me-

todo precedente ma permette di sintetizzare particelle altamente sferiche e

monodisperse.

La struttura e la superficie della silice sono rappresentate in Figura 1.5: il core di

ogni particella e costituito da unita SiO2 che si ripetono mentre sulla superficie

10


sono presenti gruppi silano (-OH) e/o silossano (-OR). Sono questi gruppi che

determinano le proprieta chimiche superficiali della silice.

Figura 1.5: a) Immagine TEM di nanoparticelle di silice Ludox TM-40. b)Rappresentazione schematica di una nanoparticella di silice.

La silice puo essere facilmente derivatizzata sostituendo gli ossidrili con gruppi

amminici, carbossilici o tiolici (Figura 1.6). La funzionalizzazione non si limita

soltanto a procedure che prevedano modifiche chimiche ma si puo ottenere anche

tramite assorbimento passivo di molecole.

Tutte queste caratteristiche fanno della silice un ottimo materiale anche per ap-

plicazioni di tipo biotecnologico e medico [10].

Le nanobiotecnologie si occupano principalmente dello sviluppo di circuiti elet-

tronici, switches molecolari, biosensori e microchips, mentre la nanomedicina fo-

calizza l’attenzione sulla cura di malattie, tecniche di diagnosi, di monitoraggio,

e sul rilascio e l’individuazione di agenti diagnostici, terapeutici e farmaceutici.

L’importanza che l’uso di questo nanomateriale puo avere in questi ambiti e di-

mostrato dalla quantita di lavori pubblicati al riguardo (Figura 1.7).

Le applicazioni come biosensori sono le piu studiate e diffuse: in questo ambi-

to si utilizzano biotecnologie avanzate per creare prodotti in grado di rilevare e

quantificare analiti in ambiente clinico (analisi del sangue di routine), domestico

11


Figura 1.6: Nanoparticelle di silice funzionalizzate con diversi gruppi organici.

(monitoraggio del glucosio), industriale (sicurezza lavoratori, sicurezza alimentare)

e ambientale. Questi devices devono unire alte prestazioni, in termini di sensibi-

lita e selettivita, dimensioni minime, alta velocita di risposta e bassi costi. Per

realizzarli e necessario mettere insieme fondamenti di biologia, chimica e scienze

dei materiali. Le nanoparticelle sono unita attive per sistemi di questo tipo perche

sono in grado di amplificare un segnale. Nanoparticelle di silice funzionalizzate

con proteine e acidi nucleici sono state usate come unita per amplificare la tra-

sduzione di segnali di riconoscimento biologico.

Intrappolando le biomolecole in nanosfere a base di silice alcuni ricercatori hanno

ottenuto sistemi con elevata capacita di immobilizzazione per le biomolecole.

La silice e molto utilizzata anche nell’ambito dei saggi di tipo immunologico [11]:

questi si basano sulla reazione tra un analita (antigene) e un anticorpo selettivo a

dare un complesso. La reazione puo essere visualizzata in diversi modi ad esempio

con enzimi e fluorofori. Per ottenere una elevata sensibilita del saggio sono indi-

spensabili anticorpi con alta affinita e appropriati supporti.

12


Figura 1.7: Pubblicazioni riguardanti applicazioni di nanoparticelle di silicefunzionalizzate nel periodo 1999-2008.

Le nanoparticelle di silice hanno enorme potenzialita come base per ottenere bio-

marker per l’imaging cellulare. Le nanoparticelle, in questo caso, possono essere

drogate con molecole fluorescenti e derivatizzate in modo che abbiano una elevata

affinita per molecole in grado di legarsi a recettori di membrane cellulari.

Proprio in virtu del suo potenziale applicativo in ambito biotecnologico, c’e la

concreta possibilita che questi materiali entrino in contatto con gli enzimi, mole-

cole che hanno un ruolo cruciale in processi vitali, ed e importante capire anche

l’eventuale tossicita e i problemi che, nel tempo, possono causare all’organismo.

1.4.2 α-Fosfato di zirconio

I fosfati di zirconio sono una classe di composti largamente investigati in virtu

delle loro potenzialita dal punto di vista applicativo in numerosi campi. Sono

ottenuti soprattutto in forma lamellare, in diverse strutture, ognuna delle quali

possiede particolari caratteristiche [12] [13].

Diversi gruppi funzionali, da super-acidi a basici, da liofili a lipofili possono essere

inseriti nella struttura base del solido sia tramite sintesi diretta che attraverso

procedure specifiche quali lo scambio topotattico, reazione di scambio anionico

13


di gruppi fosfato acidi superficiali della lamella con altri gruppi organo-fosfato o

fosfonati.

Il fosfato di zirconio monoidrato di tipo α (α-Zr(HPO4)2 · H2O), indicato come

α-ZrP, appartiene alla classe dei solidi lamellari carichi negativamente la cui strut-

tura e quella riportata in Figura 1.8.

Figura 1.8: Rappresentazione schematica dell’α-Zr(HPO4)2 · H2O.

Le lamelle consistono di atomi di Zr (rosa) posti su piani al di sopra e al di sot-

to dei quali si trovano alternativamente i gruppi monoidrogeno-fosfato (verde) in

coordinazione tetraedrica. I tre atomi di ossigeno (blu) di ogni gruppo fosfato

sono legati a tre differenti atomi di zirconio, i quali formano un triangolo equila-

tero distorto; ogni atomo di Zr e cosi coordinato ottaedricamente a sei atomi di

ossigeno. Il quarto atomo di ossigeno del gruppo fosfato e legato ad un protone

(non mostrato in figura) e punta nella regione interstrato.

L’impacchettamento degli strati e tale che ciascun atomo di Zr trova sopra e sotto

di se gli ossidrili dei due stati adiacenti; si formano quindi piccole cavita esagonali

in cui viene ospitata una mole di acqua per peso formula. Le molecole di acqua

formano dei legami a idrogeno con i gruppi fosfato ma gli strati sono tenuti insieme

da forze di Van der Waals; non ci sono dunque legami a idrogeno interstrato.

Nell’α-ZrP i protoni sono in grado di diffondere attraverso il reticolo cristallino

14


ed possono essere sostituiti con cationi metallici (es. Na+) (proprieta di scambio

ionico). E possibile inserire, spesso reversibilmente, specie ospiti tra le lamelle

senza alterare la struttura degli strati (proprieta di intercalazione).

Il fosfato di zirconio in forma nanostrutturata e stato sintetizzato tramite la tec-

nica della microemulsione inversa [14] o tramite reazione solvotermica [15].

Il fosfato di zirconio e i suoi derivati, unendo un’ampia possibilita di modulare le

proprieta superficiali a proprieta quali la biocompatibilita, sono molto interessanti

da un punto di vista applicativo in ambito biologico. Numerosi studi riportano

l’interazione di tali materiali con proteine ed enzimi [17] [18] [19], anche se dati

riguardanti l’attivita catalitica di tali sistemi sono ancora carenti.

15

Capitolo 2

Emeproteine e attivitaperossidasica

Gli enzimi sono proteine e rappresentano le macromolecole piu abbondanti presen-

ti nelle cellule. All’interno della cellula ci sono migliaia di differenti enzimi, ognuno

dei quali sovrintende uno specifico processo chimico, rendendolo possibile in tempi

brevi e concertato con tutti quelli necessari alla vita cellulare. La funzione svolta

da un enzima e specificata dal DNA sotto forma di sequenza amminoacidica, la

quale rappresenta la struttura primaria di una proteina. I legami peptidici sono

lo scheletro della struttura proteica e si formano tra amminoacidi adiacenti con

eliminazione di una molecola di acqua.

La conformazione tridimensionale puo essere descritta sulla base di tre livelli ul-

teriori: struttura secondaria, terziaria e quaternaria. Le interazioni responsabili

della stabilizzazione di questi tre livelli sono principalmente di natura non cova-

lente.

La struttura secondaria rende conto della disposizione nello spazio di amminoaci-

di vicini ed e dovuta alla ripetizione regolare di tratti di catena peptidica grazie

all’instaurarsi di legami a idrogeno tra un azoto amminico e l’ossigeno carbonilico

tra residui distanti poche unita amminoacidiche. Le piu frequenti strutture secon-

darie sono l’α-elica e il β-foglietto.

La struttura terziaria riguarda la disposizione spaziale di amminoacidi lontani tra

loro nella struttura primaria. La stabilizzazione di questa struttura e resa possibi-

16

2. Emeproteine e attivita perossidasica

le da interazioni tra le catene laterali di amminoacidi non adiacenti. La struttura

quaternaria deriva dall’associazione di due o piu catene polipeptidiche con forma-

zione di una proteina a piu subunita.

Ogni proteina puo avere una sola struttura tridimensionale e ad ognuna e asso-

ciata una specifica funzione chimica o strutturale. Le proteine hanno un ruolo

fondamentale praticamente in tutti i processi biologici: nel metabolismo del cibo

per generare energia, nella sintesi di nuove strutture cellulari, come trasportatori

di molecole necessarie alla vita, nelle principali funzioni svolte dal sistema nervoso

centrale.

Da tempo e nota anche la capacita degli enzimi di catalizzare processi fuori dal-

l’ambiente biologico, trasformazioni che coinvolgono substrati diversi da quelli

naturali e il loro impiego come biocatalizzatori si e diffuso in diversi settori indu-

striali.

I vantaggi principali legati all’utilizzo di questa classe di catalizzatori sono legati

ad alcune caratteristiche peculiari degli enzimi:

• selettivita: e la capacita di un enzima di riconoscere uno specifico substrato

e promuoverne la trasformazione desiderata;

• enantioselettivita: un enzima e in grado di discriminare un particolare

enantiomero in una miscela racemica e catalizzarne la reazione voluta;

• diastereoselettivita: un enzima e capace di selezionare un diastereoisome-

ro in una miscela distereoisomerica e di favorire la sua trasformazione;

• chemoselettivita: un enzima riesce ad agire selettivamente su un gruppo

funzionale, in presenza di altri gruppi in una molecola, con reattivita uguale

o superiore;

• regioselettivita: e la capacita di un enzima di riconoscere un particolare

gruppo funzionale tra gruppi uguali o simili presenti in un reagente e di

catalizzarne la trasformazione desiderata;

17

2.1 La catalisi enzimatica

• utilizzo di materie prime grezze: l’alta selettivita di un enzima permette

spesso l’utilizzo di materie prime non purificate: miscele racemiche, soluzioni

proteiche, di zuccheri, brodi di fermentazione e intermedi ottenuti da processi

chimici;

• basso impatto ambientale: la possibilita di eseguire reazioni in condizioni

blande e in mezzo acquoso permette la progettazione di processi con ridotto

impatto ambientale in termini di consumo di solventi, trattamento degli

scarichi e consumi energetici ridotti.


Gli enzimi hanno una straordinaria forza catalitica, generalmente maggiore rispet-

to ai catalizzatori di sintesi, ed un’elevata specificita per i substrati che permette

loro di promuovere reazioni chimiche evitando la formazione di sottoprodotti. Il

processo di catalisi indotto da un enzima consiste nell’aumentare la velocita di

reazione e nel velocizzare il raggiungimento dello stato di equilibrio termodinami-

co senza alterare il punto di equilibrio della reazione a cui partecipa.

L’enzima facilita la reazione attraverso l’interazione del proprio sito attivo (sito

catalitico) con il substrato formando il complesso ES e abbassando l’energia di at-

tivazione della reazione ma senza modificare la variazione di energia libera totale

(Figura 2.1). Avvenuta la reazione il prodotto si stacca dall’enzima e la proteina

ritorna nel ciclo catalitico.

In un processo enzimatico, in generale, e possibile distinguere tre differenti stadi:

• uno stadio pre-stazionario in cui si ha la formazione del complesso ES e la

scomparsa della proteina libera e del substrato con successiva formazione del

prodotto;

• un secondo stadio, stazionario, con ulteriore formazione del complesso e

aumento della concentrazione del prodotto;

18


• il terzo stadio in cui il substrato e stato completamente trasformato nel

prodotto di reazione e diminuisce la concentrazione del complesso ES.

Figura 2.1: Profilo energetico di una reazione.

Partendo da questa osservazione Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913, osser-

varono che a concentrazione costante di enzima l’aumento della velocita di reazione

e proporzionale all’aumento della concentrazione del substrato fino a quando non

si raggiunge un valore di velocita massima che non viene superato nemmeno au-

mentando in modo significativo la quantita di substrato.

