Sulle caratteristiche rnorfologiche di cellule di topo di...

Sulle caratteristiche rnorfologiche di cellule di topo di coltura primaria e di linea, normali o portatrici

di virus e capaci di dare tumore

•\ 1\'IFo \ 101.1\ ,\T I·, (*). <\DIII\ '- ·\ POI.I·:TT I ( .. ) t' MltH. I.I.~ I\IAH CIII·,(: I \\1 ( 0 *)

/ ,oi!Omtori di Fistro

Riassunto . - Ì·: s tata PM'guita una rH't'ITa ;.ulla morfolol!ia di \an tipi di ct·llult· co l t i ' att · in àtro capac i di dl'lt·rminan• l'irHmrp:enza di rwupl a>-io·

yuando 'l'Ili\ ano iuoc ulat t' in topi m ·onal i.

L a r ict· rea (o s tata impos t ata allo sco po d a potPr t·vidf•nzian· cara tll'ri

~ • ici w morfnlogiclw dw pote;;seru l'S>'t ' rt ' cousidl'ratt• }li'Clllia ri della mnli

p:nità dt•ll t· c t•llulo•.

Lo s i udio éll'l' llralo ha pern11·;.,.., di ri lo •\ an· la prt'>Wllza di parlic!'ll t·

Y.iru l'-s irnili rrt·l eilnplas ru a d ciii' <' t'llult· d i t• ultu ra <'apa<'i di dnre lurnon·

" ndh· ct·llul r• d f'i turuori dl'fi , ·ati . IIH'Utn· tal• · rq ll'r lo ma ncava rwll •· C(' ll ul• ·

di con tro llo.

Summar-y ( fl.lorpho log ' ~~r nornwf. l ' trtt.' inji•t·tNI ami tumor indu cinJ.!.

nwu St' aff., cuftun•d in 'it ro). - Tlll' morpltolof-(~ of 'arioug l~'Pl' l> of c ul turf'CI ct• ll;:, capa biP nf induc in g nenpla sm !-. "IH·rr irr jt·ctPd in nt•\\·Ùorn mi et· . wa~ irl\t'R t igatt·d .

Tlt(' aim of tl1i!' s tudy wa~ lo Sl' t' wlwt lll' r p•·c·ul iar ruorplwlogic·al c La

rac i•Tis ti c,; could lw ,. , ·irtl'ntiatt·d in rnalig nant r t·lls.

\\ c coulrl shuw tltat cultured , tu rnor inducing c!' ll:;. a!' wcll

turnor c(' lls, contai n ..-irus-lik(' particlt·~ 111 tht ·ir c~· tnplasm.

n ot pn•st·nt in cnntrol Ct' ll ;;.

a s Ùt'ri ' t•tl

Thef:c an·

TIH' aspt•c t of thc!<e partic le,: vari cs nc·eonlin g lo th(' typc of erli. In fac t in tumur Cl'lls tlw~· an· surro1mdNl hy a mt•rnhrarrt ·, which howcver

JS noi pn•st•nt in tlw eu lturetl celi~ inducing the tumur.

T h(· data prf'"t ·n t('d are b r idi r ùiscn sscd .

(0

) Ospite d ci Lahora lori di Fisica . (* •) llorsisLa dei Lallllratori d i Mierobioloj:i :t.

A1111. 1~1 . SIIJJCr. Sa11il<ì (1968) 4, 25J·2GO .

T

2~5

Lo studio delle ultrastrutturl' delle cellule neoplastiche è s tato ampia

mente condotto al microscopio e lettronico e la le tteratura è ricca in tal scn o

unchc se in definitiva non si hanno <.lati che prrmettono di distinguerle tlalle 1·orrispondenti Ct' llule normali . Tuttavia a carico del nucleo sono siate de~eritti' a lcune altrrazioni chr sono tuttora f'Onsiderate co me proprie dello

!> tato ncoplastieo (HAGUENAU, 1960; LEPLUS et al., 1961; AnNOULT & HA

c.;UENAU, 1966; EPSTE IN & ACIIONG, 1965; EPSTE!N et al., 1966; \cuoNG

& EPSTEI , 1966).

A carico della membrana nucleare il microscopio e lettronico ha P"rmesso ad HAG U'ENAU & BEHNIIARO (1955) di l'videnziare a lcune irregolarità carat

tt·rizzate 1la avvolgimenti deJia membrana organizzati in modo da formare dci canalicoli ; per il ri'Sto essa St>mbrava in tutto simile u quella delle c·elllule uormali .

ul .macleolo c'è poco da dire, c•;~s!•ndo caduto ormai da tempo il

l'oncctto chi' il maggior numero e la grandt-zza dci nu clf•oli costituissero ,•Jem<'nti rnorfologici propri delle cellule neoplastiche.

Un am pio studio è stato condotto unche sul c itoplasma Cl'Uula rc. In

primo luogo l'attenzione dei morfologi si è fermata stti mitocondri, a carico !le i quali sono state descritte variazioni di forma, di numero e rli struttura

ehe tuttavia non possono considerarsi specifiche (W'ESSEL & BERNHARD, 1957; L u oFono, 1951).

:"l"cssuna precisa a lterazione è s tato possibile documentare a carico del

l' apparato di Golgi " del centrosoma nelle cellule neoplastiche.

el citoplas ma delle cellule neoplasticbe è possibile trovare le caratteris tiche formazioni lumellari chiamate da Swuvr ( 1956) cc lamelle anulate " ; anche pt>r f•sse pf·rò è valido il criterio della non s pecificità.

