Studio dell'espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP ... · Studio dell'espressione di una...

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI SASSARI

SCUOLA DI DOTTORATO IN SCIENZE BIOMOLECOLARI E BIOTECNOLOGICHE

Indirizzo: Microbiologia molecolare e clinica

Studio dell'espressione di una Flavon Diiron

Protein (FDP) in Giardia intestinalis

Relatore Prof. Pier Luigi Fiori

Tesi di Dottorato Dott.ssa Antonia Mura

XXII ciclo

Tesi di Dottorato di Antonia Mura: “Studio dell’espressione di una Flavon Diiron Protein (FDP) in Giardia Intestinalis” Scuola di Dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche Indirizzo Microbiologia Molecolare e Clinica. Università degli Studi di Sassari

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ABSTRACT...............................................................................................................................................................................1 GIARDIA INTESTINALIS ....................................................................................................................................................2

MEMBRANA PLASMATICA.....................................................................................................................................................3 CITOSCHELETRO ..................................................................................................................................................................4 IL DISCO VENTRALE..............................................................................................................................................................5 IL CORPO MEDIANO ..............................................................................................................................................................5 GENOMA ................................................................................................................................................................................6 DIFFERENZIAMENTO ............................................................................................................................................................6 INCISTAMENTO ......................................................................................................................................................................7 STIMOLI PER L’INCISTAMENTO............................................................................................................................................8 EXCISTAMENTO ....................................................................................................................................................................8 EPIDEMIOLOGIA..................................................................................................................................................................10 CLINICA E PATOGENESI .....................................................................................................................................................11 DIAGNOSI.............................................................................................................................................................................12 TRATTAMENTO ....................................................................................................................................................................13 IL METRONIDAZOLO ...........................................................................................................................................................13

FLAVOPROTEINE A DOPPIO FERRO (FDP) ..............................................................................................................15 SCOPO DEL LAVORO ........................................................................................................................................................17 MATERIALI E METODI.....................................................................................................................................................18

CONDIZIONI DI CRESCITA DELLA FORMA VEGETATIVA E DI INCISTAMENTO .............................................................18 FDP ......................................................................................................................................................................................19 OTTENIMENTO DELL’ANTISIERO IN TOPO........................................................................................................................19 SAGE: SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION .......................................................................................................20 IMMUNOFLUORESCENZA ...................................................................................................................................................21 WESTERN BLOTTING ..........................................................................................................................................................21 IPERESPRESSIONE DI FDP IN GIARDIA ..........................................................................................................................23 ELETTROPORAZIONE DELLE GIARDIA. ............................................................................................................................26 RICONOSCIMENTO DELLA FDP CON ANTICORPI SPECIFICI MEDIANTE WESTERN BLOTTING ...............................26 RISPOSTA DI GIARDIA ALLO STRESS OSSIDATIVO E NITROSATIVO ............................................................................27 ESPRESSIONE DELLA PROTEINA FDP CELLULE FARMACO SENSIBILI E FARMACO RESISTENTI ............................29 ESPRESSIONE DELLA FDP DURANTE IL FENOMENO DI INCISTAMENTO ...................................................................30

RISULTATI.............................................................................................................................................................................31 ESPRESSIONE DI FDP IN LINEE CELLULARI MZ SENSIBILI E MZ RESISTENTI .........................................................33 TRASFORMATI IPERESPRIMENTI FDP .............................................................................................................................35 INCISTAMENTO ....................................................................................................................................................................36 IMMUNOFLUORESCENZA IN CELLULE IPERESPRIMENTI ...............................................................................................38

DISCUSSIONE .......................................................................................................................................................................39 SEQUENZA VETTORE AU1 ................................................................................................................................................42

BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................................................44

ABSTRACT

Giardia lamblia is a flagellated unicellular eukaryotic microorganism that

commonly causes diarrheal disease throughout the world. Although Giardia has a

relatively poor tolerance to O2, it preferentially colonizes the fairly aerobic upper

part of the small intestine (duodenum and jejunum). It lacks the conventional

respiratory oxidases as well as the systems (catalase, superoxide dismutase,

glutathione reductase) responsible for the scavenging of radical oxygen species

(ROS).

The flavodiiron proteins (FDP) are widespread among strict or facultative

anaerobic prokaryotes, where they are involved in the response to nitrosative

and/or oxidative stress. The FDP from Giardia has high O2-reductase activity but

very low NO-reductase activity; O2 reacts with the reduced protein quite rapidly

and with high affinity.producing H2O.