Raggiunta la condizione di saturazione la proteina non e piu in grado di aumentare

la velocita di reazione. Il modello di Michaelis-Menten prevede il raggiungimento

di una condizione di equilibrio tra l’enzima, il substrato e il complesso ES:

E + Sk1−−⇀↽−−

k−1

ESk2−→ E + P

Nel primo step, regolato dalla costante di velocita k1, si forma il complesso ES in

maniera reversibile. Nel secondo stadio il complesso si scinde e viene rilasciato il

prodotto di reazione e l’enzima libero (costante di velocita k2).

La velocita massima della reazione viene raggiunta quando tutto l’enzima e pre-

19


sente in soluzione come complesso ES, condizione possibile solo a concentrazioni

di substrato molto elevate.

L’equazione elaborata da Michaelis-Menten e un’espressione algebrica dell’anda-

mento iperbolico che si ottiene graficando la la velocita di reazione sperimentale

in funzione della concentrazione del substrato.

L’elaborazione dell’equazione presuppone che negli istanti iniziali ci sia proporzio-

nalita tra la velocita e la concentrazione di substrato e che sia esclusa la reazione

inversa del secondo stadio del processo catalitico. Quindi la velocita puo essere

espressa come:

v = k2[ES] (2.1)

Applicando il principio dello stato stazionario, la velocita di formazione e scom-

parsa del complesso si eguagliano:

k1[E][S] = (k−1 + k2)[ES] (2.2)

[ES] =k1[E][S]

k−1 + k2(2.3)

Introducendo la costante di Michaelis-Menten come:

KM =k−1 + k2

k1(2.4)

l’equazione 2.3 diventa:

[ES] =[E][S]

KM(2.5)

20


Considerando che l’enzima sia presente in concentrazioni catalitiche rispetto al

substrato e che la sua concentrazione in soluzione sia:

[E] = [ET ]− [ES] (2.6)

Sostituendo la 2.6 nella 2.5 si ottiene:

[ES] =[ET ][S]

[S] +KM(2.7)

Sostituendo la 2.7 nella 2.1 si ottiene:

v =k2[ET ][S]

[S] +KM(2.8)

Considerando che la velocita massima vMAX viene raggiunta quando tutti i siti

catalitici dell’enzima sono saturi di substrato, cioe quando [S] � KM , si ottiene

l’equazione di Michaelis-Menten 2.10:

vMAX = k2[ET ] (2.9)

v =vMAX [S]

[S] +KM(2.10)

La KM , parametro fondamentale dell’equazione 2.10, e caratteristica di ogni enzi-

ma per un determinato substrato, in determinate condizioni di pH e di tempera-

tura. La KM rappresenta la quantita di substrato necessaria affinche la reazione

abbia velocita pari alla meta della velocita massima (vMAX). Questa costante

definisce quantitativamente l’affinita di un enzima per un substrato: piu basso e

21

2.2 Le emeproteine

il suo valore, maggiore e l’affinita enzima-substrato e quindi minore e la concen-

trazione di substrato necessaria per raggiungere un valore di velocita che sia meta

della velocita massima. Viceversa, maggiore e il valore di KM minore e l’affinita

dell’enzima per il substrato.

L’altra costante importante nell’equazione di Michaelis-Menten e kcat (= k2) o

numero di turnover, definita come il numero di molecole di substrato convertite

per secondo. Il rapporto kcat/KM e un indice della capacita catalitica dell’enzi-

ma a basse concentrazioni di substrato e spesso viene utilizzato per confrontare

l’efficienza di diversi enzimi o quella di un enzima con differenti substrati. Un va-

lore elevato di tale rapporto indica una buona efficienza dell’enzima in condizioni

fisiologicamente rilevanti.

2.2 Le emeproteine

Le emeproteine sono enzimi che svolgono un ruolo essenziale in molti dei processi

fisiologici. A questa famiglia appartengono proteine come l’Hb e la Mb, implicate

nel trasporto dell’ossigeno molecolare, ma anche ossidasi, catalasi, perossidasi e

citocromi, tutte legate a processi di attivazione dell’ossigeno molecolare, alla di-

stribuzione e attivazione del perossido di idrogeno e al trasferimento di elettroni

all’interno della cellula. Le emeproteine sono caratterizzate dalla presenza di un

gruppo eme come gruppo prostetico (piccola molecola di natura non proteica o

uno ione metallico che si associa all’enzima e ne rende possibile l’attivita catalitica

tipica dell’enzima stesso), costituito da un anello porfirinico al quale e legato un

atomo di ferro. Tale metallo, insieme al rame, e impiegato in molti enzimi ossi-

dativi data l’ampia modulabilita della propria reattivita al variare dello stato di

ossidazione e di coordinazione. I gruppi eme sono distinti in tipo a (farnesileme),

tipo b (protoeme IX) e tipo c (mesoeme) in base ai diversi sostituenti periferici

dell’anello porfirinico. L’eme b e il piu diffuso in natura mentre l’eme di tipo

c e l’unico ad essere legato covalentemente alla struttura proteica tramite ponti

tioetere con i gruppi tiolici di due cisteine presenti nella proteina.

22

2.2 Le emeproteine

Le proprieta delle emeproteine sono fortemente influenzate dalla struttura pro-

teica; l’intorno amminoacidico del sito attivo ne determina l’attivita, imponendo

la natura e le dimensioni della sacca in cui e inserito l’eme stesso e del canale

d’accesso al sito stesso dall’esterno dell’enzima.

2.2.1 Mioglobina

La Mb e la prima proteina di cui sia stata risolta la struttura ai raggi X grazie

al lavoro di John Kendrew [20]; e piccola (dimensioni approssimate di 4.5∗3.5∗2.5

nm3, peso = 17800 Da) e costituita da una catena polipeptidica singola e dal

gruppo eme di tipo b.

L’apoproteina della Mb, denominata globina, e costituita da 153 amminoacidi or-

ganizzati in una struttura secondaria in cui sono individuabili otto regioni con con-

formazione α-elica (A-H), cinque segmenti non elicali che uniscono α-eliche adia-

centi e due frammenti terminali, uno ammino-terminale (N-A) ed uno carbossil-

terminale (H-C).

Figura 2.2: Struttura della mioglobina.

L’eme e costituito da un anello tetrapirrolico chiamato protoporfirina IX che lega

23

2.2 Le emeproteine

lo ione Fe2+. I quattro anelli pirrolici sono legati da ponti -CH= cosı che l’in-

tera struttura della porfirina risulta insatura e planare. Quattro gruppi metilici,

due gruppi vinilici e due propionilici ionizzati sono legati all’anello tetrapirrolico.

L’Fe2+ sostituisce due protoni della porfirina IX. Il complesso Fe-protoporfirina

IX e un ibrido di risonanza in cui il ferro risulta legato ai quattro atomi di azoto

della protoporfirina IX.

L’interno della Mb e caratterizzato dalla presenza di residui altamente idrofobici

(Val, Ile, Phe e Met) mentre in superficie si trovano sia residui idrofili che idrofo-

bici. Le molecole di acqua sono, in generale, escluse dalla porzione interna della

proteina e la maggior parte dei residui ionizzabili e localizzata sulla superficie;

tuttavia alcuni amminoacidi ionizzabili si possono trovare in corrispondenza di

tasche accessibili a molecole che si legano in modo specifico alla proteina stessa.

La proprieta principale di questo enzima (nella forma Fe2+) e la capacita di le-

gare reversibilmente l’ossigeno molecolare, svolgendo la funzione di deposito nel

tessuto muscolare e aiutando la diffusione dell’ossigeno dai capillari all’ambien-

te intracellulare, dove viene utilizzato per produrre energia. La formazione del

legame reversibile tra la Mb e l’ossigeno e denominata ossigenazione: l’accessibi-

lita dell’eme dipende dal movimento di catene laterali di amminoacidi situati in

prossimita dell’eme stesso. L’His 64, detta distale, e un residuo non legato covalen-

temente all’eme che svolge un ruolo cruciale per l’attivita di trasporto dell’ossigeno

da parte della Mb in quanto assiste la coordinazione dell’ossigeno al ferro eminico;

l’His 93, detta prossimale, contribuisce a trattenere il ferro all’interno dell’eme

(Figura 2.3).

Il sito attivo della Mb presenta molte analogie strutturali con quello di alcune

perossidasi, sia per la presenza del gruppo prostetico che delle due istidine: essa

e quindi in grado di catalizzare anche reazioni ossidative di substrati micro e ma-

cromolecolari da parte di perossidi come il perossido di idrogeno o alchilperossidi.

24

2.2 Le emeproteine

Figura 2.3: Struttura dell’eme e di alcuni residui presenti nel sito catalitico dellamioglobina.

2.2.2 Citocromo C

Il CytC e una piccola proteina globulare le cui dimensioni sono 2.6∗3.0∗3.2 nm3 e

il cui peso e 12360 Da.

L’atomo di ferro legato all’eme e esacoordinato, con i residui His 23 e Met 80 ad

occupare la quinta e sesta posizione di coordinazione del metallo.

Il gruppo eme (tipo c) e legato covalentemente, attraverso due legami tioetere,

alla catena polipeptidica ed esattamente ai residui 14 e 17. Un legame di questo

tipo fa si che l’eme si trovi piu vicino alla parte N-terminale della catena rispetto

a quanto accade per l’eme non covalentemente legato della Hb e Mb. Cio non

e inaspettato in virtu delle diverse funzioni del CytC rispetto alle proteine che

trasportano ossigeno.

Una estremita del gruppo eme e quindi esposta verso l’esterno e numerosi residui

di Lys sono posizionati vicino o attorno alla tasca eminica, che risulta essere una

regione carica positivamente. Questa carica positiva intorno al sito catalitico e

implicata nell’interazione tra il CytC e i suoi partner redox nei processi di trasfe-

rimento elettronico.

25

2.2 Le emeproteine

Figura 2.4: Struttura del citocromo C.

In generale quando si parla di CytC ci si riferisce alla proteina mitocondriale, re-

sponsabile del trasporto di elettroni dalla citocromo C reduttasi alla citocromo C

ossidasi nel processo di respirazione cellulare. Durante quest’ultimo il CytC viene

ridotto e si sposta nella membrana interna del mitocondrio, dove interagisce con

la citocromo C ossidasi cedendole un elettrone.

Come biocatalizzatore [21] il Cytc presenta alcuni vantaggi:

• l’eme legato covalentemente alla proteina puo costituire un vantaggio nel caso

in cui la catalisi avvenga in solvente organico in quanto la perdita dell’eme

e impedita;

• e uno dei pochi enzimi attivo in un range di pH molto ampio;

• il CytC e in grado di catalizzare reazioni fino a temperature di 120 ◦C, con

un massimo di attivita raggiunto a 80 ◦C;

• il basso costo e l’elevata stabilita sono due dei principali fattori per il suo

possibile impiego in biocatalisi su larga scala.

Il CytC mostra attivita di tipo perossidasico, essendo in grado di catalizzare rea-

zioni di ossidazione di molecole ricche di elettroni in presenza di H2O2.

26

2.2 Le emeproteine

La Met 80, che occupa la sesta posizione di coordinazione del ferro dell’eme, ha

un ruolo importante nel determinare la capacita catalitica dell’enzima: la presen-

za di questo residuo amminoacidico nel sito attivo determina la minore efficienza

come perossidasi del CytC rispetto a una vera perossidasi. Tuttavia, la rottura

del legame Fe-S (Met) puo facilitare l’accesso del substrato (H2O2) nel sito attivo

dell’enzima e migliorarne l’attivita perossidasica.

2.2.3 Interazione di emeproteine con materiali nanostrutturati

Molti gruppi di ricerca hanno posto l’attenzione sull’effetto che i nanomateriali

posso avere sulla struttura, sulla stabilita e attivita di emeproteine, quali la Mb e

il CytC.

L’adsorbimento di queste proteine su nanoparticelle di silice e stato indagato dal

punto di vista strutturale tramite dicroismo circolare e spettroscopia UV. E stato

visto che la Mb, proteina soft, tende a legarsi alla superficie modificando lievemen-

te la sua struttura secondaria e terziaria; mentre il CytC, proteina hard, si lega

senza subire alterazioni significative della configurazione nativa [22].

Dal punto di vista della funzionalita biologica di tali molecole, i dati di letteratura

sono in genere di tipo qualitativo e comunque carenti.

Per quanto riguarda la Mb, ci sono soltanto studi condotti su materiali silicei di

tipo mesoporoso, i quali riportano una ritenzione di attivita catalitica della pro-

teina immobilizzata.

Nel caso del CytC, studi riguardanti l’interazione con derivati silicei mesoporosi

riportano un aumento dell’attivita perossidasica della proteina dovuta a cambia-

menti dello stato di spin del ferro dell’eme [23].

I dati di letteratura riguardanti l’attivita catalitica del CytC adsorbito su nano-

particelle di silice sono piuttosto controversi [24] [25].