\1af{giore considerazione meritano le partice lle '' virus-s imili », non solo per il significato che possono assumere dal punto di vista Pziopatoge

nt•tiro. rna anche ai fini tlrl p rr scnte lavoro. [ corpiccioli indicati po tc·nzialmente co mt> '' v irus-s imili )) da Bernhard, P considerati senz' altro come v irus da molti , sono s tati trovati frequentemente nelle cellule neoplastiche .

n a t·ivista aggiornata a l 1965 è stata fatta da uno di noi (VIOLA TE & STEVE- BocCIARELL r, ' 1965) su questo argomento, ed anche se da quella 1lata rnoltr a ltre ricerche hanno arriccbito la bibliografia, sos tanzialmente uulla di nuovo, sia riai punto <li v ista morfologico che Jal puuto d i vis ta dottrinario. è stato possibile aggiungere a f(Uanto era già s tato fino a f[Uf' l

momrnto documentato . Il significato r<•ale di ques te par ticelle resta ancora incf'rto : anche "e f'Sse hanno le s tesse dimens ioni c la regolarità di forma di

alcuni tipi di virus, manca ancora, allo s tato attuule, una qualsiasi prova tlcll'!'sis tl"n:r.a di un rapporto t ra la loro presenza e la loro fun zione rziopato

gcnetira in sPnso neoplas tico. È stato anche stabilito che •rueste partice lle,

. J /171. lRI . .'>ll(ltr . Scw i tlt ( I !Jfi8 l 4 , 254 -~(10.

~'l ' l 1111·. '11 l 1111 ~. ltLIII

alnwnot in Lllt c·c·r tot lllllltc·rot di ' '"" ' · ric·lltrallo llt·ll .c !'at •·l!"na dc·i tnit·upl a

"'"' : una ""'"~ a a pu11to altloa:-tanza t' llllll'lc•ta di'i dubl11 t•;, i,.. tc·uti i11 'l"''~' " l'éllllJIII f111 tl IW\:II ,..i tll'l rl'('l'llll ' la\111'11 di 1\11,01 JT t'\ Jf \1; 1 Fl\\1 ( 1(}(1(1)

l )alt' l,· "'"'"l '"" '' ' pn' llll"•-'t' l'i ì· ~wmb ralot d t 1111 t't·rto in t l'l'l'li"''· ant•lt o· dal punto dt 'i1-ta dottriuanu. n.porn· i ri~-tdtati dt•llo 1-111dio nwrfolol!'i t·to

da noi fai tu su t'f ' llulc· nturinc• di coltura. t'<tpi!ei d i IIHiurn· tlf'OJilal'it· ~'- ' ' ili oe u la t t· in anituali i -.oln~thi "''" ' tl ti li.

\l \TI·. IU •\1.1 1-. METOJ) I

Lo :;tud io l ' ;. taio t'nllrluttu ;.ur !-f'!-(Uenti tipi rPllulari t'U itat' i d i lltrlurn·

rwupla~-<ic · :

Cc•llult · di lt•,.,,.u to "'"' tncu la rH·o di topo i11 roltura t·outillua ( LIJ~IJ) .

Cdlult · di li',.!HIIo ~totlncut tllll 'o di topo 111 coltura L'OIItinua portatriei di viru ... ND\ (LrHh ).

- Cellul,· di tt·, ;.uto ~<ul tocutallt 'o d i topo 111 c·nltura t'lltlliuua port<~·

triei di vini!' Pnlinm a (Lp).

Cc·llult> III'OJl ln~< tielw dt·l tuuwrc· ottt·nutu t'oli t.· et·llul•· LIJ:llJ ( L' l').

CPilnll' llt'opla!' l it'ltt• dt•l llllllltn· o ll•·n u t o c·u11 <·l'llul t• Luth (T l. 111h ) •

. t>llu l•· dt•l g ruppo prc•cf'dl·lllt• fili '""'' iu t'oltura (CTLuch ) .

Ccllul•· n••upln!' ticlw di'l tumore· ollt'IIUlo eou lt· rt'llu lt• Lp ('l'Lp).

c ... llult · III 'UJ>la~-oli c ht· dc·l tumon· Otl<'IIUIII ('1111 ,,. (.'t• llulc• ETp (TI·:Tp).

() ~!' 1'1'\UZiolli di ('IJIItl'llJlo t-111111 ;. talt• t't-l'f! llitc· ,.Ui ._l'l!lll'lll i tipt l' t•llula ri :

- Cl'llulc· c•mhri()nali di topo in coltura pri111aria al \I pa~~agl! iu (ET).

- Ccllult• t•tubriollali di tol'o di pri11111 i~olaml'nto in ronltttnt t'oll-

tinu a (ETC).

- f.t·llnlc· di miol i loro~at't'O IIIIt da dilll'n:r.alltra!'c·nt • di t·rief' lfl (\. BA ).

Fissa::iollt' t•d illdllsÌollt' .

I tappeti cf'llulari ~ono s tat i. dopo a llonta nauwnto Ùf•l liquido di enl

tura, immediatamPnlt• fi ;.kal i con glutarald('ide 2,5 °11 in liquido di Earlt· per] ora: quindi dopo Ju, ag~in con Ea rlc. s i è prorrduto a nuo' 11 fi!-;.UI!I!iu con OsO~ J 0

0 in Earlc• pt·r l ()rH. Dopo dis idratazion!' r n11 a lrooli . la iJH·Iu

sione è stata fatta in -\ralclitt·.

LI' sl'zioni oucuut<· a l minotomo Porte r Blu m i\1'1'2 'rni' ano rol~~ral <'

coi/ Ph, sl'condo il me todo di Hr ynolds o di KarnoH ky. rd Msrn ut r al microscopio cll'ttroni co . irmenFo Elmi!'lcop I.

· ' '"'· Jsl. Suwr. Smtil tt ( Jijf,Q) 4, 2r, l-2ti0 .

VIOLANTE, POLET'fl E liARCII EGIA N I 257

LHSULTATf

Come è sta to detto nella parte introduttiva, la presente ricerca aveva lo scopo di s tabilire se nelle cellule studiate apparissero aspetti morfologici che potessero caratterizzare quelle che avevano 1limos trato capacità oncogena.