Preliminary experiments were designed to examine whether the FDP

recombinant, obtained from an artificial gene, cloned and expressed in E. coli,

stimulate the immune system of the host (mouse) producing specific antibodies. ,

To verify if they specifically recognize the native protein in G. intestinalis, the

antibodies have been used to set up by immunoblotting and

immunofluorescence techniques.

Experiments were performed under conditions of nitrosative and oxidative stress

in order to obtain information on the location and expression of the native

protein, even in these stressful conditions.

By cloning the gene of interest in plamid expression vector, I wanted to study the

overexpression of the protein to determine its intracellular location and confirm

the data obtained with not transformed cells.

Moreover, further characterization experiments have led to study the protein

expression during different phases of the cell cycle of the protozoan, especially

during encystation.

Since recombinant protein showed reducing activities, a portion of the study was

devoted to evaluating the expression of FDP in metronidazole-resistant cells

compared to drug sensitive protozoa, to assume a putative role of protein in the

mechanisms of sensitivity to the main anti – protozoa.


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GIARDIA INTESTINALIS

Giardia intestinalis (sinonimi: G. duodenalis, G. lamblia) è un

protozoo, microaerofilo e flagellato (Barwick et al. 2000).

E’ un parassita intestinale diffuso nell’uomo, nei mammiferi, negli

uccelli e nei rettili ed è la maggiore causa di diarrea non virale nell’uomo

(Müller e Von Allmen 2005). Non è un parassita invasivo ma, in seguito

all’adesione reversibile alla parete intestinale, provoca cambiamenti

morfologici e fisiologici a livello dell’epitelio. E’ l’agente eziologico della

giardiasi, patologia che presenta i sintomi tipici delle malattie da

malassorbimento (Thompson e Monis 2004).

Questo protozoo presenta due stadi prevalenti nel proprio ciclo

vitale, che affronta in due forme differenti: quella del trofozoita e della cisti.

Fig. 1. Forma vegetativa e forma cistica di G. intestinalis

Il trofozoita è la forma vegetativa, classicamente descritto “a forma

di cucchiaio” (Fot. 1). Le sue dimensioni variano dai 12-15 micrometri di

lunghezza, ai 5-9 micrometri di larghezza. Presenta due nuclei,

trascrizionalmente attivi, localizzati anteriormente e simmetrici rispetto

all’asse longitudinale (Kabnick and Peattie 1990).

Possiede quattro paia di flagelli (anteriori, posteriori, ventrali e

caudali) ed una depressione reniforme denominata disco ventrale (Gillin et

al 1996). Il disco ventrale permette l’ancoraggio a substrati sia naturali che

artificiali.


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I flagelli sono importanti per la motilità, ma non per l’adesione

(Buchel et al 1987). Giardia è un eucariote molto antico, non possiede

mitocondri, perossisomi, idrogenosomi (Genchi et al 2003). Non è

confermata, nelle forme in attiva crescita, la presenza dell’apparato di

Golgi, il quale inizia a vedersi solo durante l’incistamento (Gillin et al 1996).

La forma infettiva della Giardia è quella cistica. Le cisti hanno forma

ovale e loro dimensioni variano dai 6 ai 10 micrometri di diametro. Sono

rivestite da una parete spessa e resistente, costituita da uno strato esterno

filamentoso ed uno strato interno membranoso. La componente glucidica

predominante dello strato più esterno è la galattosammina in forma di N-

acetilgalattosammina. Possiedono quattro nuclei in quanto l’incistamento

inizia solo dopo che è avvenuta le replicazione nucleare, ma prima della

citocinesi (Erlandsen et al 1990). Le cisti sono relativamente inerti,

permettono la sopravvivenza del microorganismo in diverse condizioni

ambientali, tra le quali, i livelli ordinari di clorazione delle acque e le alte

temperature, fino ai 50°C (Ortega et al 1997).

E’ stato suggerito che G. lamblia comprenda numerose specie,

identiche morfologicamente, ma divise in gruppi geneticamente distinti. Il

ruolo nella trasmissione zoonotica è ancora incerto, come la connessione

tra severita’ dell’infezione e differenti gruppi. G. lamblia è la sola specie

infettante l’uomo. I genotipi isolati nell’uomo sono gruppi A e B mentre

esistono altri, chiamati C (cani), E (ungulati), F (gatti) e F (ratti e topi)

(Weilinga et al 2007).

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica è un bilayer lipidico semipermeabile

importante per la segnalazione cellulare e come punti di ancoraggio del

citoscheletro intracellulare. La membrana specializzata della Giardia

interagisce con l’ambiente dell’ospite ed è cruciale come sito di

alimentazione (endocitosi), eliminazione di cataboliti (esocitosi) e

nell’attivazione delle difesa immunitaria dell’ospite.