L’interazione della Mb e del CytC con fosfati e fosfonati di zirconio e stata indagata

utilizzando essenzialmente materiali di tipo lamellare e di dimensioni micrometri-

27

2.3 Attivita perossidasica e studi cinetici

che.

I dati disponibili sulla Mb riportano di solito una diminuzione dell’attivita catali-

tica della proteina adsorbita su fosfati e fosfonati di zirconio [26].

Studi riguardanti la struttura e l’attivita perossidasica del CytC adsorbito su

α-ZrP evidenziano un aumento dell’attivita catalitica della proteina come conse-

guenza di modifiche dello stato di coordinazione del ferro dell’eme [17].

In conclusione, nonostante l’adsorbimento di proteine sia un argomento di ricerca

molto indagato, sono ancora pochi i risultati ottenuti in termini di modulazione

dell’attivita catalitica con materiali nanostrutturati.


Le perossidasi sono enzimi che, sulla base della loro sequenza amminoacidica e

della struttura ai raggi X, possono essere raggruppati in due grandi famiglie a

seconda che siano di origine vegetale o animale.

Nelle piante esse svolgono molte funzioni tra le quali quella di difesa da agenti

patogeni, contribuendo alla sintesi della parete cellulare grazie alla loro capacita

di produrre composti polimerici.

Negli animali le perossidasi svolgono funzioni di tipo antibatterico (lattoperossi-

dasi nel latte, nella saliva e nelle lacrime), biosintetico (tiroide perossidasi nella

sintesi di ormoni tiroidei, prostaglandina H sintasi nel metabolismo dei lipidi) e di

eliminazione di agenti nocivi per la cellula.

Le perossidasi catalizzano reazioni di ossidazione di substrati da parte di perossidi

come il perossido di idrogeno:

2SH +H2O2 → 2S + 2H2O

Il ciclo catalitico prevede la formazione di due intermedi enzimatici, chiamati

Composto I e Composto II, con elevato potere ossidativo e l’ossidazione monoe-

lettronica dei substrati (Figura 2.5). Gli intermedi sono stati caratterizzati grazie

all’utilizzo di diverse tecniche spettrofotometriche quali UV-Vis e RAMAN.

28


Figura 2.5: Meccanismo di reazione delle perossidasi.

Nella prima fase del ciclo catalitico il perossido di idrogeno si coordina al ferro

(Fe3+) dell’eme nella forma nativa con formazione di un perosso-composto del ferro

a basso spin. L’His presente in prossimita dell’eme nella cavita distale promuove

la coordinazione appena descritta.

Il perosso-composto ha un tempo di vita estremamente limitato e subisce la rot-

tura eterolitica del legame O-O. L’intermedio che si forma, il composto I, e un

radicale catione porfirinico ed ha il ferro, in stato d’ossidazione IV, legato ad un

atomo di ossigeno.

29


Il Composto I ha un’elevata tendenza ad estrarre un elettrone da substrati che ne

sono ricchi trasformandosi nel Composto II, che ha perso la caratteristica di radi-

cale catione ma presenta il ferro ancora nello stato IV legato all’ossigeno. Questa

specie ha un elevato potere ossidativo, anche se minore del Composto I, ed inte-

ragisce con un’altra molecola di substrato trasformandolo in radicale. L’enzima

ritorna quindi nella forma nativa (Fe3+) e l’ossigeno ferrilico viene rilasciato sotto

forma di una molecola di acqua.

Lo stadio lento dell’intero ciclo e solitamente il terzo, ovvero l’ossidazione della se-

conda molecola di substrato. Durante il ciclo catalitico si puo avere la formazione

di altri intermedi: il piu importante tra questi e il Composto III, specie poco attiva

dal punto di vista dell’attivita perossidasica, che si forma a partire dal Composto

II per eccesso di H2O2.

Non essendoci selettivita per i substrati alcune proteine con attivita perossidasica

possono catalizzare reazioni diverse come solfonazioni di solfuri, epossidazioni di

stireni, N-dealchilazioni di ammine ed anche ossidazioni di substrati inorganici

come I− e SCN−.

I substrati tipici per le perossidasi sono i composti fenolici che rappresentano una

delle principali famiglie di sostanze inquinanti nel settore agroindustriale. Da qui

il crescente interesse riguardo le perossidasi in ambito biotecnologico per il loro

utilizzo in processi di decontaminazione ambientale. L’attivita perossidasica puo

anche essere sfruttata per produrre sostanze ad azione antibatterica o antimicro-

bica.

Il substrato utilizzato in questo lavoro per studiare l’attivita catalitica della Mb e

del CytC e il 2-metossifenolo o guaiacolo (Figura 2.6).

Il substrato nel ciclo catalitico delle perossidasi reagisce nel secondo e terzo stadio

in una sorta di meccanismo tipo ping-pong trimolecolare. E pero possibile ridurlo

a bimolecolare in quanto il Composto I, che ha un potere ossidativo elevato, e

presente in concentrazioni cosi basse da poter essere trascurato.

30


Figura 2.6: Reazione di ossidazione del guaiacolo.

L’equazione cinetica che descrive il processo e la seguente:

V =kcat[E]

1 + KM1H2O2

+ KM2[S]

(2.11)

dove kcat e la costante di velocita della reazione globale, KM1 e KM2 sono le

costanti di Michaelis-Menten dei processi 1 e 3 e [E] e la concentrazione totale di

enzima.

Utilizzando un elevata concentrazione di perossido di idrogeno si puo trascurare il

secondo termine a denominatore e l’equazione cinetica acquista una forma simile

a quella di Michaelis-Menten:

V =kcat[E]

1 + KM2[S]

=kcat[E][S]

[S] +KM2(2.12)

L’equazione 2.12 puo assumere la forma seguente:

V =VMAX [S]

[S] +KM2(2.13)

dove VMAX = kcat[E]. Durante il turnover la specie enzimatica presente nel sistema

in forma maggioritaria e il Composto II e la velocita di reazione registrata e quella

relativa allo step 3:

31


CompostoII + SH → E(Fe3+) + S·

In condizioni di saturazione di perossido di idrogeno il processo enzimatico si puo

assimilare al seguente:

CompostoII + SHk1−−⇀↽−−

k−1

CompostoII − SH k2−⇀↽−E + P

kcat = k2 KM =k−1 + k2

k1

kcatKM

=k1k2

k−1 + k2(2.14)

Nel caso in cui k2 � k−1 si ha che KM = k−1/k1, espressione che rappresenta la

costante di dissociazione del complesso CompostoII-S per cui si puo affermare che

la KM e una misura dell’affinita dell’enzima per il substrato. Il valore di questo

parametro e legato all’energia del complesso substrato-specie attiva e tanto piu e

piccolo il suo valore piu e favorita la formazione del complesso. Il valore di KM

per un enzima e specifico per ogni substrato, in determinate condizioni di pH e

temperatura.

Il termine kcat e legato al trasferimento elettronico dal substrato alla specie atti-

va; un valore elevato di questo parametro e indice di un piu facile trasferimento

elettronico.

Il rapporto kcat/KM tiene conto di tutti i fattori prima considerati ed e utilizzato

come indice della capacita catalitica dell’enzima in condizioni di basse concentra-

zioni di substrato: un valore elevato di questo rapporto indice di buona efficienza

nel processo catalitico.

In condizioni di forte eccesso di H2O2 si puo avere l’inattivazione della proteina

per formazione del Composto III non piu attivo. E necessario ottimizzare la quan-

tita di perossido di idrogeno, studiando l’andamento della velocita di reazione in

funzione della concentrazione di perossido e scegliendo quella a saturazione, cor-

rispondente a un punto sul plateau, prima che la curva inizi la fase discendente,

indice di inibizione (formazione del Composto III) o inattivazione dell’enzima.

Per seguire l’andamento della velocita in funzione della concentrazione di perossido

32


di idrogeno occorre operare con forte eccesso di substrato, cosı da poter trascu-

rare il termine KM2/[S] nella equazione 2.11. Tuttavia, per evitare inibizione da

substrato, anche la concentrazione di quest’ultimo deve essere ottimizzata. L’ot-

timizzazione delle condizioni di reazione avviene pertanto con processo iterativo.

Per gli studi cinetici si seguono gli istanti iniziali della reazione in modo da conside-

rare le concentrazioni istantanee pari a quelle iniziali e da mettersi nelle condizioni

di pseudo ordine zero. Questa scelta permette anche di trascurare l’eventuale for-

mazione di derivati, ottenuti dalla ricombinazione dei prodotti di reazione, che si

suppone non si verifichi negli istanti iniziali del processo.

Le reazioni vengono seguite per mezzo di uno spettrofotometro UV-Vis osservan-

do l’andamento nel tempo dell’assorbanza nella regione delle bande caratteristiche

del prodotto.

Negli istanti iniziali si osserva un andamento lineare dell’assorbanza in funzio-

ne del tempo, la cui pendenza (dA/dt) fornisce la velocita di reazione secondo

l’equazione:

dA

dt= l · ε · d[P ]

dt(2.15)

dove l e il cammino ottico della cuvetta utilizzata, ε e il coefficiente di estinzione

molare del prodotto e d[P ]/dt e la velocita.

I parametri cinetici vengono ricavati riportando i dati relativi alla velocita in

funzione della concentrazione di substrato e interpolando la curva con l’equazione

2.12 (Figura 2.7).

33

2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina-ligando

Figura 2.7: Profilo della velocita di reazione in funzione della concentrazione disubstrato.


Le funzioni di molte proteine richiedono il legame con altre molecole dette ligandi.

L’interazione proteina-ligando e reversibile e dipende dalla struttura della protei-

na; inoltre si associa spesso a modificazioni conformazionali che ne influenzano

l’attivita e la specificita.

Il legame tra una proteina (E) ed un ligando (L) determina la formazione del

complesso EL:

E + L ⇀↽ EL

KB =[EL]

[E][L]= costante di associazione (2.16)

KD =1

KB= costante di dissociazione (2.17)

La KD esprime l’affinita dei una proteina per il ligando (piu basso e il suo valore,

piu l’interazione proteina-ligando e forte).

34


Nel caso della Mb, la coordinazione del ferro nel gruppo eme determina la possi-

bilita di legame con molecole quali l’imidazolo e l’azide [27] [28].

Queste sono infatti in grado di penetrare all’interno del sito attivo e coordinarsi

all’atomo di ferro, prendendo il posto della molecola di acqua che si trova debol-

mente legata, occupando la sesta posizione di coordinazione.

Dato che questi ligandi instaurano un legame forte con il ferro, al contrario del-

l’acqua, la proteina passa da uno stato esa-coordinato ad alto spin (6c-HS) ad uno

stato esa-coordinato a basso spin (6c-LS).

Queste due forme possiedono assorbimenti nella regione Soret differenti tra loro.

Durante la formazione del complesso per aggiunte successive di ligando, le specie

presenti in soluzione sono due ed in equilibrio fra di loro. Pertanto l’assorbanza

della soluzione, per ciascun valore di λ, e dato dalla somma delle assorbanze delle

due specie:

A = AE(6c−HS)+AEL(6c−LS)

= εE ∗ cE + εEL ∗ cEL (2.18)

Sapendo che [E0] = [EL] + [E] e [L0] = [EL] + [L], si puo ricavare, unitamente

alla 2.16, un’espressione matematica per [EL].

Sperimentalmente si misura la variazione di assorbanza di soluzioni a concentra-

zione fissa di enzima a cui sono aggiunti volumi fissati di soluzioni di legando a

titolo noto; essa dipende direttamente dalla frazione di enzima legata al legando,

in accordo con l’equazione 2.19:

∆A = ∆A∞[EL]

[E0](2.19)

dove ∆A indica la variazione di assorbanza dopo ogni aggiunta rispetto al valore

ottenuto per la proteina non complessata e ∆A∞ e la variazione di assorbanza

quando tutto l’enzima e legato.

Sostituendo la [EL] precedentemente trovata nell’equazione 2.19 si ottiene l’equa-

35


zione 2.20:

∆A =∆A∞

2[E0]KB

{KB([E0] + [L0]) + 1−

√K2

B([L0]− [E0])2 + 2KB([L0] + [E0]) + 1

}(2.20)

Riportando in grafico ∆A in funzione [L0] e fittando la curva ottenuta con l’equa-

zione precedente, si possono ottenere i valoti di KB e ∆A∞.

36

Capitolo 3

Scopo del lavoro

Lo scopo di questo lavoro di tesi e studiare il comportamento di sistemi proteici

nel momento in cui vengono a contatto con materiali di dimensioni nanometriche.