P er ciò che riguarda la struttura generale tl elle cellule, dei loro organuli , del nucleo ecc. non si riscontrano aspelti particola ri. L'u.nica caratteristica che sembra tlistinguere le c<' llulr di coltura a ca pacità oncogena e q uelle tiri tumori da esse derivati , dalle cellule normali , è li mitata alla prrs1•nza nd citoplasma di particelle v irus-simili. T a li particelle sono sostanzialm ente assai simili in tutte le cellule oss<'rvatc. Grosso modo s i può afft·rmare che <'SSe sono distinguibili , in h use ad a lcune d ivers ità di grandezza e di strut· tura, in due tipi : il primo, ddla grandrzza di 850 A circa, cos tituito da un nucl eoid P a vo lte elettrond enso, a volte trasparente limitato da una mc·mbrana IH'n netta contornata da un ma teriale mr no denso (Fig. J). I l secondo tipo Ji 1200 1\. circa, s i dis tingue da l precedente solo per la presenza di una rnPm· brana avvolgente più esterna st· pa rata tlal1a struttura interua da uno spazio <:hiaro (Fig. 2, :-\) . N<' lla Fig. 4 si può osser vare una particella chP differisce da questo scb<'ma prr la mancanza della membrana e!"terna ; ('1'\Sa però è ,.;ituata io sede extracdlularl'. Tra i due tip i ora descritti se ne può inserire un terzo costituito da particelle di grandezza e con cura tt t> ristiche intcrme· tlie. Esse infatti hanno un diametro d i LOOO A circa cd una s truttura simile a quella tlel tipo l (Fig. 6). A quest a distinzione morfologica corrisponde anche una diversa localizzazione, essendo infatti le particelle pitt piccol{~,

qu elle cioè indicate come tipo I, presenti nelle celluJe coltiva te L929, Lndv, CTLndv, mentre le particelle indica te come tipo II sono presenti nei tumori TL, TLndv, TLp ; le particelle a grandezza intermedia sono state osservate ,.;olo nel tumore TETp.

Ci se mbra di poter affermare, io base alle nostre osservazioni , che le particr lle virus-simili assumono, fatta ttua lcbe eccezione ( Fig. 4), una Jj. versa rnorfologia solo in g razia di una membrana avvolgente che le particelle most rano quando dalla osservazione delle cellule coltiva te in vitro si passa a quelle in vivo. Infatti la membrana avvolgente co mpare neLle cPllule dei tumori derivati dalle cellule della linea L929 inoculate come ta li o por· tatrici di virus (Lndv, Lp) . In molti casi abbiamo potuto cogliere anche qut•lle cllf' poi rchbero essere le fasi di sviluppo d i un tale even to (Fig. 7 e 8).

Un' a ltra particolarità da ~cgna lare riguarda la localizzazione intra o I'Xlra cel lul are delle particPIIe in questione. ~t' Ile cellule L929 f' in queLle portatrici tli virus polioma (Lp}, le particelle :;ono state osservat1· fuori del citoplasma (Fig. l }; nei tumori derivati da quf'stc cellule le particelle vi rus:-im iJj si trovano in vece prevalrntPmente io sede citoplasmatica senza locali;r.zazio ne prt'ferf'nzia le (Fig. 5) ; nc· lle ePIIul e Lndv e nelle C!'llu le tumorali

lllll. Tst. 811per. '-;a111IU (I !J6d) 4 , ~.j 1 ·~60.

.. ... .... ICII 'Il l Hlt l HC ll f

eia ,.,..,.., . dtTI\ a t•· (TLuth ), lt · p01rt it•t•ll• · ha1111 o 1111a lo l'Oiilz ~ a /. JoiJt ' " '" 1111 r .1

( l· •g. ~ - :3) . ,..i a t•xt rac•Jtopla:·HIIat it ·a (Fil!. 4 ). \nd~t• llt ' ll t• t•t•llul t· CTL11th

'i (• la duppi01 lul'alizzaz iww. ,. l;~ lit·d· · 1111 ra l' ti l' Xl ra<•t•lltJian· 11 1111 implit ·a

all' lilla modifit•a z iollt' di gratldt ·zz il ., d i ruorlologi<~: flt •llt · •·•· lini• · TE'l't• ' " ltwali zza zlflllt ' i• t '~t ·hhl\ <llllt' lllt• l' llopla ,.. ,uatil'a (Fq! . (1)

J,<' II~M'f\U/. i11111 I'Utldutlt• llt ' l f'Oilii'Oiil t' t•io(• ll..iit • l't•linlt· t' lllilrlllllai J

th topo al ,.. , · ~ t o l"h~.t gl! '" (ET) ,. dupu h mt·, i eh <·oillllil 111 11/ro ( ETC) , flt •llt · I'Piiul• · eli lillt '.t I'I'O \ i' l1it •1111 d01 1111 llllliOrt· d a diiH'IIZOIIItrat•t•flt ' (CB\ )

fWI'IIII ' ltollo d1 , . ..,, ·hrclt ·n · la pr•·' t' II Za d1 parlit·t·ll· · ' iru ..,-~1111ila .

l l l ~t l !"S Ili \1· l· (.O\ t l l S Ili \ l

l>ut · :-111111 i prttl. lt•fiJI dw :-- 1 l"'""o11u pn·udt•n · 111 t ' III I'• ICit · r ;~;. JoJw a t'tllll' lu

,..iollt ' di qrr••,.l a uot a. 1>.1 1111 lato '1 ì· la <·apac itù d 1 tra .., fDrllla ziout• in '''"'"

llt'opla., ti<·o dw •·•·llul• · nnnuali t•olt i' alt • in I'Ìi ro cl iuw,.. l rauo d1 a\, .... . :--1 .1

:--polllani ' OIIIIt ' lllt ·. ,.. i;~ l"'' a z iolll ' 'iralt· : d;~ll'altro ' i ì· lo "ludio d..! rapport o