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Il monostrato di antigeni di superficie riveste il trofozoita e la

capacità di far variare questi, è necessaria per la sopravivenza del protozoo.

Questo meccanismo cellulare di difesa è chiamato “variazione antigenica” e

coinvolge attivazione e silenziamento di geni facenti parti di una super

famiglia di proteine di superficie (Simon et al 2007). Per evadere al sistema

immunitario dell’organismo ospite, Giardia attiva un processo di variazione

antigenica, processo che permette al parassita di sviluppare infezioni

croniche e ricorrenti. Da un repertorio di circa 190 geni codificanti Proteine

di Superficie Varianti-specifiche (VPS), Giardia esprime solo una VSP sulla

superficie del parassita in un particolare momento ma cambia verso VSP

differenti con un meccanismo che coinvolge le componenti del macchinario

dell’RNA interference (Prucca et al 2008). Le varianti di VPS posso essere

selezionate tramite la pressione del sistema immunitario o tramite

condizioni fisiologiche. Le VSP di Giardia hanno un peso molecolare tra i 20

e 200 KDa, estremamente ricche di cisteina (circa il 12%). Il Tipo I sono

proteine integrali di membrana con multipli motivi CXXC e con la parte C-

terminale che contiene una regione strettamente conservata CRGKA. Tutte

hanno un caratteristico segnale di poliadenilazione un peptide segnale N-

teminale (14-17 aminoacidi) per il trasporto per il reticolo endoplasmatico

(ER) (Nash et al 1997]. La maggior parte dei residui di cisteina si trovano in

ponti intracellulare determinando la resistenza alle dure condizioni

dell’apparato digestivo dell’ospite (Aley et al 1993).

Citoscheletro

Il citoscheletro di Giardia è una struttura dinamica richiesta in

numerosi processi che includono divisione nucleare, citocinesi,

mantenimento della forma cellulare, motilita’, movimento dei flagelli e

trasporto intracellulare (Tilney et al 1996). Il parassita resiste a perdite di

membrana ed a collassi strutturali (Elmendorf et al 2003) ed è composto

dalle componenti citoscheletriche classiche (microtubuli e microfilamenti) e

da proteine e organelli Giardia-specifici (Pathuri et al 2007). Ci sono cinque

tipi di strutture microtubolari: il fuso mitotico, flagelli/assonema, disco


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ventrale, corpo mediano e il funis. I primi due sono organelli universali del

citoscheletro ma il disco ventrale, il corpo mediano e il funis sono Giardia-

specifici.

Il complesso citoscheletro di Giardia sottostà a drammatici

riarrangiamenti durante entrambe le differenziazioni.

Il disco ventrale

Il disco ventrale permette l’adesione del parassita alla superficie. C’è

una forte relazione tra disco ventrale e malattia. L’attaccamento alle cellule

epiteliali dell’ospite è necessario per evitare l’eliminazione con la peristalsi

(Elmendorf et al 2003; Muller et al 2005). Il bordo ventro-laterale del disco

si interdigita tra i microvilli dell’intestino tenue ma è anche capace di

aderire a superfici inerti [Erlandsen et al 2004]. Durante la crescita in vitro,

Giardia alterna la fase di adesione a quella di nuoto libero.

La divisione cellulare inizi in cellule adese con il distaccamento dei

microtubuli del disco dal corpo basale.

Il corpo mediano

Il corpo mediano è un organello citoscheletrico Giardia-specifico che

è stato usato per la classificazione in specie. Le funzioni proposte per

questo organello sono (Piva et al. 2004):

- una riserva di microtubuli

- progenenesi del disco ventrale

- immobilizzazione dei microtubuli durante la divisione cellulare

- sito di enucleazione dei mitocondri

- coda laterale flessibile.


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Il corpo mediano del trofozoita è piriforme (Adam 2001), in

microscopia elettronica sembra allineato in fascicoli o clusters (Elmendorf

et al 2003) e nella cisti e simile ad un clusters di microtubuli non

organizzati (Hesko et al 1998).

Genoma

Il sequenziamento del menoma del parassita diplomonade Giardia

lamblia WB (assemblaggio A) è completo (Morrison et al 2007) e rivela circa

12 milioni di paia di basi distribuite su 5 cromosomi. Ci sono circa 6500

ORF cui il 73% mostrano essere trascritti attraverso studi di SAGE (Serial

Analysis of Gene Expression).