Le proteine scelte, quali la Mb e il CytC, sono comuni enzimi presenti nel nostro

organismo, dove svolgono un ruolo cruciale in processi biologici vitali.

I materiali nanostrutturati scelti, la silice e il fosfato di zirconio, appartengono

alla classe di materiali inorganici aventi caratteristiche superficiali di tipo idrofi-

lico. Entrambi possiedono dimensioni comprese tra 20 e 40 nm e gruppi ossidrile

in superficie con carattere acido.

Vista l’enorme diffusione delle nanotecnologie in numerosi ambiti puo risultare

facile per materiali nanostrutturati di tal genere venire a contatto con sistemi di

natura biologica. E quindi fondamentale capire che tipo di risposta danno sistemi

che sovrintendono a processi vitali per l’organismo, quali proteine ed enzimi, in

presenza di materiali di questo tipo.

Il primo passo da fare per seguire tale obiettivo e cercare di capire se la presenza

di nanoparticelle modifica la proprieta principale che un enzima possiede, ovvero

l’attivita catalitica. Se c’e un cambiamento della velocita del processo preso in

esame significa che le nanoparticelle in qualche modo interferiscono con il normale

decorso reattivo e quindi si e, molto probabilmente, in presenza di un’interazione

tra la proteina e la superficie del materiale nanometrico. L’assenza di modifiche

nell’attivita catalitica di un enzima non necessariamente esclude l’interazione tra

37

3. Scopo del lavoro

la proteina e il materiale, poiche potrebbe comunque essere avvenuta senza com-

portare variazioni nella funzionalita del sistema.

L’instaurarsi di interazioni proteina-materiali si puo in genere verificare tramite

recupero del biocomposito, ovvero della proteina adsorbita, dal mezzo di reazione

tramite centrifugazione. Tale procedura consente inoltre di quantificare la protei-

na adsorbita per differenza con quella ritrovata nel surnatante. Il biocomposito

cosi ottenuto puo essere utilizzato in biocatalisi ma si e visto che molto spesso

in questo modo si altera in maniera negativa l’attivita catalitica della proteina in

seguito alla centrifugazione.

In questo lavoro, la scelta di utilizzare materiali sotto forma di nanoparticelle ha

consentito di testare direttamente l’attivita catalitica delle proteine, senza bisogno

di recuperare il biocompostito per centrifugazione. Questo perche le sospensioni

di nanoparticelle sono otticamente semi-trasparenti e consentono di limitare al

minimo il fenomeno dello scattering.

Una volta stabilito che si instaura una interazione proteina-nanoparticelle il pas-

so successivo e capire se l’interazione ha portato come conseguenza cambiamenti

conformazionali, i quali a loro volta potrebbero essere la causa della modificazione

dell’attivita catalitica osservata.

Tramite studi di tipo spettroscopico e possibile stabilire se l’interazione provoca

cambiamenti a livello della struttura secondaria e terziaria della proteina e, in par-

ticolare per le emeproteine, se la regione del sito attivo e il gruppo eme subiscono

modifiche.

Successivamente, sulla base di informazioni strutturali che si hanno a disposizione

sia per il materiale che per la proteina, e possibile fare delle ipotesi sulla natura

dell’interazione e condurre esperimenti mirati a confermare tale ipotesi. Ad esem-

pio, in presenza di interazioni elettrostatiche si ha una significativa dipendenza

dell’adsorbimento dalla forza ionica. Un aumento di tale parametro comporta il

rilascio della proteina dalla superficie, confermando la natura elettrostatica del-

l’interazione.

38

3. Scopo del lavoro

La possibilita di derivatizzare superficialmente la silice ha inoltre consentito di

variare le cariche presenti, passando da gruppi ossidrili a gruppi amminici, al fi-

ne di vedere l’effetto sull’adsorbimento delle proteine in esame ed eventualmente

confermare ulteriormente la natura elettrostatica dell’interazione.

Un altro punto molto importante da chiarire e in quale zona della superficie pro-

teica e avvenuta l’interazione con il nanomateriale. In questo modo e possibile

capire se ci possono essere delle ripercussioni sul sito attivo della proteina stessa.

Questo aspetto e stato affrontato tramite studi riguardanti la complessazione della

Mb con ligandi carichi quali ad esempio l’azide.

Una eventuale interazione coinvolgente la zona del sito attivo comporterebbe infat-

ti ripercussioni non solo sull’attivita catalitica ma anche sulle costanti di equilibrio

per la formazione del complesso proteina-ligando.

39

Capitolo 4

Risultati e discussione

In questo lavoro di tesi si e voluto indagare il comportamento di due emeproteine,

la Mb e il CytC, in presenza di materiali nanostrutturati.

Dati i punti isoelettrici delle proteine, 7.2 per la Mb e 10.2 per il CytC, il ma-

teriale che meglio si adatta ad un’interazione di tipo elettrostatico deve possede-

re una superficie carica negativamente a pH fisiologico. Per questo motivo si e

scelta inizialmente la silice colloidale commercialmente nota come Ludox TM-40.

La sospensione Ludox TM-40 ha tutte le caratteristiche richieste per il tipo di

problematica che si vuole affrontare:

• sospensione colloidale in H2O (40% in peso di silice);

• densita 1,3 g/mL a 25 ◦C;

• dimensione delle nanoparticelle 20-30 nm;

• area superficiale 140 m2/g;

• pH ∼ 9;

• pI ∼ 2.

La gran parte dei lavori di letteratura riportano l’utilizzo di nanoparticelle di si-

lice, o suoi derivati, di dimensioni micrometriche o dell’ordine dei 100 nm. Per

questo lavoro si e utilizzata silice con dimensioni piu piccole, 20-nm, confrontabili

40

4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice LudoxTM-40

con quelle degli enzimi di interesse (4-5 nm). Cio garantisce infatti un’ampia area

superficiale e quindi la possibilita di interazione per un elevato numero di moleco-

le.

Inoltre, un punto isoelettrico di due assicura che, a pH sperimentale (pH 7), la

superficie delle nanoparticelle e carica negativamente e quindi potenzialmente in

grado di interagire con Mb e CytC.

I gruppi OH della silice possono essere facilmente sostituiti con funzionalita di va-

rio tipo: ammine, aldeidi, gruppi carbossilici, tioli, epossidi e gruppi etero-atomici.

Esistono vari metodi per ottenere nanoparticelle di silice funzionalizzate. Ad esem-

pio, si puo effettuare la condensazione del TEOS con appropriati silani contenenti

i gruppi funzionali desiderati oppure derivatizzare successivamente la silice con il

silano.

Nel nostro caso, e stata utilizzata la seconda procedura per introdurre gruppi am-

minici sulla superficie.

La silice Ludox TM-40 e stata fatta reagire con l’amminopropiltrietossisilano

(APTES) secondo lo schema riportato in Figura 4.1 [29].

Figura 4.1: Sintesi di nanoparticelle di SiO2-APTES.

4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle disilice Ludox TM-40

4.1.1 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2

Nella prima fase di questo lavoro si e studiato il comportamento della Mb in pre-

senza di nanoparticelle di silice Ludox TM-40.

Il primo punto affrontato e stato lo studio dell’attivita catalitica della Mb al variare

41


della concentrazione di nanoparticelle di Ludox TM-40: e stata seguita la reazione

di ossidazione del guaiacolo catalizzata dalla Mb e mediata da H2O2 in tampone

fosfato 10 mM e pH 7, in presenza di concentrazioni variabili di nanoparticelle.

La reazione che porta alla formazione di un tetramero colorato e stata seguita allo

spettrofotometro UV-Vis alla lunghezza d’onda di 470 nm. La velocita iniziale

rilevata per ogni esperimento e stata confrontata con quella riscontrata con la Mb

nativa.

I dati ottenuti evidenziano che la velocita della reazione di ossidazione aumen-

ta al crescere della concentrazione di nanoparticelle in soluzione (Figura 4.2 e

Figura 4.3). Questo risultato indica che mettendo a contatto nanoparticelle con

superficie carica negativamente con la proteina (globalmente neutra nelle condizio-

ni sperimentali) si stabilisce un’interazione che ha un effetto positivo sull’attivita

catalitica della Mb.

Per avere la conferma che la Mb interagisce con la superficie del nanomateriale,

la proteina e stata messa a contatto con campioni contenenti concentrazioni cre-

scenti di nanoparticelle (sono state usate le stesse concentrazioni relative di Mb e

di nanoparticelle utilizzate per gli esperimenti di attivita catalitica). Dopo aver

centrifugato i campioni, e stata misurata la concentrazione residua di Mb nel sur-

natante ed e stato verificato che oltre il 90 % della proteina totale si adsorbe sulla

superficie della silice.

42


Figura 4.2: Variazione di assorbanza (λ = 470 nnm) in funzione del tempo perla reazione di ossidazione del guaiacolo catalizzata dalla mioglobina, in presenzadi nanoparticelle di SiO2.

Figura 4.3: Attivita catalitica della mioglobina nella reazione di ossidazione delguaiacolo, mediata da H2O2, in funzione della concentrazione di Ludox TM-40.

Ulteriori informazioni sull’effetto che le nanoparticelle hanno sulla Mb si pos-

43


sono ottenere determinando i parametri cinetici kcat e KM , per la reazione di

ossidazione del guaiacolo in presenza di silice e confrontarli con quelli della Mb

nativa.

I profili cinetici sono stati ricavati a due diverse concentrazioni di nanoparticelle

e sono riportati nella Figura 4.4.

Figura 4.4: Profili di Michaelis-Menten della mioglobina per la reazione di ossi-dazione del guaiacolo, mediata da H2O2, in presenza di diverse concentrazioni diLudox TM-40.

I parametri cinetici ottenuti sono riportati nella Tabella 4.1 per confrontarli con

quelli della Mb nativa. Le nanoparticelle di silice determinano una diminuzione

della kcat e una diminuzione della KM che, complessivamente, portano ad un au-

mento dell’efficienza catalitica dell’enzima. La diminuzione dei parametri cinetici

e piu significativa a concentrazioni minori di silice.

La variazione dei parametri cinetici della Mb in presenza di nanoparticelle di si-

lice da un’indicazione del fatto che la proteina interagisce con la superficie delle

nanoparticelle.

44


Tabella 4.1: Costanti catalitiche della mioglobina per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2 ([Mb] = 1 µM, [H2O2] = 76 mM, tampone fosfato10 mM e pH 7).

Ludox TM-40 Mb/Ludox TM-40 kcat KM kcat/KM

(mg/mL) (mg/g) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

- - 1.7 ± 0.1 81 ± 6 0.021 ± 0.002

1 17.8 0.66 ± 0.03 13 ± 2 0.050 ± 0.006

10 1.78 1.3 ± 0.1 24 ± 2 0.053 ± 0.005

La Mb (pI pari a 7,2), pur essendo complessivamente neutra a pH di lavoro, ha

numerosi residui amminoacidici carichi positivamente e, messa a contatto con na-

noparticelle di silice (pI pari a 2) la cui superficie e carica negativamente, puo

stabilire interazioni di tipo elettrostatico con la superficie.

4.1.2 Spettri UV-Vis della mioglobina in presenza di SiO2

Gli spettri di assorbimento nella regione UV-Vis delle emeproteine riflettono in

maniera predominante la struttura elettronica della porfirina che costituisce l’e-

me. La configurazione elettronica dell’atomo di ferro perturba lo spettro della

porfirina stessa. A sua volta la configurazione elettronica del ferro e influenzata

dalle interazioni di quest’ultimo con gli atomi dei leganti che occupano la quinta

e sesta posizione di coordinazione (leganti assiali).

Nella Mb l’anello tetrapirrolico della porfirina presenta un esteso sistema aroma-

tico delocalizzato che da origine ad una transizione di elettroni π −→ π∗, carat-

terizzata da una intensa banda di assorbimento nel vicino UV intorno a 409 nm

detta banda di Soret (o banda B). Altre bande, molto meno intense, sono presenti

a lunghezze d’onda maggiori: due a 505 e 534 nm, dette bande Q, e una intorno

a 650 nm (banda CT1) e danno indicazioni sullo stato di ossidazione, sullo stato

di spin dell’atomo di ferro e sui leganti di tipo assiale.

Lo spettro UV-Vis della Mb puo essere utile per ottenere informazioni su eventua-

li cambiamenti strutturali della proteina, indotti nella regione circostante il sito

45


attivo e l’eme in seguito alla formazione del legame con nanoparticelle di silice.

Gli spettri UV-Vis della Mb nativa e della Mb in presenza di silice Ludox TM-40,

nelle stesse condizioni sperimentali (tampone fosfato 10 mM e pH 7), sono ripor-

tati in (Figura 4.5).