'iru l-'-('l' llula l' dt• ll;~ intportau~. OI t•lw l a l• · a H,.. tll'iaziollt ' puÌ• :l\ t' l'l' nt ·l dl·lt•nn i

nan• l't>' oluz ioJn• 't ' l'"o l:t Jllalig11it i1 dPII<I c•·llula tl l-' pit•

Pt-r quanto rig 11ard:t il pri1110 pu11t o t- opportuno ri t•ordan· i pri111·ipa l•

la, ori elw lt ·..,tillllllliarro dt•lla po;. ... il,ilit ;l eh• · ePIIul •· lllll'lllali . 1·olti\ a t•· in I'Ìiro 111'1' lu111!o tt' 111J III. OII'IJUi .., i:-t'<lllll c arattt-ri d i 111alig11JI :Ì (C~. , . IQ.JI :

h .-\HJ. E l"\ '-FTIJ,F.., rrrr•. I 1JJ:{ : ~ ''1· 01111 l'l al .. lli.')O : I.F\ '" ,"{ Hrt-: :-- FJ.~ .

19?iH : l3An:--td ,'{ c, ... ... I'I . F'-' · 1911:1 : T o rnn o & CnFr· ' · 1<)(,:{ : "EI:->Bhlll ..

196-1 : CoTLIEII -STEM' r:-- "1. '\ 1\ 1\ & CA:tn rr. l ' IIth ). \ t•J'al11" a '!'"'" ' " fa t l o. d w a p p<~ n · iut·orr t rtt \ •-rl ihi l t·. I';. Ì:< t ,. p•>i Ull<l 'a:-t i-.,.. 1111<1 l PII •·ra tura

ri <TOI 1li dal i 1lirrrn,.. t ranl i l'ii11JIOI'I au~a dt•lf'rtllin a nt• · di al t· uJi t 'iru , Il t• l pro

,.,.,, .. d i tnl' .. forlll at.ion • ( ' 0 1:1 & D1 r.rn:cco . 19h0 : !--1 .\ t. ll -.. & \1~. 111' \ . 19111 :

BL\C"- l< BmH .. l<lh:l: Su~." 1•/ al .. 1()(13). S ulla lt:l:--•· dt ·i da11 ra t'l'olti in

lt •lt t•ratura ;.i può1 qui11di all't•rnlan· dw lt · n ·llul t• d i !'ohura 1"':--.otHI tra•dnt

lna n .. i i11 nt •opla ,... l idw "l"'lltant•:tiJII ' IIIt ·. 111a ant · lt~ ·. , . l'or' ' ' <1111'111 piìa f:wil

lllt'lll t· . f'l ' l' <IZI<IIIt' \ ir.tft •.

C11n,.; id t·r·a r11 l11 il 1-t'l ' tlltdo proltlt' lll<l. 1'111111 ' i· ,.. l a to :tl't' t' ltllato llt· lla partt·

iutrodutti\a. parlit'l'll, · 'iru,...;. iutili ""'" ' :- latt· '""'''n alt' in 1111 ;.rr:111 lllllllt' rtt tli llt'llpla;. it •. l'urtutt a\ ia tali o,.,..,.naZHllli 111111 ltaJIIIII port a to a lt·uu t'tlltlrt

lllltll dn·i;.,i \ 11 al t'llll l't' llo t•ziopatng•' llt ' ticn \ iral•· rl 1· l C:tll l'ro . iu tflJ;lllto 111'~

,.. ull rapporto (• :-t alo po:--;.iJ,ilt• ;. taltilin · tra i ('orpu~t·nli :- ir11tl - \ irali 1'~'~' :-t·lltl

nt•llt • C<'llu lt· ,. la l'unziollt' t'<IIH ' I ' I'O~t ' lll'l it•a df'llt· n·llult· ,., ,,.,,... .. l't •rtanto il

prolllt•ma r rir11a:- to <lfH'rll• l' appan•JIII 'IIIt' lll l' 111111 ~olubilt • :-.111 piantt tf1·1la

Cl !<!o.l' f\ aziolll' 1110rf~•lo~it· a nou r orn·lata da o ppnrlunt· pro\ l' biolug i.-lw. Sottu

l alt• profilo appain11o pt·rtanto di 1111 t'<·rln riliP\ o i da t i da 1111i ,., id,·u ziati

nl'lla pn•:,t•ut• • rin·rc·a . T~t fatti altbiamo potuto at•t'Prlart• la pn•,..•·nza Ji t·or

pu ;.coli :-- ir11il - ' indi ;.olo Jlt•ll• · t't•llul• · dw ha11no dinrn,.. lra lu capacit ~• ll<' n pla -

VIOI..Al'ITE, POLETTl E \IARCHEGIANI

s tica se inoculate in topi nelle prime 24-48 ore di vita, mentre non è s tato pos ibile trovarle nl'llc ce llule sprovviste di capacità oncogcna c in ctU•'IIe eli un tumore da tlibenzantracene.

Considerando la morfologia <.li queste particelle, una certa somigliauza cnn i virus « adattati », NDV e polioma, s i può forse notare solo per il primo tipo (StL\'""E RTEIN & MAncus, 19M; 13Loucn, 1964) mentre l'aspetto rlcl secondo non è affatto riconducibile a quello df'lle particelle da noi oss!'rvate .

Purtuttavia un dato indnrrebbe a riten ere che esse nulla abbiano a ehc fare non solo con il polioma ma neppure con l' NDV: la loro prt>senza infatti - rome pure descritto da DALES & H oWATSON (L96l) e KtNDIC & KmsTEN (L 967) - è stata accertata anche nelle ePIIulo L929 non infettati' .