Le maggiori conclusioni dallo studio dell’analisi del genoma della

Giardia è che esso è compattato in strutture. Contiene sono 4 introni

conosciuti, pochi resti di geni mitocondriali e un macchinario di

replicazione del DNA semplice Archaeal-like. E’ presente un macchinario

della trascrizione e traduzione yeast-like e un limitato set di enzimi

metabolici bacterial-like [Morrison et al 2007; Galperin et al 2002].

Poiché Giardia è un protozoo tetraploide binucleato, si potrebbe

presupporre l’esistenza di un alto livello di eterozigocita’ ma,

sorprendentemente, questo è stimato essere meno dello 0.01%.

Differenziamento

Il differenziamento in Giardia coinvolge due transizioni, da

trofozoita mobile e replicativo a cisti dormiente (incistamento) e dalla cisti

ingerita allo excizoita (excistamento) (Svar et al 2003; Bernander et al

2001).

Durante il differenziamento c’è uno spegnimento regolato dei

programmi di espressione genica in risposta all’ospite e agli stimoli

ambientali.


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Incistamento

La cisti è essenziale per ila sopravvivenza del parassita al di fuori

dell’ospite (Gerwig et al 2002). La peristenza dell’infezione endemica è

dovuta della cisti da ospite ad ospite attraverso contaminazioni oro-fecali.

L’incistamento è la graduale trasformazione del trofozoita mobile in

citi immobile, dormiente e refrattaria in risposta a fattori ospite-pecifici

(Lauwaet et al 2007). Come i flagelli del trofozoita vengono internalizzati, il

parassita perde la capacita’ di adesione (Faubert et al 1991), il disco

ventrale si frammenta (Palm et al 2005), si arrotonda ed inizia in una

dormienza ipometabolica. La parete della cisti (CW, cyst wall) è resistente

all’ambiente ma trasducente e responsabile della sopravvivenza della

giardia nell’ambiente esterno. La natura altamente insolubile della parete

della cisti è dovuta alle forti interazioni intercatena dei carboidraiti e gli

zuccheri della parete associati con le porteine della parete. La parete è

sintetizzata de novo da glucosio endogeno tramite una via di enzimi

inducibili che sono trascrizionalmente e allostericamente regolati (Gerwing

et al 2002).

La sintesi delle proteine della parete della cisti (CWP, cyst wall

proteins) inizia precocemente nell’incistamento e conduce alla formazione

nuove grandi vescicole secretorie dell’incistamento (ESV, encystation

secretory vescicles) (Reiner et al 1990; Marti et al 2003; Lanfredi-Ragel et al

2003) le quali sono organelli che esportano le CWP. Tardivamente

nell’incistamento, dopo che la parete della cisti è stato prodotta, serviranno

delle divisioni nucleari per avere 4 nuclei della cisti (Reiner et al 1990;

Gillin et al 1996). L’incistamento delle Giardia è una reminescenza di un

processo sessuale di meiosi [Svard et al 2003]. Fino ad ora, Giardia è stata

considerata strettamente asessuata ma la presenza di geni meiotici

(Morrison et al 2007; Ramesh et al 2005), bassi livelli di eterogozicita’

allelica (Teodorovic et al 2007) e nuove evidenze di ricombinazioni da

popolazioni genetiche (Cooper et al 2007) sembrano indicare il contrario.


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Stimoli per l’incistamento

Come è stato a lungo osservato, c’è una relazione tra secrezione

della bile e numero di trofozoiti colonizzanti (Hegner et al 1937). Quando

una bassa concentrazione di bile viene aggiunta al medium di coltura del

parasita, la crescita aumenta drammaticamente (Keinster et al 1983). Si è

ipotizzato che l’ambiente dell’intesino poterebbe stimolare l’incistamento.

Esperiementi condotti da Gillin F. mostrano che è possibile osservare

l’encistamento in vitro dopo l’aggiunta di alte concentrazioni di bile a pH

fisiologico di 7.8 (Gillin et al 1987; Gillin et al 1989).

Quando, in topo affetto da giardiasi sono ridotti i fisiologici livelli di

bile, si è osservata una significativa riduzione (103-104) nell’escrezione

fecale delle cisti. (Erlandsen 2005). Mentre l’incistamento è indotto da

grandi quantita’ di bile, non sono stati ancora identificati meccanismi

molecolari per indurre l’incistamento.

Excistamento

L’excistamento è un drammatico risveglio dalla fase dormiente che è

necessario per iniziare l’infezione.

L’infezione dell’ospite ha inizio quando le cisti vengono ingerite,

attraverso l’assunzione di acque o cibi contaminati. Negli uomini la dose

infettiva sufficiente varia dalle 10 alle 100 cisti ingerite (Rendtorff 1960).