Figura 4.5: Spettro UV-Vis della mioglobina nativa e in presenza di LudoxTM-40.

Lo spettro della Mb nativa mostra il segnale molto intenso a 409 nm, due segnali

a 505 e 534 nm nella regione delle Q-bands e una banda molto meno intensa a 635

nm: l’insieme di questi segnali indica che l’ atomo di ferro e nello stato d’ossida-

zione Fe3+ ed e esacoordinato. Piu precisamente, il ferro e coordinato nel piano a

quattro atomi di azoto dell’eme e, fuori dal piano, all’azoto della His 93 e ad una

molecola di acqua nella sesta posizione di coordinazione. L’istidina e un legante

forte, mentre l’acqua e un legante debole: lo spettro di assorbimento risente della

forza dei leganti ed e uno spettro caratteristico di un complesso denominato esa-

coordinato ad alto spin (6c-HS).

46


Gli spettri registrati in presenza di nanoparticelle di silice a diverse concentrazioni

sono simili a quello ottenuto per la Mb nativa indicando che la presenza della silice

non determina un cambiamento a livello dell’eme e dello stato di spin dell’atomo

di ferro.

4.1.3 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 infunzione della forza ionica

Come e noto le proteine sono sensibili alla presenza di elettroliti, sia in termini di

concentrazione che di tipo di elettrolita.

L’interazione elettrostatica tra una proteina e una superficie carica e fortemente

dipendente dalla forza ionica. In particolare, un aumento di quest’ultima per

addizione di un elettrolita provoca una attenuazione delle cariche presenti sulla

superficie con conseguente rilascio della proteina adsorbita.

Se l’interazione elettrostatica con la superficie provoca una variazione di attivita

catalitica della proteina, un rilascio di questa dalla superficie per effetto della forza

ionica comporta un recupero dell’attivita catalitica iniziale.

Pertanto, una marcata dipendenza dell’attivita catalitica di una proteina dalla

forza ionica costituisce un indizio della presenza di interazione elettrostatica con

la superficie.

Al fine di indagare tale effetto, sono state eseguite delle prove di attivita catalitica

della Mb in presenza di nanoparticelle di SiO2 addizionando al mezzo un elettrolita

forte quale NaCl (0.2 M). Come si puo vedere dalla (Figura 4.6) l’attivita catalitica

non varia, rispetto al valore ottenuto con la Mb nativa, in presenza del sale.

47


Figura 4.6: Attivita catalitica della mioglobina in funzione della concentrazionedi Ludox TM-40, in assenza (nero) e in presenza (rosso) di NaCl 0.2 M.

Cio indica che l’interazione Mb-SiO2, responsabile dell’aumento di attivita

catalitica, e stata annullata in presenza di NaCl 0.2 M. Questo risultato conferma

l’ipotesi che l’interazione proteina-nanoparticelle sia di tipo elettrostatico.

Ulteriori indagini sono state effettuate andando ad esaminare la variazione dei

parametri cinetici in funzione della forza ionica (Tabella 4.2).

Tabella 4.2: Costanti catalitiche della mioglobina per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2, in presenza di NaCl ([Mb] = 1µM, [H2O2] = 76mM, tampone fosfato 10 mM e pH 7).

[NaCl] Ludox TM-40 kcat KM kcat/KM

(M) (mg/mL) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

- - 1.7 ± 0.1 81 ± 6 0.021 ± 0.002

0.2 - 1.7 ± 0.1 27 ± 3 0.062 ± 0.007

0.2 10 1.2 ± 0.1 17 ± 2 0.071 ± 0.008

L’addizione di NaCl 0.2 M al mezzo di reazione provoca una marcata diminuzione

della KM della Mb nativa, indice di un aumento dell’affinita per il substrato. In

48


presenza si nanoparticelle di silice si verifica una ulteriore diminuzione della KM

accompagnata da una lieve diminuzione della kcat. Complessivamente, l’efficienza

catalitica kcat/KM non viene modificata dall’aggiunta di silice quando nel mezzo

di reazione e presente un elevato valore di forza ionica.

Un ulteriore conferma di questo particolare effetto si ha variando la concentrazione

del tampone fosfato presente nel mezzo di reazione (Tabella 4.3).

Tabella 4.3: Costanti catalitiche della mioglobina per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2, in funzione della concentrazione del tamponefosfato ([Mb] = 1 µM, [H2O2] = 76 mM).

[Tampone fosfato] Ludox TM-40 kcat KM kcat/KM

(mM) (mg/mL) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

50 - 1.8 ± 0.2 50 ± 9 0.037 ± 0.008

50 10 1.1 ± 0.1 17 ± 3 0.060 ± 0.010

100 - 2.4 ± 0.3 56 ± 10 0.042 ± 0.008

100 10 1.5 ± 0.1 22 ± 4 0.070 ± 0.010

200 - 2.5 ± 0.2 42 ± 8 0.060 ± 0.010

200 10 1.7 ± 0.1 34 ± 4 0.051 ± 0.007

La variazione dei parametri cinetici in seguito all’aggiunta di nanoparticelle di SiO2

e tale da determinare, come effetto globale, un marcato aumento di kcat/KM a

basse concentrazioni di tampone. Quando la concentrazione di tampone aumenta

fino a 200 mM, la variazione di kcat/KM e meno significativa.

4.1.4 Attivita catalitica della mioglobina in presenza di SiO2-APTES

Per questo tipo di prova sono state utilizzate nanoparticelle di silice la cui superfi-

cie e stata funzionalizzata con gruppi propilamminici (SiO2-APTES) in modo da

conferire una carica positiva alla superficie delle nanoparticelle.

Nelle stesse condizioni sperimentali, cambiando il tipo di carica superficiale delle

nanoparticelle, non si ha variazione della velocita di reazione al crescere della con-

centrazione di nanoparticelle (Figura 4.7). Una elevata tendenza all’aggregazione

49


tipica di queste nanoparticelle cariche positivamente non consente di analizzare

concentrazioni molto elevate.

Gli esperimenti condotti in presenza di SiO2-APTES confermano l’importanza

delle cariche negative superficiali della silice nell’interazione con la Mb.

In presenza di cariche positive superficiali, infatti, la proteina, che pur presenta

a pH 7 alcuni residui amminoacidici carichi negativamente, non interagisce con le

nanoparticelle.

Figura 4.7: Attivita catalitica della mioglobina in funzione della concentrazionedi SiO2-APTES.

4.1.5 Stabilita della mioglobina all’inattivazione in presenza diperossido di idrogeno

Il ciclo catalitico tipico delle perossidasi, riportato in Figura 2.5, prevede l’ossi-

dazione di un substrato ricco di elettroni grazie alla mediazione di perossido di

idrogeno, senza il quale la reazione non potrebbe avvenire. Tuttavia un eccesso di

quest’ultimo substrato porta alla formazione del Composto III che rende inattivo

l’enzima. Si e voluto indagare se l’interazione Mb-SiO2 ha degli effetti sulla sta-

bilita della proteina al fenomeno dell’inattivazione.

50


Sperimentalmente si procede incubando la Mb, in un volume fisso di tampone

fosfato (10 mM e pH 7), con un volume fisso di H2O2 e, trascorso il tempo di

incubazione stabilito, si fa partire la reazione di ossidazione con il substrato.

Uno studio di questo tipo permette di capire quanto e sensibile la proteina libe-

ra alla presenza del perossido e se questa sensibilita viene esaltata o meno dalla

presenza della silice. Per gli esperimenti fatti l’inattivazione e maggiore a concen-

trazione di perossido piu alta e tanto piu spiccata quanto maggiore e il tempo di

incubazione (Figura 4.8).

Figura 4.8: Inattivazione della mioglobina in presenza di H2O2 38 mM (a) e 76mM (b).

A parita di tempo di incubazione la presenza delle nanoparticelle di silice rende piu

sensibile la proteina alla inattivazione. In conclusione, l’interazione proteina-silice

aumenta l’attivita catalitica della Mb nella reazione di ossidazione del guaiacolo

ma allo stesso tempo rende il sistema meno stabile e piu sensibile alla inattivazione

da parte di H2O2.

Tale risultato non e sorprendente in quanto molto spesso si osserva una diminuzio-

ne della stabilita enzimatica accompagnata ad un aumento dell’attivita catalitica

e viceversa.

51


4.1.6 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemimioglobina-imidazolo e mioglobina-azide

Due ligandi tipici, caratterizzati da differente carica e dimensione quali l’imidazo-

lo e l’azide, sono stati utilizzati per investigare l’affinita della Mb in presenza di

nanoparticelle di SiO2 e confrontarla con quella della Mb nativa.

Durante la complessazione della Mb con il legando l’atomo di ferro avra le due

posizioni assiali occupate da leganti forti che stabilizzano il legame; il ferro passa

da 6c-HS a 6c-LS. Questo cambiamento nello stato di spin e rilevabile spettrofo-

tometricamente in quanto le due specie hanno assorbimenti diversi.

La figura 4.9 riporta gli spettri UV-Vis per titolazione di campioni contenenti una

concentrazione fissa di Mb in tampone fosfato (10 mM a pH 7) e concentrazioni

crescenti di imidazolo.

La presenza di punti isosbestici (il piu evidente a 416 nm) assicura l’esistenza di

due specie in equilibrio tra loro: la Mb nativa e la Mb complessata.

Figura 4.9: Spettro UV-Vis della mioglobina nativa e in presenza diconcentrazioni crescenti di imidazolo.

52


La figura 4.10 mostra la variazione di ∆A, ad ogni lunghezza d’onda, per ogni

campione ottenuto addizionando volumi crescenti di imidazolo.

Figura 4.10: Variazione di ∆A in funzione di λ per la mioglobina nativa e inpresenza di concentrazioni crescenti di imidazolo.

Riportando in grafico i valori di ∆A, ad una λ fissata, in funzione della concen-

trazione di legando e utilizzando l’equazione 2.20, si puo ricavare il valore di KB.

Questa procedura e stata ripetuta in presenza di due diverse concentrazioni di

silice Ludox TM-40 per vedere se la loro presenza influisce sulla costante di for-

mazione del complesso.

In Tabella 4.4 sono riportate le costanti di associazione ottenute e i dati eviden-

ziano un aumento della KB in seguito allo stabilirsi dell’interazione della Mb con

la silice.

Si puo supporre che l’interazione dell’enzima con la silice determini un qualche

cambiamento conformazionale nell’intorno del sito attivo cosi da favorire l’entrata

dell’imidazolo nel sito attivo e il suo legame con il ferro eminico.

Un altro legando molto utilizzato per studi di binding e l’azide, che a differenza

dell’imidazolo, e una molecola molto piccola e carica negativamente.

53


Tabella 4.4: Costanti di equilibrio del sistema mioglobina-imidazolo (tamponefosfato 10 mM e pH 7).

[Mb] Ludox TM-40 KB

(µM) (mg/mL) (M−1)

3 - 156 ± 11

3 3 240 ± 74

1 10 568 ± 165

I risultati ottenuti dimostrano che l’azide si lega in maniera piu forte al ferro emi-

nico rispetto all’imidazolo. La costante di legame e rispettivamente 73000 M−1

contro 156 M−1 (Tabella 4.5).

La presenza delle nanoparticelle di SiO2 determina una marcata diminuzione della

KB per l’azide.

Questo risultato e particolarmente interessante in quanto una diminuzione di af-

finita per questa molecola in presenza di nanoparticelle di silice potrebbe essere

dovuta all’interazione della Mb con la superficie del materiale.

Una ipotesi e che tale interazione riguardi i gruppi carichi positivamente situati

intorno al sito attivo, i quali non sono piu in grado di interagire con l’azide, carica

anche essa negativamente. Cio determina una diminuzione di affinita della Mb

per questo legando.

Tabella 4.5: Costanti di equilibrio del sistema mioglobina-azide (tampone fosfato10 mM e pH 7).

[Mb] Ludox TM-40 KB

(µM) (mg/mL) (M−1)

3 - 73000 ± 4000

1 1 25000 ± 3000

1 10 14000 ± 1600

54

4.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di silice LudoxTM-40

4.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle disilice Ludox TM-40

Un altro aspetto interessante e stato studiare l’interazione della silice con una pro-

teina che presentasse caratteristiche superficiali diverse rispetto alla Mb. Il CytC

e la proteina ideale in quanto, appartiene alla classe delle emeproteine come la

Mb, ma ha un pI pari a 10.2 e, quindi, al pH sperimentale (pH 7) ha una carica

netta superficiale positiva.