Date le prcmess!', s' impone qualche riflessione sul significato biomorfologicu di ques te trutture. Se si sos tiene la loro natura vi rale, è molto arduo definirn e la provenienza: infalti, nrl caso clelle cellu le L929 c dci tumori da (' ~se• dt' ri v ati, i Jovrchbe ammettere che le particelle fosSI'TO presenti nel

<'~"ppo originale ; per le cellule ETp invece i dovn·hiJc ammrttrre cbr, nonost a nte le Jifferenze morfologiche, si tratti di virus polioma . Se, d 'altro ru nto, si scarta l' ipotesi della natura v irale delle particelle descritte, allora uisognerebhe sostenere la tesi che esse rappresentino una 4ualchc struttura, per ora non definibile, peculiare delle cellule capaci di dare origine a oeoplasie.

23 aprile 1968.

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SIIEII'>. Il . M .. .J . F. E~tJEih . .) . IJ. I."VIi\Til~l & \ . 1·:. Br• u~o.J;I . llJ(I3 . Tr·au•lornratiuu iu

durrd h) ~imiuu vÌ ruF 10 iu 111'\\horu Syriau h:llw, t t•r rt'u:d l't•ll ndturt' '· /'rtJt', \ati.

Arllll. s,·i. l ' . S .. 49. 211.

S tJ.Vt·: HTEI1\ . S. C. & 1'11 . l . ~I AH\ . l~ . llJhl . )•,ari) '1"1!"' uf \t'\\l 'a•tl1· di•t·.t•l ' ' iru•· l lo·l a

rt•ll int('raetion o n c lrrtrun IIIÌrrMI'Ilpi•· H uri~ . l •ruli.IJ!Y· 23. :1111. SwiF"l . Il. Il .. ] 9:;r~, Tltr fìuc >lruclur<· nf an!lulat" lallrrlbw . ./ . Hiol'h.-.. /Jwdt~·ur. l.y tul ..

2. ll :i.

TouAn O. G. l. t\ Il. G n Et:N. 19(,;1. l)ualllila t i\(· ''"dir' of lht· ~ru1\llt uf 1111111 •1' t·utltn u

ccii, in r ullurr and tht•ir dr\clOJIIIH' IIl iuln e•titloli~lu•d liau·· . . } . (.,•// Hiu/ .. 17. ::!9'1.

VIOLANTI,. A. l\ J) , , TE\ t.-Bou:IAHhi.J.I. 19(o~ . C:oulrilouti apportati J a l IIIÌI'rtl't' tlf'Ì " l'i•·t·

trunit·o a llo otudiu clt•ll' rrito loJ,:i.t virai!' do·l t':lltc·ro. Hrrt•uti fJr"J!'· \/••ti. 38. l .

\ Ot.T , M. t'<. H. Dr J.UM:cu, 191!11. \ iru•-1·cll inlt>rariÌt•ll wit lt a 111111111'·[1r"dltc'Ìlll! 'iru-. /'nw.

IVatl. Arod. Sri. U . S., 46. 36:i. \~ ' :E I~ IH~Hl:. H. A .. 196/f.. Tlr c morllholo{:)' :111d tramplnntuhi l it~ uf lltou,t• eaulor~" t ·t· ll~ tru11 ·

sfo raurd i11 l'itro hy polyoma viru,. l irolnf:.'. 23 . S::O:l.

\\ ESS EL, \\ , t'\ \Y. BbRNII AIIII. 19:;7. \ eqdeidu~ault' elcklrtttll'lllltikru~kopi>!' l ll' l 111

chuuf! Von Elrrl ic J.-uurl 'l o•hitfu .. \ sC'Ì it•s i iiiiHirzdlcu . Z. l\n•bsforsrlo .. 62. 1·111.

Fi~t. l .

Fi,!!. ·1

VIOLA 'ITE, l'O LETTI E MARCliEGI ANI

l.cllula 1.929• Purticelle simil-virnli, tipo f, a sede ex tracellulure. Acetato di ura

ui le + Heynold. 60.000x.

("pllule tunwrali Tl.nrlv. Particelle •imil-virali tipo Il. a •cdt' iutra.-cllulure.

\ c-c tu to eli urunill' h.arum , k v. fiO.IIOIIx.

l nu, / .~1 . '; u fJtr, S a ,;i l lt ( IHfiX) 4. :!:d · '.! tiiJ .

Fif.!. 3.

l· lj! . ~ .

\IO l.;\ 'òTE, PII L t: rTI !; \l A Rl..l l Et. l A'\ l

!.t•llule towoorali Tl.uch . Partirl'lle ,juoil-\ ir.oli tipu Il , u •l'Ile intnll'ellula rl'.

\ t·l'tatn do urunill' " nrnuvsky. (otl.lllllh:.

( o•llulu ttiiiiOrall' l'l.ouh-. l'arlit·elle •llnil-' ira li lipn Il. .t •l'CII' "'lr<tt' t•llul .m ·.

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( •·llul.t lttrHorali T l .p . l'.trlil'ellt• •it~~il·,intli tipn I l. \ t'<'l.tln di uraoult•

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Fil(. 7.

Fil(. Il.

VIOLA:'ITE, I'OI.ETTI E \IARCJI EG IA ' l

Crllulu tumo rali TLndv. Particelle --imil-virnli in viu di formuziou e. Aretu to tli uronile t Reynolds. 60.HOOx.

C'o•llula l111no rnlr Tl.ndv. Parti.-Pllr '-i111il-vi ra li in via di formazitlllP. \ r('tuto di

11runile - Karnu - k v. (otl . IIUO~ .

Electron microscopy of an adenovirus associated vU'Us (•)

lnr.o \HCHETTI , ELII.Ailt:TII BEHECZK\ (00) nnd 0\RIA TI·: \ E BOCCI \HELI.I.