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Fig. 2 Ciclo biologico di Giardia intestinalis

L’excistamento è un processo rapido (Lioyd et al 2007). Dopo che

vengono esposte all’ambiente acido dello stomaco, le cisti vengono attivate

(5-10 minuti) e passano nell’intestino prima della rottura della parete (20-

60 secondi). Appaiono i flagelli attraverso una apertura in un polo della

cisti, seguito dal corpo dell’excizoita (Svard et al 2003).

Ultrastrutturalemente è possibile vedere una nuova protusione di

citoplasma chiaro vicino ai flagelli che aiuta nello stabilire la polarita’ della

cellula excistante (Htesko et al 1998). La citocinesi ha un importanza

centrale nel processo per dare due cellule figlie (7-8 minuti) che si

divideranno ancora per dare 4 trofozoiti diploidi (Svard et al 2003).

L’excizoita deve simultaneamente dividersi, segregare i suoi

organelli, attivare la sua motilità e la sua adesione e, infine, aumentare il

suo metabolismo (Lauwaet et al 2007). Biochimicamente, durante

l’excistamento, le CWP sono defosforilate (Slavin et al 2002) mentre

vengono rilsciate cistein proteasi endogene nello spazio peritrofico (Ward et

al 1997) e vengono espressi trascritti excistamento-specifici (Hetsko et al

1998). Molti dei trascritti espressi sono geni VSP (Svard et al 1998).


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Giardia ha almeno 3 set di geni la cui espressine è unicamente

regolata:

-geni incistamento specifici quando il trofozoita si differenzia i cisti;

-geni ecistamento-specifici espressi dall’excizoite durante

l’excistamento

-VSP che sono espressi , uno alla volta, sulla superficie del

trofozoita.

L’accurata traduzione dei segnali ambientali, sincronizzata con il

riassemblamento del citoscheletro, dipende da un sofisticato sistema di

segnalazione.

Epidemiologia

Il serbatoio di infezione è costituito principalmente dagli ospiti

umani e dalle acque superficiali (Genchi et al 2003). Nei paesi in via di

sviluppo l’incidenza della giardiasi è circa del 20% a confronto con il 5% dei

paesi sviluppati, dove essa è associata prevalentemente a viaggi esotici e

contaminazione delle acque (Flanagan 1992). Ha una distribuzione di tipo

globale, sono stimati circa 2,8 x 108 casi all’anno (Lane et al 2002). In Asia,

Africa ed America Latina circa 200 milioni di persone all’anno manifestano

la giardiasi. Nei paesi in via di sviluppo, dove la giardiasi raggiunge le

prevalenze più elevate, la via di trasmissione più frequente sembra essere

quella oro-fecale diretta. La gravità della malattia è definita da

un’interrelazione tra la virulenza del parassita, lo sviluppo del paese e le

condizioni nutrizionali ed immunologiche dell’ospite (Eckmann 2003).

In Italia i primi dati riguardanti la giardiasi risalgono al 1960 (Pucci

1967), ma solo più avanti, furono eseguiti degli studi su larga scala, i quali

dimostrarono che gli individui clinicamente affetti erano per il 3.2% adulti

(Libanore et al 1991) e dallo 0.9% (Caprioli et al 1996) al 4.7% bambini

(Cevenini et al 1985).


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Successivamente tra gli anni (1994-1998) è stato registrato un

significante declino dell’incidenza, dal 4.66 allo 0.94% e dal 10.99 al 2.41%,

indipendentemente dall’età (Ballone et al 2001).

Nonostante Giardia non sia considerata un comune patogeno

opportunistico nei pazienti immunodepressi, nei soggetti affetti da HIV

l’incidenza della giardiasi varia dal 3.47 al 6.15%, prima dell’ introduzione

della HAART (Terapia Anti-Retrovirale Altamente Attiva) (Angarano et al

1997).

Clinica e patogenesi

Il periodo di incubazione varia da 5 a 25 giorni. Le manifestazioni

cliniche, della giardiasi, possono essere molto variabili, da un’assenza dei

sintomi ad una diarrea di tipo cronica o acuta, perdita di peso,

deidratazione, gonfiore addominale, nausea e vomito (Eckmann 2003).

I trofozoiti colonizzano la mucosa del duodeno e dell’ileo e

aderiscono ad essa grazie al loro disco ventrale, non penetrando nella

parete intestinale.

I sintomi della giardiasi possono essere provocati dal rilascio di

enzimi proteolitici che riducono le funzioni della barriera epiteliare e

possono indurre apoptosi cellulare. (Genchi et al 2003). Studi avanzati

sulle proteasi della Giardia hanno chiarito che questo protozoo contiene

numerosi enzimi proteolitici che giocano un importante ruolo nei processi

metabolici e fisiologici (Parenti 1989, Hare et al 1989 , Williams et al 1989).