4.2.1 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2

La reazione di ossidazione del guaiacolo catalizzata dal CytC, mediata da H2O2

(in tampone fosfato 10 mM e pH 7), e stata indagata in presenza di concentrazioni

crescenti di nanoparticelle di silice. La velocita iniziale rilevata per ogni esperi-

mento e stata confrontata con quella riscontrata per lo stesso processo fatto in

presenza del CytC nativo.

I dati ottenuti evidenziano che la velocita della reazione di ossidazione aumenta

al crescere della concentrazione di nanoparticelle (Figura 4.11 e Figura 4.12).

Questo risultato indica che le cariche superficiali negative della silice stabiliscono

un’interazione con la superficie del CytC che ha un effetto positivo sull’attivita ca-

talitica dell’enzima. L’effetto ottenuto e molto piu consistente di quello riscontrato

con la Mb, a parita di concentrazione di nanoparticelle.

55


Figura 4.11: Variazione di assorbanza in funzione del tempo per la reazione diossidazione del guaiacolo catalizzata dal citocromo C, in presenza di nanoparticelledi SiO2.

Figura 4.12: Attivita catalitica del citocromo C nella reazione di ossidazione delguaiacolo, mediata da H2O2, in funzione della concentrazione di Ludox TM-40.

Per quanto riguarda la determinazione dei parametri cinetici si e visto spe-

56


rimentalmente che non e possibile ricavare i valori delle costanti kcat e KM per

la reazione catalizzata dal CytC nativo in quanto tale sistema non segue il mo-

dello di Michaelis-Menten. In particolare, con il CytC non e possibile costruire

un profilo cinetico della reazione di ossidazione al variare della concentrazione di

H2O2 poiche si ottiene un grafico dall’andamento lineare. La mancata saturazio-

ne all’aumentare della concentrazione di perossido indica che lo stadio lento del

processo e il primo, ovvero la formazione del Composto I.

Per questo motivo non si possono ricavare i parametri cinetici per la reazione con

il guaiacolo.

La presenza delle nanoparticelle di silice determina un effetto particolare sul CytC

al punto che, in queste condizioni, e possibile ricavare i parametri cinetici (Tabel-

la 4.6). Questo risultato e particolarmente interessante poiche le nanoparticelle

non solo aumentano l’attivita catalitica della proteina ma la portano a lavorare

come una vera perossidasi.

Figura 4.13: Profilo cinetico del citocromo C per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2, in presenza di diverse concentrazioni di LudoxTM-40.

57


Tabella 4.6: Costanti catalitiche del citocromo C per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2 ([CytC] = 1 µM, [H2O2] = 76 mM, tamponefosfato 10 mM e pH 7).

Ludox TM-40 CytC/Ludox TM-40 kcat KM kcat/KM

(mg/mL) (mg/g) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

0.15 82.4 0.38 ± 0.02 0.012 ± 0.002 33 ± 5

1.5 8.2 0.61 ± 0.02 0.016 ± 0.001 38 ± 4

All’aumentare della concentrazione di nanoparticelle, si ha un aumento sia della

kcat che della KM analogamente a quanto osservato per la Mb. Complessivamente

il parametro kcat/KM rimane pressoche invariato.

4.2.2 Spettri UV-Vis del citocromo C in presenza di SiO2

Lo spettro di assorbimento nella regione UV-Vis del Cytc in presenza di nano-

particelle di silice puo fornire informazioni su eventuali cambiamenti strutturali

indotti nella regione circostante il sito attivo e l’eme dalla formazione del legame

con le nanoparticelle stesse.

Dall’osservazione degli spettri in Figura 4.14 si puo vedere che la presenza della

silice non determina un cambiamento della banda di Soret (409 nm), che e simile

a quella ottenuta per l’enzima nativo.

Per vedere meglio eventuali cambiamenti delle Q-bands e stato registrato lo spet-

tro utilizzando una concentrazione piu elevata di proteina (riquadro in alto nella

Figura 4.14): anche in questo caso i segnali sono sovrapponibili a quelli del CytC

nativo. Cio indica che le nanoparticelle non inducono cambiamenti strutturali

che coinvolgono il sito attivo ne cambiamenti nello stato di ossidazione e di spin

dell’atomo di ferro dell’eme.

58


Figura 4.14: Spettro UV-Vis del citocromo C nativo e in presenza di LudoxTM-40.

4.2.3 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 infunzione della forza ionica

L’aumento della forza ionica in soluzione determina un effetto sulla velocita di

ossidazione del guaiacolo da parte del CytC analogo a quello indotto sulla Mb.

In particolare, la presenza di NaCl (0.2 M) comporta un annullamento dell’effetto

riscontrato in presenza di nanoparticelle di silice (Figura 4.15). Anche in questo

caso l’ipotesi che l’interazione proteina-superficie sia di tipo elettrostatico viene

confermata da questo esperimento.

59


Figura 4.15: Attivita catalitica del citocromo C in funzione della concentrazionedi Ludox TM-40, in assenza (nero) e in presenza (rosso) di NaCl 0.2 M.

4.2.4 Attivita catalitica del citocromo C in presenza di SiO2-APTES

Analogamente a quanto fatto con la Mb, e stata studiata la reazione di ossidazione

del guaiacolo in presenza di concentrazioni crescenti di silice derivatizzata (SiO2-

APTES) ed e stato visto che la velocita rimane pressoche invariata rispetto a

quella ottenuta con l’enzima nativo (Figura 4.16).

60


Figura 4.16: Attivita catalitica del citocromo C in funzione della concentrazionedi SiO2-APTES.

4.2.5 Stabilita del citocromo C all’inattivazione in presenza diperossido di idrogeno

Sono state infine eseguite alcune prove per verificare la stabilita della proteina

(nativa e in presenza di silice) alla inattivazione da parte di H2O2.

L’incubazione dell’enzima nativo con il perossido determina la quasi totale inat-

tivazione dell’enzima stesso: in presenza di H2O2 38 mM, trascorso un tempo di

incubazione di 3 minuti, l’enzima ha perso il 70 % della sua capacita catalitica;

un tempo di incubazione di tre minuti in presenza di H2O2 76 mM determina la

completa inattivazione dell’enzima. La presenza delle nanoparticelle di silice, a

parita di tempo di incubazione, accentua tale fenomeno. La sensibilita della pro-

teina alla inattivazione e maggiore se si utilizza una quantita maggiore di H2O2

(Figura 4.17).

L’interazione CytC-silice aumenta l’attivita catalitica del CytC nella reazione di

ossidazione del guaiacolo ma allo stesso tempo rende il sistema, gia di per se sen-

sibile alla presenza di perossido, molto meno stabile e molto piu sensibile alla

inattivazione stessa.

61

4.3 Interazione di emeproteine con α-ZrP in forma nanostrutturata

L’effetto sull’attivita catalitica e sulla stabilita all’inattivazione sono entrambi piu

marcati rispetto a quelli riscontrati sulla Mb.

Figura 4.17: Inattivazione del citocromo C in presenza di H2O2 38 mM (a) e 76mM (b).

4.3 Interazione di emeproteine con α-ZrP in formananostrutturata

Per validare il modello di interazione elettrostatica proteina-superficie e stato pre-

so in esame un materiale che avesse lo stesso tipo di carica superficiale e dimensioni

analoghe alla silice Ludox TM-40.

In particolare, si e voluto vedere se l’effetto ottenuto con la silice fosse peculiare

di questo supporto oppure di carattere generale e riscontrabile con qualsiasi ma-

teriale avente carica superficiale negativa.

Il composto scelto e il fosfato di zirconio (α-ZrP) in forma di nanoparticelle. La sin-

tesi di queste nanoparticelle, effettuata presso il laboratorio di Chimica Inorganica

del Dipartimento di Chimica di Perugia, consiste nella idrolisi del propionato di

zirconile con acido ortofosforico in alcool. Tramite questa procedura si ottengono

particelle piatte, con dimensione planare di circa 30-40 nm, e spessore dell’ordine

di qualche nanometro (Figura 4.18).

62


Figura 4.18: Immagine TEM di nanoparticelle di α-ZrP.

4.3.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di α-ZrP

Gli studi riguardanti l’attivita catalitica della Mb nella reazione di ossidazione

del guaiacolo, mediata da H2O2 (in tampone fosfato 10 mM e pH 7), hanno evi-

denziato un consistente aumento della velocita di reazione in presenza di α-ZrP

(Figura 4.19).

A parita di concentrazione di nanoparticelle e di condizioni sperimentali, la velo-

cita che si ottiene in presenza di α-ZrP e 15 volte superiore a quella ottenuta in

presenza di silice.

63


Figura 4.19: Attivita catalitica della mioglobina in funzione della concentrazionedi α-ZrP.

Inoltre, introducendo nell’ambiente di reazione NaCl 0.2 M e mantenendo inal-

terate le altre condizioni sperimentali si ottengono velocita di reazione molto piu

basse rispetto a quelle rilevate utilizzando il fosfato di zirconio (Figura 4.20). Ri-

mane comunque un certo grado di attivazione rispetto alla reazione eseguita con

la sola proteina (Figura 4.20, linea rossa).

Tale risultato indica che la presenza di un elettrolita compete con l’interazione

proteina-nanoparticelle, annullandone l’effetto.

64


Figura 4.20: Attivita catalitica della mioglobina in funzione della concentrazionedi α-ZrP in assenza (nero) e in presenza (rosso) di NaCl 0.2 M.

I valori delle costanti catalitiche ottenute sono riportati in Tabella 4.7: si

evidenzia una consistente diminuzione della KM e della Kcat, con un’efficienza

catalitica notevolmente maggiore rispetto a quella ottenuta senza nanoparticelle e

anche rispetto a quella ottenuta con la silice (0.050 mM−1 s−1).

Tabella 4.7: Costanti catalitiche della mioglobina per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2 ([Mb] = 1 µM, [H2O2] = 76 mM, tampone fosfato10 mM e pH 7).

α−ZrP Mb/α-ZrP kcat KM kcat/KM

(mg/mL) (mg/g) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

- - 1.7 ± 0.1 81 ± 6 0.021 ± 0.002

0.1 178 0.52 ± 0.02 0.17 ± 0.02 3.0 ± 0.4

L’interazione con questo tipo di nanoparticelle fa si che, incubando la Mb con

perossido di idrogeno, essa si inattiva immediatamente (Figura 4.21), indicando

un elevata instabilita del sistema.

65


Figura 4.21: Inattivazione della mioglobina in presenza di H2O2 38 mM (a) e 76mM (b).

Dall’analisi dello spettro di assorbimento UV-Vis della Mb in presenza di na-

noparticelle di α-ZrP sono state ottenute informazioni interessanti sullo stato di

coordinazione e di spin del ferro dell’eme (Figura 4.22).

Figura 4.22: Spettro UV-Vis della mioglobina nativa e in presenza di α-ZrP.

66


La presenza delle nanoparticelle determina lo shift e la diminuzione del segnale a

409 nm, la comparsa di una spalla intorno a 380 nm. Nella zona della Q-bands

compare un segnale poco intenso a 535 nm, mentre il segnale a 634 nm sembra

scomparire.

Questi dati indicano che l’α-ZrP determina un cambiamento della coordinazione

del ferro,con perdita della molecola di H2O e passaggio da una forma esacoordina-

ta ad una pentacoordinata. Dati di letteratura parlano di una maggiore capacita

di trasferimento elettronico per tale specie rispetto alla forma nativa [30].

4.3.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di α-ZrP

Le nanoparticelle di fosfato di zirconio influiscono notevolmente sull’attivita ca-

talitica del CytC. La reazione di ossidazione del guaiacolo fatta in presenza di

α-ZrP ha una velocita superiore a quella ottenuta in assenza di nanoparticelle (Fi-

gura 4.23). Inoltre, la velocita aumenta all’aumentare della concentrazione delle

nanoparticelle.

Figura 4.23: Attivita catalitica del citocromo C nella reazione di ossidazione delguaiacolo, mediata da H2O2, in funzione della concentrazione di α-ZrP.

67


Questo risultato indica che l’enzima stabilisce un’interazione con le nanoparticelle

che favorisce l’ossidazione del guaiacolo. La reazione risulta essere 7-8 volte piu

veloce rispetto all’ossidazione in assenza di α-ZrP.

Per quanto riguarda le costanti catalitiche kcat e KM , la presenza di tali nanoparti-

celle determina un effetto positivo sulla proteina e permette di ricavare i parametri

cinetici. Tuttavia non si puo fare un confronto con la reazione catalizzata dall’en-

zima nativo.

In presenza di α-ZrP si ottengono una kcat e una KM piu alte rispetto a quelle

ottenute in presenza di silice Ludox TM-40 mentre il rapporto kcat/KM passa da

32 mM−1 s−1 in presenza di silice a 18 in presenza di α-ZrP (Tabella 4.8).