''i l h Lhe Uhbislunce of GIUSEPPE \HA, Cl A und LrNA fHOVALUSCI

/)~flliTifllt'ltl or \ficrobro/og_y 011d f)pporl/llf /11 or /'/IV$iU,

Summary. - 1 uclt>i of monkcy kidncy cclls infcr teJ \>'ith !> imian atlt'· novirus S 11 acco mpanieù by its AA V (atl t·no" irus associatt>d virus) afJparf'ntly co ntaineù f•ith<'r thc adPnovirus or tlw \AV only, or hoth. AAV parti·· lrs appran·d a-; t'o111ph•tc ... irions, antl often as t•mpt y partides which rnight co ns titutt• •·ntire parts •>f Lhc nucleus. ' pecific virnplasrna of the adr-novirus and \A with an ocrasionally difft>rcnt structurr rould be ohsn vNI. H.esults ubtaiucc.l uftcr digcs tion with eithcr HNase !lr D ase of both free A.\ V and ultra-thin cctions contain ing the virus wrre not r (('ar , ;,u that no concl usion was rrachNI cunce rning the nuclcic ucid contcnt of \ A V.

Riassunto (Studio ul microscopio p/ettrotLico eli un virus associato all'(ldcnovirus). - [ nuclei Jdle cellule di rene di cimmia in coltura in vitro e inft'ttate con l'adrnovirus della scimrnia SVll insieme al suo .\A V (il virus assoria to all'adrno\ irus) contenevano il solo adcnovirus o il bolo .\.'\V o entrambi i v irus. Le particelle di AA V a pparivano rome vi rion co mpleti, ma sprsso .m cbc come particeiJe ntote cht- potevano costituire nel loro insieme anche inticrc parti del uuclco . i è potuto osservare il matrrialc del 'iroplasma spc··ifìco dei due 'irus, r he talvolta prrst'nta,•a una ;, truttura diver!:>a, fìn t•mente granulosa per l'adenovirus . co:. tituito da partic .. llc dt>nse a l fascio drgli o• lettroni c di un diametro •tuasi idrntico a •tuello c.li .L\ V nel ca o di que~to. r risultati ottt>nuti con l'osservazione a l micrOSCO (JiO (' lt•ttronico di AAV lih('rO o Ùt' lle fettine ultrasnttili ronlPilt'nti il vi rus, dopo digestione con Hl\asi o DNas i, non ;;ono :.tati chiari, pt•r cui ne. suna conclusiont• l'erta è s t a ta possil,i le trarre sul tipo di acido nudt>iro contenuto in \AV.

(•) l'his invt•stic;.llion 1\US • upporlctl in (>.trl hv ,, l'uulic lle.tllh 'wrvicc l•o•llo"'hip (i- F2-t' \ -22, :i07-:l:!) fro111 Lhe \utronul ln ~tilulc uf lll'alth und by the Cuu~iglio \u.eiorwle ,Jt:J ie Hieerl'he.

(0 0

) 'laltonu l lnotitute of llculth pn•l-tlnt'loral lt•llnw.

"ESPERI"EN:n: E li!CERCJH.

'l'be adcnovirul'l assuciateù viru1< (AAV) which i~ iimud to~tPther with simian adenoviru11 SVU has hecn a conc~rn of our lahoratory since 196:'1 (ARCHETTI & STEvE BocciARELLI, 1963). This small polyhedral viru~, ahoul

240 A in diametcr, dues not replicate whcn tht: "helper" virus (in this catw, thc adenovirus) i;; absent (ATCUJSON, CASTO & HAMMON, 1965). Data ba ... (· heen prescnted which indicatt" that AA V replicate;; within the nuclei of doubly infected cell~; (ATCHlSON, CASTO & HAMMON, 1966) but at tÌmt"~

infected nuclei an1 found whicb apparently conta in only AAV and no adt:no· virus {ARCHETTI, BERECZKY & STEVE BocCIARELLI, 1906). Since tbc helpl'r situatiOIJ is bccoming mnre and more important in studies of \'ÌtuSC6 ìt wa~ of interest to study tbc devclopment of tbese two viruscs witbin tbc bt1st cell in or der to understand hcttcr tbc rclationsbip hetween t h<' "hdpt·r " and AAV, and to aseertain tu what cxtcnt one virm; delumds upnn tht• othcr for its replication.

In this papcr tbc electron microscopy studics pcrformcd on the rcplication of AA V and SVll in tissue culturcs of monkey kidncy cells are reported and some morphological observations on tbc nature uf tbe two-virns system are presented.

MATJ::RlALS AND METHUDS

Celi cuùurcs. - Primary rhesus monkey tissUEJ cultures (MKTC) werc preparcd as previously described (BEllECZKY, KAWAKLOVA & ÀRCHETTI, 1967). Ccll culturcs WCrtJ grown in Eagle's minimal essential mcdium (MEM) suppkmcnted with lO% calf scrum. Cells were maintained in MEM without serum.

Virus.- Stocks of SVll (') and SV15 (+) ("') wcre pn:pared by innculating l X 101 PFUjml into 32oz hottles of MKTC. When cytopathic effect was almost complete, tbc cells and tluid werc pooled, frozen and thawed 5 times, and thc resulting SU}Jernatant centrifuged first at 3,000 rpm for 1/2 hr and then at 40,000 rpm for 2 br in a Spinco model L preparative ultracentrifuge.

Electron microscopy of free virus. - Pellcts of frcshly harvestcd virus wt~rc suspended in a f(·w drops of distillcd water. One drop of tbis virus suspension was mixed with one drop of 2% PTA (phosphotungstic aci d) p H 4.5 to 5.5 and samplcs were placed on a carhon-coatcd mcsb grid by mcans of a platinum loop. The cxccss liquid vias removed and tbe grid hlottcd dry.

Tbc grids were examined with a Sicmens Elmiskd'p l electron microscopc at a magnif1cation of 40,000.

(•) The presence of AA V in stocks of adenovirus is depi<"ted Il~ ( •) according to the suggcstiOII of lloGGAN, BLACKLOW & ROWJ: (1966).