Altri studi hanno evidenziato che queste molecole sembrano importanti in

processi come adesione, nutrizione, patogenesi ed evasione dalla risposta

immunologica dell’ospite (Kaur et al 1995). L’infezione riduce lo spessore

dei microvilli (Scott et al 2000) e parallelamente viene inibita l’espressione è

l’attività di molti enzimi digestivi (Nain et al 1991).

L’alterazione dei microvilli non è la diretta conseguenza

dell’interazione tra i trofozoiti e l’epitelio intestinale, essa è provocata dal

sistema immunitario dell’ospite (Nain et al 1991). Vengono secreti anticorpi


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IgA ed IgM in grandi quantità, nel lume intestinale, questo sottolinea

l’elevata importanza dell’azione dei linfociti B (Snider et al 1986; Nash et al

1987; Heyworth 1989 e Faubert 2000). Inoltre gli antigeni di Giardia

provocano l’emissione, da parte dei linfociti T della mucosa intestinale, di

linfochine tossiche per gli enterociti (Genchi et al 2003). In aggiunta alla

secrezione di anticorpi, riveste un ruolo importante, nella difesa

immunitaria, il rilascio di fattori antimicrobici, in particolar modo il rilascio

di NO. NO oltre ad avere un’azione antimicrobica, per un ampio range di

parassiti patogeni (Daniel set al 1994; Brunet 2001), riveste altri ruoli come

quello di neurotrasmettitore e di regolatore dell’integrità della mucosa

intestinale e del tono vasale (Wallance et al 2000).

NO ha un’azione citostatica e citotossica nei confronti dei trofozoiti

(Fernandes et al 1997), può determinare l’inibizione dell’incistazione e

dell’excistazione.

Diagnosi

La diagnosi è resa possibile dall'evidenziazione, mediante esame

microscopico, nelle feci dei caratteristici trofozoiti o delle cisti. Questi sono

facilmente rinvenuti nelle infezioni acute, ma l'eliminazione del parassita è

intermittente e a bassi livelli nella infezione cronica. La diagnosi può

richiedere perciò ripetuti esami delle feci o l'esame del contenuto

dell'intestino superiore ottenuto con una striscia di nylon o per aspirazione

endoscopica.

Più sensibile alla microscopia è la ricerca di antigeni di Giardia nelle

feci mediante test immunoenzimatici o in immunofluorescenza. Sonde

specifiche di DNA sono in fase di studio (Genchi et al 2003).


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Trattamento

I farmaci più usati per il trattamento dell’infezione da Giardia sono i

nitroimidazoli, metronidazolo e tinidazolo (Genchi et al 2003).

Il Metronidazolo

Il metronidazolo (Mz) è una antibiotico e un anti parassitario della

famiglia dei nitroimidazoli. Scoperto nel 1957, è utilizzato nella pratica

medica da circa trent’anni. E’ attivo su quasi la totalita’ dei batteri anaerobi

metre i protozoi sensibili sono Trichomonas vaginalis, Balantidium coli,

Entamoeba histolytica, Blastocystis hominis e Giardia lamblia.

Fig 3 Formula chimica del metronidazolo e riduzione del gruppo nitro

Il meccanismo di azione del farmaco è correlato con la tossicita’ dei

suoi prodotti. Infatti il Mz puo’ essere considerato come una profarmaco in

quanto è inattivo. Il gruppo nitroso è essenziale per l’attivita’ antimicrobica

(Escobedo e Cimerman 2007). Quando il Mz si trova all’interno del

trofozoite, la proteina di trasporto degli elettroni ferrodoxina dona gli

elettroni al gruppo nitro del farmaco. La riduzione del gruppo nitro

favorisce il trasporto e l’accumulo intracellulare del Mz. Il gruppo nitroso

ridotto causa un danno alla funzionalità di importanti biomolecole e, come

risultato finale, porta alla morte delle cellule sensibili. I prodotti tossici


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possono essere anche reattivi verso le componenti cellulari. (Upcroft e

Upcroft 1998) inoltre Mz inibisce il consumo di ossigeno attivando un

alternativo accettare degli elettroni (Paget et al 1983).

Il farmaco è stato estesamente utilizzato nella terapia in differenti

modalità e dosi. In media l’efficacia della cura è del 89%, in pazienti adulti

a cui il farmaco era stato somministrato per 5-10 giorni. La

somministrazione, la media dell’efficacia della cura. Con la maggior durata

della terapia di riducono le complicanze ma aumentano gli effetti collaterali.