Tabella 4.8: Costanti catalitiche del citocromo C per la reazione di ossidazionedel guaiacolo, mediata da H2O2; ([CytC] = 1 µM, [H2O2] = 76 mM, tamponefosfato 10 mM e pH 7).

α−ZrP CytC/α-ZrP kcat KM kcat/KM

(mg/mL) (mg/g) (s−1) (mM) (mM−1 s−1)

0.05 247 1.3 ± 0.1 0.071 ± 0.009 18 ± 2

Lo spettro UV-Vis del CytC ottenuto in presenza di concentrazioni crescenti

di α-ZrP e simile a quello ottenuto per la proteina nativa (Figura 4.24).

La banda di Soret (409 nm) non subisce modifiche cosı come il segnale presente

nella regione delle Q-bands. Lo spettro del CytC nativo presenta un debole segnale

attorno a 695 nm dovuto al legame del ferro con la Met 80: in presenza delle

nanoparticelle tale segnale sembra spostarsi a lunghezze d’onda minori (630 nm),

ad indicare la rottura del legame suddetto e la sostituzione della Met 80 con una

molecola di acqua (legame piu debole).

Dati di letteratura riportano lo spostamento di questo segnale dello spettro del

CytC in presenza di fosfato di zirconio [17].

La rottura del legame nella sesta posizione di coordinazione del ferro potrebbe

essere una spiegazione alla migliore attivita catalitica del CytC in presenza di

68


nanoparticelle di fosfato di zirconio.

Figura 4.24: Spettro UV-Vis del citocromo C nativo e in presenza di α-ZrP.

Come nel caso della Mb, e stata eseguita la reazione di ossidazione del guaiacolo

catalizzata dal CytC in presenza di concentrazioni crescenti di α-ZrP e di una

quantita fissa di NaCl (0.2 M).

Dal grafico riportato in Figura 4.25 si puo vedere che, a parita di concentrazione

di α-ZrP, la presenza del sale fa diminuire la velocita di reazione e questo risultato

indica un indebolimento dell’interazione enzima-superficie.

Rimane tuttavia un certo grado di attivazione della proteina in presenza di NaCl.

69


Figura 4.25: Attivita catalitica del citocromo C in funzione della concentrazionedell’α-ZrP, in assenza (nero) e in presenza (rosso) di NaCl 0.2 M.

Gli studi riguardo la stabilita del CytC all’inattivazione da H2O2 hanno evi-

denziato che la presenza del fosfato di zirconio fa scendere drasticamente l’attivita

catalitica residua della proteina dopo che essa e stata incubata con una concen-

trazione fissa di perossido di idrogeno (Figura 4.26).

Figura 4.26: Inattivazione del citocromo C in presenza di H2O2 38 mM (a) e 76mM (b).

Sia usando H2O2 38 mM che 76 mM, dopo un minuto di incubazione il CytC ha

70


perso quasi il 100 % della capacita catalitica. Questo tipo di nanoparticelle rendo-

no il CytC, gia di per se sensibile alla presenza del perossido, molto piu instabile

alla inattivazione.

71

Capitolo 5

Conclusioni

In questo lavoro di tesi si e voluto studiare l’interazione di enzimi con nanoparti-

celle di tipo inorganico cariche negativamente in superficie.

In particolare e stata focalizzata l’attenzione sull’effetto che tale interazione com-

porta sull’attivita catalitica degli enzimi, una delle caratteristiche piu importanti

di questi sistemi biologici.

Come sistemi enzimatici sono state scelte due emeproteine, la Mb e il CytC, aventi

caratteristiche strutturali e superficiali differenti a pH fisiologico e, in particolare,

ne e stata esaminata l’attivita di tipo perossidasico.

Come materiali sono stati scelti sistemi costituiti da nanoparticelle di silice e di

fosfato di zirconio. Entrambi possiedono dimensioni comprese tra 20 e 40 nm e

superfici cariche negativamente a pH fisiologico.

Nel caso della silice, la presenza di nanoparticelle comporta un aumento dell’atti-

vita catalitica sia della Mb che del CytC rispetto ai sistemi nativi.

L’analisi dei parametri cinetici della Mb evidenzia, rispetto ai valori ottenuti per la

proteina nativa, una diminuzione della kcat e della KM , con conseguente aumento

dell’efficienza catalitica.

Tale risultato e molto interessante dal punto di vista applicativo poiche e un indice

di elevata efficienza del biocatalizzatore a concentrazioni di substrato molto basse,

quindi vicine alle normali condizioni fisiologiche.

Per quanto riguarda il CytC, in presenza di silice presenta un’attivita catalitica

72

5. Conclusioni

molto piu elevata rispetto alla Mb. Il risultato e particolarmente interessante so-

prattutto in virtu del fatto che il CytC non possiede una attivita perossidasica

tale da consentire l’analisi cinetica tramite il modello di Michaelis-Menten.

I dati ottenuti evidenziano che in presenza di nanoparticelle di silice si stabilisce

un’interazione di tipo elettrostatico tra i gruppi O− presenti sulle nanoparticelle

e la proteina. Cio e confermato dal fatto che l’indebolimento della carica negativa

superficiale del materiale, per aggiunta di un elettrolita forte, comporta l’annulla-

mento dell’effetto riscontrato sull’attivita perossidasica della Mb e del CytC.

Attraverso analisi di tipo spettroscopico e stato possibile verificare che la presenza

della silice non determina cambiamenti strutturali del sito attivo ne un cambiamen-

to dello stato di ossidazione e di spin del ferro dell’eme per entrambe le proteine.

Lo studio degli equilibri di complessazione della Mb con legandi ha permesso di

stabilire che la regione del sito attivo e coinvolta nell’interazione che si stabilisce

con la superficie della silice in quanto la presenza delle nanoparticelle modifica

l’affinita di legame per i legandi che si legano al ferro dell’eme del sito attivo.

Inoltre, un aumento dell’attivita catalitica delle emeproteine per adsorbimento su

nanoparticelle di silice e accompagnato anche a una maggiore sensibilita delle stes-

se alla inattivazione da parte del perossido di idrogeno.

Successivamente si e cercato di chiarire l’effetto che nanoparticelle di fosfato di

zirconio hanno su entrambe le proteine per capire se i dati ottenuti con la silice

fossero peculiari di quel sistema o di carattere generale e riscontrabili con qualsiasi

nanomateriale avente carica superficiale negativa.

L’interazione della Mb e del CytC con α-ZrP in forma nanostrutturata ha marcate

ripercussioni sull’attivita catalitica che aumenta notevolmente, in maniera supe-

riore a quella riscontrata con la silice.

L’efficienza catalitica della Mb aumenta di un fattore 100 rispetto a quella riscon-

trata col sistema nativo. Anche in questo caso la presenza delle nanoparticelle

comporta una minore resistenza di entrambe le emeproteine alla inattivazione da

H2O2.

73

5. Conclusioni

L’interazione della Mb con il fosfato di zirconio determina una situazione partico-

lare sullo stato di ossidazione del ferro dell’eme: lo spettro nella regione UV-Vis ha

evidenziato la perdita di una molecola di acqua nella sesta posizione di coordinazio-

ne e il conseguente passaggio da una forma esacoordinata a una pentacoordinata,

probabilmente responsabile della maggiore attivita catalitica dell’enzima.

Nel caso del CytC l’interazione determina la rottura del legame Fe-Met 80 nella

sesta posizione di coordinazione: questo cambiamento nello stato di coordinazione

del ferro, evidenziato dallo spettro UV-Vis, puo essere responsabile della maggiore

attivita catalitica del CytC in presenza di fosfato di zirconio.

In conclusione, questo lavoro ha messo in evidenza interessanti risultati riguardan-

ti la modulazione dell’attivita catalitica di emeproteine come la Mb e il CytC.

Gli aumenti dell’efficienza catalitica della Mb e del CytC sono molto interessanti

dal punto di vista applicativo in quanto tali sistemi non sono stati progettati per

lavorare come delle vere e proprie perossidasi ma sono spesso usati come modelli

di queste ultime a causa di un minore costo e di una maggiore stabilita.

74

Capitolo 6

Parte sperimentale

6.1 Materiali utilizzati

La Mb e il CytC (entrambi da cuore di cavallo), la soluzione colloidale Ludox

TM-40 e tutti gli altri materiali utilizzati sono stati forniti dalla Sigma-Aldrich.

Le analisi spettrofotometriche sono state eseguite mediante uno spettrofotometro

Agilent 8453.

La centrifuga utilizzata e una Beckman Coulter AllegraTM 64R Centrifuge.

6.1.1 Funzionalizzazione della silice Ludox TM-40

Alla sospensione di Ludox TM-40 a pH 9 viene addizionato HCl 0.1 M fino a por-

tare il pH a 5.6 circa.

Si prelevano 0.5 mL di Ludox TM-40 (sospensione al 40 % in peso di nanoparti-

celle, d = 1.3 g/mL) corrispondenti a 43 mmoli e si diluiscono con 5 mL di EtOH.

A questi si aggiungono successivamente 3.5 mL di APTES (d = 0.946 g/mL),

corrispondenti a 15 mmoli, e si lascia reagire per 48 ore a temperatura ambiente.

A reazione avvenuta, il prodotto viene lavato con EtOH e centrifugato per 10 mi-

nuti a 12000 rpm. Questa procedura si ripete tre volte. Al termine si disperde in

H2O e si controlla il pH.

La concentrazione della sospensione viene misurata centrifugando alcuni mL, re-

cuperando e pesando il solido seccato.

75

6.2 Studi cinetici

La verifica della avvenuta funzionalizzazione e stata effettuata tramite spettrosco-

pia IR.

6.1.2 Sintesi di nanoparticelle di α-ZrP

Una quantita di propionato di zirconile corrispondente a 3.3 mmol di zirconile

viene disciolta in 10 mL di propanolo; a tale soluzione si aggiungono, a tempera-

tura ambiente e sotto agitazione, 1.35 mL di acido ortofosforico concentrato: il

rapporto molare H3PO4/Zr in soluzione e pari a 6.

Si osserva inizialmente la formazione di un precipitato gelatinoso che si trasforma

in un gel semitrasparente dopo pochi minuti. Il gel cosı ottenuto viene lavato una

volta con propanolo e quattro volte con acqua, in modo tale da eliminare com-

pletamente il propanolo, l’eccesso di acido fosforico e l’acido propionico prodotti

dalla reazione.

Il prodotto ottenuto e una sospensione al 2.2 % in peso di nanoparticelle di α-ZrP

in H2O.

Le sospensioni utilizzate in questo lavoro sono ottenute seguendo questa procedura:

• si pesano alcuni grammi di gel e si disperdono in pochi mL di H2O;

• si sonica la soluzione per circa 10 minuti e si misura il pH (∼ 2.7);

• si porta il pH a 7 aggiungendo, goccia a goccia, una soluzione 0.1 M di NaOH

e mantenendo il sistema sotto leggera agitazione;

• si sonica nuovamente per 10 minuti e si ricontrolla il pH.

Sulla base del volume finale si calcola la concentrazione di α-ZrP nella sospensione.

6.2 Studi cinetici

6.2.1 Studio dell’attivita catalitica di emeproteine in presenza dinanoparticelle

L’attivita catalitica del Mb (e del CytC) e stata studiata nella reazione di ossi-

dazione del 2-metossifenolo (guaiacolo), in presenza di perossido di idrogeno. La

76

6.2 Studi cinetici

reazione porta alla formazione di un tetramero colorato.

Tutti gli esperimenti sono fatti in tampone fosfato 10 mM a pH 7, alla tempera-

tura di 20 ◦C e utilizzando una cuvetta in quarzo con cammino ottico di 1 cm,

termostatata e dotata di agitatore magnetico.

La reazione viene seguita per via spettrofotometrica, misurando la variazione di

assorbanza nel tempo a 470 nm, lunghezza d’onda a cui assorbe il prodotto di

reazione.

In cuvetta si aggiungono, nell’ordine, il tampone fosfato, il substrato e la proteina

fino ad un volume totale di 3 mL; dopo aver effettuato il bianco, la reazione viene

fatta partire aggiungendo in cuvetta il perossido.

Si ripete la reazione in presenza di concentrazioni crescenti di nanoparticelle, met-

tendo in cuvetta nell’ordine: nanoparticelle, enzima, tampone e substrato. Cio

al fine di evitare eventuale formazione di aggregati, fenomeno possibile quando si

arriva a concentrazioni di nanoparticelle elevate.

Il valore della velocita iniziale (dA/dt) viene estrapolato dal grafico che mostra la

variazione di assorbanza in funzione del tempo.

