•TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP A DUE ELETTRODI

•TECNICA DEL PATCH-CLAMP

•REGISTRAZIONI CON MATRICI DI ELETTRODI

•STRUTTURA E FUNZIONE DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh

•STRUTTURA E FUNZIONE DEI CANALI IONICI VOLTAGGIO DIPENDENTI

TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP

Permettono di:

• misurare i flussi di ioni attraverso la membrana come corrente elettrica, mentre la differenza di potenziale ai sui capi è mantenuta costante per mezzo di un amplificatore a retroazione (FBA)

• separare la componente di corrente ionica da quella capacitiva

• ottenere informazioni sul funzionamento dei canali ionici (permeabilità e gating)

In esperimenti di voltage-clamp il voltaggio ai capi della membrana è forzato a variare il più rapidamente possibile da un valore stazionario ad un altro valore sempre stazionario: si applica alla membrana un gradino di potenziale.

Quando V varia si osserva un rapido flusso di corrente capacitiva di natura transiente, ma quando V è stazionario la corrente è puramente ionica perchè Ic= C dV/dt = 0

Per ogni particolare preparato cellulare la condizione di voltage-clamp si verifica quando vengono garantite le seguenti condizioni:

•un accurato controllo del voltaggio

•un’adeguata velocità

•l’isopotenzialità dell’area di membrana da cui si registra la corrente (space clamp)

Misura Vm, (alta resistenza d’ingresso)

con guadagno A, confronta Vm con il potenziale di comando E; se la differenza fra Vm ed E è diversa da zero invia corrente I attraverso la resistenza d’accesso Ra (elettrodo e citoplasma)

Si può dimostrare che quindi maggiore è A, guadagno dell’ampificatore, più Vm approssima E e l’effetto della resistenza d’ingresso diventa trascurabile

METODI DI SEPARAZIONE DELLE CORRENTI

•Sostituzione ionica

•Separazione farmacologica

•Protocolli di impulsi di voltaggio

SOSTITUZIONE IONICA

SEPARAZIONE FARMACOLOGICA

PROTOCOLLI DI IMPULSI DI VOLTAGGIO

TECNICA DEL PATCH-CLAMP

Permette la registrazione con alta risoluzione (fino a livello di singolo canale) di:

correnti in pezzi di membrana della cellula (cell-attached)

correnti in pezzi di membrana isolati dalla cellula (excised membrane patches: inside-out, outside-out)

correnti e potenziali in cellule di piccole dimensioni (whole-cell current-clamp e voltage-clamp)

Convertitore corrente-voltaggio

La corrente in ingresso è = alla corrente di feedback

Intra

cellu

lar m

esse

nger

intracellular messengersantibodiespeptides

extracellular messengers

antibodies

peptides