Gli effetti collaterali sembrano essere dose-dipendenti e includono: gusto

metallico, nausea, mal di testa, vertigeni e leucopenia (Misra et al 1995).

Il Mz è stato visto essere mutagene nei batteri e studi su animali

mostrano che, somministrata ad alte dosi e per lunghi periodi, è

cancerogena (Rosenkranz et al 1975).


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FLAVOPROTEINE A DOPPIO FERRO (FDP)

Prima denominazione: A-type flavoproteins (Wasserfallen et al

1998), proteine tipicamente espresse in procarioti anaerobi (stretti o

facoltativi), recentemente identificate anche in un ristretto gruppo di

parassiti protozoali, tra i quali Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica e

Trichomonas vaginalis (Andersson et al 2003).

E’ una famiglia di enzimi in grado di catalizzare la riduzione del NO

in N2O e dell’ O2 in H2O, contribuendo a proteggere da stress di tipo

nitrosativo e/o ossidativo, i microorganismi nei quali esse sono espresse.

La caratteristica distintiva di questa famiglia di proteine è la

presenza di un core comune costituito da un dominio N-terminale nel quale

risiede un sito a doppio ferro non emico (Fe-Fe), dove avviene la reazione

con i substrati gassosi, e un dominio C-terminale contenente un flavin

mononucleotide (FMN).

Hanno una struttura omodimerica di tipo testa-coda, in cui il FMN

di un monomero ed il centro Fe-Fe dell’altro sono posti ad una distanza tale

da garantire un rapido trasferimento elettronico tra i due centri redox (Di

Matteo et al 2008).

FDP di G. intestinalis è la prima FDP eucariotica ad essere stata

espressa, purificata e caratterizzata per mezzo di raggi-X, cristallografia e

spettroscopia. Ha una elevata attività di O2-riduzione ed una bassa attività

di NO-riduzione (Gomes et al 2002).


16

Fig. 3. Struttura 3D della FDP un monomero è blu ed azzurro, l’altro

monomero è rosso ed arancione. I colori chiari indicano le estremità N-

terminali ed i colori scuri indicano le estremità C-terminali. In verde sono i

centri a doppio Fe e in giallo sono indicati gli FMN.

Giardia ha una scarsa tolleranza per l’ossigeno, si ritiene che

l’attività ossidasica le permetta di colonizzare il tratto superiore

dell’intestino tenue, dove l’ossigeno è presente in concentrazioni

relativamente alte. Inoltre l’attività NO-riduzione le permette di difendersi

dall’ossido nitrico prodotto dal sistema di difesa dell’organismo ospite, N2O

viene eliminato per diffusione (Parenti 1989).


17

SCOPO DEL LAVORO

Questo studio si focalizza sullo studio e caratterizzazione di una

flavoproteina a doppio ferro (flavondiiron protein, FDP) presente in Giardia

intestinalis.

La FDP è presente sia in batteri sia in protozoi anaerobi e anaerobi

facoltativi. La sua funzione è di protezione dell’organismo in risposta ad uno

stress nitrosativo e ossidativo.

Lo scopo è stato quello di verificare se la FDP ricombinante, ottenuta a

partire da un gene artificiale, clonata ed espressa su E. coli, stimolasse il sistema

immunitario dell’ospite (topo) nella produzione di anticorpi specifici. Una volta

ottenuti gli anticorpi verificare, con tecniche di immunoblotting e

immunoflorescenza , se questi riconoscessero in maniera specifica la proteina

nativa in G. intestinalis.

Gli studi, in collaborazione con l’Università degli studi di Roma “ La

Sapienza”, hanno previsto inizialmente la valutazione di un’attività NO-

degradativa e O2-degradativa.

In Giardia sono stati eseguito successivamente esperimenti in

condizioni di stress nitrosativo e ossidativo, al fine di ottenere informazioni sulla

localizzazione e sulla espressione della proteina nativa.

Mediante clonazione del gene di interesse all’inteno dei un vettore di

espressione, ho voluto studiare l’iperespressione della proteina e la sua

immunolocalizzazione.

Inoltre studiare l’espressione della proteina durante le fasi della vita del

protozoo (incistamento).

Poiche’ la proteina artificiale mostrava proprieta’ riducenti, andare a

valutare l’espressione in cellule farmaco resistenti e farmaco sensibili.


18

MATERIALI E METODI

Condizioni di crescita della forma vegetativa e di incistamento

Negli esperimenti venivano impiegate cellule Mz resistenti e Mz

sensibili. Le linee sensibili era costituite C6, 713 e 106 mentre le linee

resistenti corrispondenti erano 713-MzR e 106-21D10. Le linee resistenti

sono state ottenute a partire dalle linee sensibili, tramite mutazione indotta

dagli UV. Dati sulla resistenza sono presenti in letteratura.