An<•. lsl. Suprr . .Suni!<Ì {1U61'i) 4, ll6l·ll6ll.

T

-~RCHETTI, BERECU.V E ~TEVE BOCCI,!.REI,Ll :!63

Electron microscopy of infected tissue cultures. - lnfected MKTC in Kolle bottles were f1xed with 2 % gluteraldehyde in 0.08 M buffered sodium cacodylate pH 7.2 for 10 minutes, washed for 10 minutes in the same buffer with the addition of 0.18 M sucrose, and then fixed in 1 % OsO, in buffered cacodylate for l hour. After dehydration in a graded series of ethyl alcohol, the cells wt're embedded in Araldite. Ultra-thin sections were cut on a Porter- Blum MT2 ultramicrotome and mounted on 200-mesb grids with a film of formwar. Tlw section;~ were stained with saturatcd uranyl acetatc and lt·ad hydroxide for 10 minutes (method KARNOVSKY, 1961), and washed well with distilled wat('r before examination.

Enzyme treatments. - l) lnfected cells were fixed as aLove for lO minutes in gluteraldehyde an d wasbed overnight in buffer before being treated with enzymes. O. l% DNase for 2 br at 370 C; O. l% RNase for 4 hr at 370 C and llistilled water as a contro\ for 2 hr were used. Ali the solutions were a!ljust"d to p H 6. 7, The cells were washed with buffer and fixed in OsO~ ht'fore Araldite ~~mbedding. 2) Free AAV particles obtaincd from cells inff'cted with SV11 (') or SV15 (') Wf're suspended in buffer and plact~d on grids covt'rcd by a formvar film. Tbc surplus water was blotwd off and thf" enzyme treatment was performed using the same solutions as for infected rclls, but only for 15 minutes. Treatment with distilled water was carrit'd ont <IS a contro l. The virus preparations were ohserved in negative staining.

RESlJLTS

Electron rni(~roscopt' examinations of MKTC 4P. hr after infection with SVll and AAV showed many nuclei which contained hoth SVll and AAV tugdh;•r (l<'i~. l ami inset), in a ratio of about l adenovirus to llVety lO AA V. Fre11tll'ntly nudei which apparently containcd only AAV (Fig. 2) and nuclei which contain1~d only SVll (Fig. 3) wer._. found. Randomly scattercd within the nuc!t"i containing SVll wt'n~ ad .. novirus crystals, similar to those alrca1ly IIPSI~rilwò tOr adenoviruses in generai by many authors (Fig. 1).

Frcqut"ntly noted in tbc nuclei containing SVll were electron-dense irr('gularly ~hapcd hut fine ~tructurl:'d masses (Fig. 4). Adenoviruses were always located in th" vicinity of tbese masse~, which prohably represent the \iroplasm, a precursor materia\ of the mature virus particles.

_\ rather interesting: ohs1~rvation from a morphologìcal point of vicw was that shown in Fig. 3, where tbc major internai part of the nucleus was tilled w ith SV Il particles closely packed and almost all with a well-stained inner core. Within the nucleus was also an electron-light area eontaining structures whieh comisterl of longwinding tihcrs, as can he observ1~Ù at higher magnifica-

"

2hl EbPERU:NZl> E RJCEIICIII~

tiun (inset Fig. 3). Adenuvirus particles aJlpeared to ht· ali{.!:ned singularl~ wit.hin ~~xtension of somt• of thesc fibers in an organiu•1l hPadlike fashion.

Ct>Us whuse nucleus apparently contained only AA \ appeared to t,,, in ~ood condition and had a small but well pre1-wrved cytoplasm. ~omt• uf them showed zone~< of medinm dt~nsit~·· may lw of fihruu~ matf'rial around which many small particles werc lneatt>d (Fig. 5).

Whilf' almost all of tht~ ad•movirus partic\Ps wcn• ('mnplt•lt•, i t w alò conlmon to find a grcat number of empty partidt•s of AAV amon!! the full particiPs (inset Fig. 2. arrow).

Sections thruugh AA \· -containing nuclei v•ere of twn type~ :

l) thnst~ which appeared lik.e a homogennus blankt'\ of particlc~. ami

2) thos" which consi8tt'd of innt'"r light areas ami an oUtf'r darkcr art'<l {Fi1!- 2).

Both parts of the latter nuclt'i containt>d AAV : tht• lightt~r arcas (inst•t Fig. 2) howevl:"r consistt\d of mauy empty particles. A deta;J,-d anal~·sis of serial sections through cl'll~ of these two typt>!< showt•d nn prt'M'"IU"e ol" adenovirus"s.

Crystals of AA V ditl not appear as frequently as thus•• of SV l l. HuWI'"\·t'"T. on st·veral uccasions. discrete crystal formations werc fuund (Fig. l. inset) lt is intere!ltiug to note that, when a nucleu" w alò comph•t('ly filicd with AA Y. no crystals were ohserved.

SVll and AA.V R}l)lean,d to replicatt~ in tht~ cdls at approximatPly th" same time aftt·r infection. At 16 hours dark electron ma~se;; similar to thos" found in nuclei eontaining only A.AV (Fig. 2) wcre already ohs•~rved. Whllt appeared tn be AAV partiek~ wt•re seen in the near voicinity, altlumgh ntl

distin<'t particll's were as yt•t identifiahle.