Le condizioni sperimentali utilizzate in presenza di SiO2 sono le seguenti:

• [Mb] = 1 µM;

• [Guaiacolo] = 20 mM;

• [H2O2] = 76 mM.

mentre in presenza di α-ZrP si ha:

• [Mb] = 1 µM;


• [H2O2] = 76 mM.

Per il CytC, in presenza di silice, le condizioni sperimentali utilizzate sono:

• [CytC] = 1 µM;

77

6.2 Studi cinetici

• [Guaiacolo] = 0.04 mM;

• [H2O2] = 76 mM.

mentre in presenza di α-ZrP sono:

• [CytC] = 1 µM;


• [H2O2] = 76 mM.

6.2.2 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM per laproteina nativa

I parametri cinetici della Mb per la reazione di ossidazione del guaiacolo, media-

ta da perossido di idrogeno, si ottengono tramite interpolazione matematica del

grafico che riporta la velocita di reazione in funzione della concentrazione del sub-

strato.

Per ogni esperienza si eseguono misure preliminari per determinare la concen-

trazione ottimale di H2O2 e studiando la variazione della velocita di reazione in

funzione della concentrazione del substrato.

La stessa procedura viene seguita nel caso del CytC.

6.2.3 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM della pro-teina adsorbita su nanoparticelle

La procedura da seguire, per entrambe le proteine, e quella descritta nel paragrafo

precedente.

La miscela di reazione viene preparata aggiungendo un volume noto a titolo noto

di soluzione di nanoparticelle, l’enzima, il tampone e il substrato per un volume

finale di 3 mL; la reazione viene fatta partire tramite iniezione in cuvetta di H2O2.

78

6.3 Inattivazione della proteina in presenza di perossido di idrogeno

6.3 Inattivazione della proteina in presenza di peros-sido di idrogeno

Si prepara una soluzione 1 M di guaiacolo in EtOH, cosi da utilizzarne pochi µL

ed ottenere una concentrazione di substrato in cuvetta pari a 20 mM.

Si lascia in incubazione la Mb (1 µM) in un volume fisso di tampone fosfato (10

mM e pH 7) e in presenza di un volume fisso di H2O2 (in modo da ottenere un

volume totale di 3mL). Trascorso il tempo prestabilito e dopo aver effettuato il

bianco, si fa partire la reazione di ossidazione del guaiacolo tramite iniezione dello

stesso in cuvetta e si segue il decorso della reazione allo spettrofotometro UV-Vis

alla lunghezza d’onda di 470 nm.

Si ripete la misura per diversi tempi di incubazione (da 0 a 5 minuti).

Facendo il rapporto tra la velocita iniziale ottenuta a diversi tempi di incubazione

con quella ricavata a tempo di incubazione pari a zero, si ricava l’attivita catalitica

residua della Mb.

Tale procedura e stata ripetuta per la Mb nativa, per la proteina in presenza di

due concentrazioni diverse di silice (1 e 10 mg/mL) e in presenza di α-ZrP (0.1

mg/mL), utilizzando due concentrazioni di H2O2 (38 mM e 76 mM).

Nel caso del CytC, si prepara una soluzione di guaiacolo 2 mM cosi da ottenere,

usandone pochi µL, una concentrazione di substrato in cuvetta pari a 0.04 mM.

Si segue la stessa procedura descritta per la Mb ma si utilizzano le seguenti con-

centrazioni di nanoparticelle: 0.15 e 1.5 mg/mL per la silice e 0.05 mg/mL per il

fosfato di zirconio.

Per gli esperimenti fatti in presenza di α-ZrP la concentrazione di guaiacolo da

utilizzare e 1 mM.

6.4 Spettroscopia UV-Vis

6.4.1 Spettri UV-Vis delle proteine nella forma nativa

Si introduce nella cuvetta il tampone fosfato (10 mM e pH 7) e si effettua il bianco;

con una siringa si aggiunge la Mb cosı da ottenere, in volume finale di 3 mL, una

79

6.5 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemimioglobina-ligando

concentrazione di proteina 3 µM.

Allo stesso modo e utilizzando la stessa concentrazione di proteina si registra lo

spettro del CytC.

6.4.2 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di silice

Lo stesso procedimento si ripete in presenza di due concentrazione diverse di Ludox

TM-40 (3 e 30 mg/mL); il bianco viene effettuato mettendo in cuvetta il tampone

e la soluzione di nanoparticelle.

Nel caso del CytC la concentrazione di silice utilizzata e 6.5 mg/mL.

Per questa proteina, viene registrato un ulteriore spettro UV-Vis utilizzando una

concentrazione 37 µM di proteina e 9.5 mg/mL di silice, in modo da poter vedere

meglio i segnali nella zona delle Q-Bands.

6.4.3 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di fosfato di zir-conio

Si prepara una soluzione acquosa 4 mg/mL di α-ZrP e per diluizione da questa

una soluzione 0.3 mg/mL.

Per quanto riguarda la registrazione dello spettro in presenza di fosfato di zirconio,

la procedura da seguire e la stessa: si registra lo spettro della Mb nativa utilizzando

una concentrazione di proteina circa 14 µM per visualizzare meglio la regione delle

Q-bands. Poi si ripete la misura aggiungendo in cuvetta concentrazioni crescenti

delle soluzioni a titolo noto di α-ZrP.

Per il CytC si opera nello stesso modo, utilizzando una concentrazione di proteina

circa 14 µM.

6.5 Determinazione delle costanti di equilibrio per isistemi mioglobina-ligando

Si preparano soluzioni a titolo noto di Mb e di ligando (imidazolo e azide) in

tampone fosfato (10 mM e pH 7). Le soluzioni dei ligandi devono essere molto

concentrate in modo da inserire in cuvetta pochi µL e non variare significativa-

80

6.5 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemimioglobina-ligando

mente il volume totale.

Prima di registrare lo spettro UV-Vis della Mb nativa si effettua il bianco con il

tampone fosfato; si aggiunge quindi la soluzione di Mb e si esegue la misura.

Quando si registra lo spettro in presenza del legando, si effettua il bianco metten-

do in cuvetta il tampone e la soluzione di legando e poi si aggiunge la soluzione

di Mb e si registra lo spettro. Si ripete la misura a concentrazioni crescenti di

substrato.

Il parametro ∆A si ottiene effettuando ad ogni lunghezza d’onda la differenza

tra A(Mb−ligando)-A(Mb). Per il fitting con l’equazione 2.20 si sceglie la lunghezza

d’onda di 422 nm dove il parametro ∆A possiede i valori piu elevati.

L’esperimento fatto per seguire la complessazione della Mb nativa viene ripetuto

in presenza di due concentrazioni diverse di Ludox- TM-40 (1 mg/mL e 10 mg/mL

la dove si sia utilizzata una concentrazione di Mb 1 µM; 3 mg/mL e 30 mg/mL se

la concentrazione di proteina usata e 3 µM).

Il bianco si effettua mettendo in cuvetta il tampone, le nanoparticelle e il substrato.

81

Bibliografia

[1] Z. Wu, B. Zhang, B. Yan, Int. J. Mol. Sci. (2009), 10, 4198-4209.

[2] A. A. Vertegel, R. W. Siegel, J. S. Dordidk, Langmuir (2004), 20, 6800-6807.

[3] W. Shang, H. H. Nuffer, J. S. Dordidk, R. W. Siegel, Nano Lett. (2007), 7,

1991-1995.

[4] M. Lundqvist, I. Sethson, B. H. Jonsson, Langmuir (2004), 20, 10639-10647.

[5] C. You, S. S. Agasti, M. De, M. J. Knapp, V. M. Rotello, J. Am. Chem. Soc.

(2006), 128, 14612-14618.

[6] N. O. Fischer, A. Verma, C. M. Goodman, J. M. Simard, V. M. Rotello, J.

Am. Chem. Soc. (2003), 125, 13387-13391.

[7] R. Hong, N. O. Fischer, A. Verma, C. M. Goodman, T. Emrick, V. M. Rotello,

J. Am. Chem. Soc. (2004), 126, 739-743.

[8] H. Bayraktar, P. S. Ghosh, V. M. Rotello, M. J. Knapp, Chem. Comm. (2006),

1390-1392.

[9] W. Stober, A. Fink, E. Bohn, J. Colloid Interf. Sci. (1968), 26, 62-69.

[10] D. Knopp, D. Tang, R. Niessner, Analytica Chimica Acta (2009), 647, 14–30.

[11] R. Ke, W. Yang, X. Xia, Y. Xu, Q. Li, Anal. Biochem. (2010), 406, 8-13.

[12] G. Alberti, M. Casciola, U. Costantino, J. Colloid Interface Sci. (1985), 107,

256.

82

BIBLIOGRAFIA

[13] G. Alberti, M. Casciola, U. Costantino, A. Peraio, T. Rega, J. Mater. Chem.

(1995), 5, 1809.

[14] F. Bellezza, A. Cipiciani, U. Costantino, F. Marmottini, M. A. Quotadamo,

Colloid Polym. Sci. (2006), 285, 19-25.

[15] Y. Feng, W. He, X. Zhang, X. Jia, H. Zhao, Materials Letters (2007), 61,

3258-3261.

[16] W. Tan, K. Wang, X. He, X. J. Zhao, T. Drake, L. Wang, R. P. Bagwe,

Medicinal Research Rewies (2004), 24, 5, 621-638.

[17] C. V. Kumar, G. L. McLendon, Chem. Mater. (1997), 9, 3, 863-870.

[18] C. V. Kumar, A. Chaudhari, J. Am. Chem. Soc. (2000), 122, 830-837.

[19] F. Bellezza, A. Cipiciani, U. Costantino, M. E. Negozio, Langmuir (2002),

18, 8737-8742.

[20] J. C. Kendrew, R. E. Dickerson, B. E. Strandbery, R. G. Hart, D. R. Daves,

D. C. Phillips, V. C. Shore, Nature (1960), 185, 422-427.

[21] R. Vazquez-Duhalt, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (1999), 7,

241-249.

[22] A. Kondo, S. Oku, K. Higashitani, J. Colloid Interf. Scie. (1991), 143, 1,

214-221.

[23] J. Deere, E. Magner, J. G. Wall, B. K. Hodnett, Chem. Comm. (2001), 465-

466.

[24] W. Shang, J. H. Nuffer, V. A. Muniz-Papandrea, W. Colon, R. W. Siegel, J.

S. Dordick, Small (2009), 5, 4, 470-476.

[25] Z. Xu, S. Wang, H. Gao, Journal of Hazardous Materials (2010), 180, 375-383.

83

BIBLIOGRAFIA

[26] F. Bellezza, A. Cipiciani, U. Costantino, S. Nicolis, Langmuir (2004), 20,

5019-5025.

[27] E. Monzani, G. Alzuet, L. Casella, C. Redaelli, C. Bassani, A. Sanangelantoni,

M. Gullotti, L. De Gioia, L. Santagostini, F. Chillemi, Biochemistry (2000),

39, 31, 9571–9582.

[28] R. Maurus, R. Bogumil, N. T. Nguyen, A. G. Mauk, G. Brayer, Biochem. J.

(1998), 332, 67-74.

[29] L. Chu, M. W. Daniels, L. F. Francis, Chem. Mater. (1997), 9, 2577-2582.

[30] S. Wiwatchaiwong, N. Nakamura, H. Ohno, Biotech. Progress (2006), 22,

1276-1281.

84

Grazie

Al termine di questo percorso desidero ringraziare il Prof. Antonio Cipiciani per

avermi accolto nel proprio gruppo di ricerca, per avermi permesso di portare avan-

ti questo lavoro di tesi e avermi incoraggiato costantemente durante questi nove

mesi.

Ringrazio la Dott.ssa Francesca Bellezza, per la disponibilita, l’aiuto, i suggeri-

menti e per essere stata la mia guida in questi mesi trascorsi in laboratorio.

Il ringraziamento piu grande va ai miei genitori e a mia sorella per tutto quello che

hanno fatto per me, per aver capito ogni mio momento e per avermi dato sempre

e incondizionatamente il loro sostegno.

Un pensiero speciale va a Marcello e Marella: anche se ancora troppo piccoli per

capirlo, sono stati la mia forza, la gioia e il regalo piu grande che potessi ricevere.

Grazie a Davide, per essermi stato vicino e aver compreso le mie esigenze, specie in

questo ultimo periodo. Senza il suo aiuto e i suoi consigli queste pagine sarebbero

sicuramente diverse.

Un pensiero, infine, va a tutte le persone che, in momenti diversi, hanno condiviso

con me questa esperienza e che sono diventate parte della mia vita.

Maggio 2011

Orsola

85

Tesi Laurea Specialistica Chimica

Technology

Transcript of Tesi Laurea Specialistica Chimica