In connt>ction with other work in progress on tbc nudeic aeid content of AAV (BERECZKY, KAWAKLOVA& ÀRCHETTI,l96R), wc triPd cnzymt> digt'stiom of thc free AAV and of ultra-thin section~ containing thl' viru~;. Neither RNase nor DNase appeared to rcmove completely the con' of AAV in ultrathin sections. Free AAV on the other band, appeared to havP an extrcm•' fragility t!vcn after treatmcnt with water. Small drops of freshly centrifugt'd virus suspended in a drop of water werc distribut.ed on carhon-coated grids and suhsequcntly trcated with DNasc or RNase. Even though an extrcmely high number of cmpty AA V particles was prct<ent hefor~ cnzymt> trt'atment, neither DNase or RNase removed thc content of AAV more than a t.listilled watcr treatment (Tah. l). On tbc contrary the removal nf DNA after DNast> digestion was ohtained in a signi6cant numher of AAV particles assoòated with SV15 (Tah. l). This finding is in kceping with that rcported hy MAYOR

et al. (1965), who indicated that AAV associated with their strain of SV15 contained DNA as shown by this same procedure.

IRUI~'I'TI, 8ERECZKY E STE\'E 80CCIAR~T.U 265

TABLE l.

Nuclease actlvlty on free i\AV partlcles assoclated wlth thelr helper vlm.aes SV Il or SV 1!1 •

1'H~;ATM~:r-;1'

(15 mhmtes)

!'lìo trr..tment .

HIO . D~ase

. \AV r SVII . -·--~-

o,;, full ! % empty J>arllcl"" partlcles

.\AY + .'1Vt5

% full Powtlcles

% emptf partielos

45.11 56.8 72.1

l l

' RNa~~e

.• 6 .Il 34.0 27.5 21.1

.~3.2

66.0 72 .. ) 78.9

54.2 43.2 27.9 46.7 ---53.~-- ___i

On these RYl'rage counh the 99 °, confid.,tu•e interval is ..,; ± l"!,.

OISCUSSION

The ohservations reported bere that nuclei of cells infected with SVll ( +) may contain either the adenovims or a comhination of the two viruses are in agreement with similar results ohtained with simian adenovims SV15 (+) by ATCHISON, CASTO & HAMMON (1966), and by MAYOR et al. (1967). The two viruses (SV11 and AA V) appeared to develop in di:fferent parts of the nucleus as shown also by immunofluorescent studies in cells infected with SV15 (+) (MAYOR et al., 1967). W e bave indicated a particular dense mass which may be connected with the assembly of AA V : these AA Vmasses sometimes differed from those electron-dense masses already k.nown and found in nuclei infected with adenoviruses (ARCHETTI, STEVE BocciA• RELLI & ToscHI, 1960), because they often consisted of groups of electrondense particles having individuai diameters approximately equalling the ..,ize of AAV particles (Fig. 2, inset). These observations, together with the finding in many nuclei of what we consider~d as empty particles of AA V (ARCHETTI, BERECZKY & STEVE BOCCIARELLI, 1966) (Fig. 6) w ere quite diffe• rent from those reported by MAYOR et al. (1967). These authors found faint circular profìles 20 m!J. in diameter in nuclei of cells infected with AA V of SV15 alone and suggested that these structure~; are very similar to those which we described as empty particles. In comparing our pictures witb that of MAYOR et al. we do not think there is any evidence of similarity between the two ~;tructures, which prohably rf'"present differf'"nt aspects of an infected nr non infected nucleus.

Prohahle viroplasmic precursor material associated with adenovirus rt'plication was composed of electron-dense tine structured material. The ditfe• rent morphological aspects of the two types of viroplasma support tht~ hypo· thesis mentioned above that the two viruses develop on two different substrates. The fact that the particll's of the two viruses could be found mixed

together in many cells could simply be related to a mìxing prneel!s of the parti· cles following their assemhl)'.

On repeated occasions we have seen nuclei which apparently containt>d only AAV particles. Severa] reports have clearly demonstrated that AA ,can he prompted to multiply only when intact infectious adtmovirus is prt<· sent (SMJTH, GBELE & THIEL, 1966; CASTO, ATCHISON & HAMMON, 1967: BLACKLOW, HoGGAN & RowE, 1967). If AAV synthesis can really bt:> initiated by a single infectious adenovirus particle (BLACKLOW, HOGGAN & RowE, 1967), then the failure to fìnd such a particle could be simply due tu the great difficulty of examining every ultra-thin section of an infected celi with the electron microscope. However this observation may also be explained by tbc well known interference of AA V upon tht" adenovirus ; so that normal multiplication of this latter virus could be blocked and consequently very few particles found in the nucleus of the infected eell.

The results obtained with enzyme treatment arl' difficult to explaiu. also on account with our preliminary biochemical data on the base composition of the nucleic acid of AAV, which should contain a double-stranded DNA (BERECZKY, KAWAKLOVA & ARCHETTI, 1968). These results could be due to what seemed to be an extreme fragility of AAV particles associated with SVll, so that no signifìcant differences could be found among the data oh· tained with particles treated either with distilled water or DNaM~ or HNaét'. W e are inclined to exclude a technical fault since AA ·v associated with SVIS gave the expected results, in agreement with the chemical analysis of the corresponding nucleic acid.

May 13, 19611.

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Fig. l.- Monkey kidney cell containing in the nucleus both SVII and AAV viruses. A psendo-crystal of AAV in the inset.

Amt. 11!11. Super. San/li! (1968) •· 261·266.

J.'i!(. 2. ---- Monkey kidney celi <'ontaini~ Ìll the nucleus only A.AV: inner light area~ ami outer darker zones are seen. In tbe inset the ~ame >lt hi,;her map;ttìfiratiou : thr arrow poillts to an etnpty J>llrti<'lr.

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Fi!!:. :L -- Monkey kidn .. y "ell with moot of the interior of t h e, nucleu' Jilled with S\" l t J>llrl icle~;. In the i1'"et lon!!: windill!(' fibers can he r .. coguized.

AllLJI"f.TTI, DER"f.LZKY E STBVE BUCCIARELLI

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ARCHETTI, BEREC:ZKY E STEVl!l BOCCU.IU:LLI

.lm!. Jel. t/uper. Sa,.ilà (W6~) 4, ~61-266.

Sulle caratteristiche rnorfologiche di cellule di topo di...

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