Tab .1 Comparazione di MIC (minima quantità inibente) in linee di G.

intestinalis MZ resistenti (Upcroft et al 2006)

I trofozoiti G. lamblia erano fatti crescere nel medium TYI-S-33

modificato con bile bovina (Diamond et al 1978; Keister 1983) e completato

con il 10% di siero bovino. Le cellule erano poste in incubatore a 37°C in

tubi da 10 ml che permettano la crescita e l’ adesione.

L’incistamento era stato indotto come descritto da Boucher e Gillin

1990. I trofozoiti, dopo 48 ore nel medium di crescita a pH 7.2 senza bile,

erano trasferiti nel terreno di incistamento contenente 0.25 mg/ml di bile

bovina e acido lattico 5 mM a pH 7.8. A 21h dal processo di incistamento,


19

le ESV erano contate mediante microscopio ottico a contrasto

interferenziale. Il numero delle ESV indica se avverra’ o meno

l’incistamento. Se il valore ESV/cellula è inferiore 3 si avra’ un basso

numero di cisti; se il valore è zero, non ci saranno cisti.

Le cisti venivano raccolte, dopo 48 ore dall’incistamento, dal fondo

della provetta mentre i restanti trofozoiti erano lisati per incubazione in

acqua distillata sterile per 20’ a 4°C.

FDP E’ stata utilizzata la flavondiiron protein (FDP) sotto forma di

proteina ricombinante del peso di 45 kDa. Questa proteina è stata prodotta

a partire da un gene sintetico, clonata e espressa in E. coli, dal

dipartimento di Biochimica dell’Università La Sapienza (Di Matteo et al

2008). Questo è stata una delle poche FDP identificate su basi genomiche.

La proteina mostra attivita’ O2-reduttasica e una bassa attivita’ NO

reduttasica. Inoltre l’O2 è stato trovato reagire non solo velocemente con la

proteina ma anche con una alta affinità cedendo H2O come prodotto. Su

questi dati è stato proposto che FDP giochi un ruolo cruciale in vivo di

detossificazione dall’O2(Di Matteo et al 2008).

Ottenimento dell’antisiero in topo

L’immunizzazione di topi BALB/c di 5 settimane è stata ottenuta

mediante due inoculi a distanza di 10 giorni , sia per via sottocutanea che

intraperitoneale, di 20 µg di proteina ricombinante risospesa in Adiuvante

di Freund (completo per il solo primo inoculo). 10 giorni dopo il secondo

inoculo, i topi sono stati immunizzati per la sola via intraperitoneale con 10

µg di proteina risospesa in PBS. 6 giorni dopo il booster finale, i tipo sono

sacrificati per dissanguamento ed il siero iperimmune ottenuto dopo aver

eliminato il coagulo . Dopo aver raccolto il siero, la reattività, sia generale


20

che specifica, è stata testata mediante western blotting verso la proteina

ricombinante, ed il titolo anticorpale determinato mediante tecniche ELISA.

SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

L’insieme di tutti gli mRNA presenti in una cellula si definisce

trascrittoma. Ogni trascrittoma ha una composizione complessa, con

migliaia di mRNA diversi, ciascuno presente ad una data concentrazione.

Idealmente, per caratterizzare un trascrittoma è necessario identificare tutti

questi mRNA. Il modo più diretto di caratterizzare un trascrittoma sarebbe

quello di convertire tutti gli mRNA in cDNA e poi di determinare la

sequenza di tutti i cloni della libreria di cDNA così ottenuta. Questo

approccio, seppur realizzabile, è estremamente dispendioso sia in termini di

tempo che di risorse, perché si analizza un gene alla volta. Diverse tecniche

consentono invece l'analisi in serie dei geni: la visualizzazione differenziale

degli mRNA è utile per capire come si modifica l'espressione genica nelle

cellule in diverse fasi fisiologiche e di sviluppo (analisi comparativa); questo

metodo però identifica solo un gruppo parziale di geni e non è utilizzabile

per determinare l'abbondanza dei diversi trascritti. L'analisi seriale

dell'espressione genica (SAGE) permette di determinare

contemporaneamente la struttura, la funzione e l'espressione di un intero

trascrittoma. Questa tecnica è stata ideata e messa a punto nel 1995 da

Velculescu (Velculescu et al 1995 ).

l SAGE si basa su due principi:

- Una corta etichetta di sequenza (9-10 pb) contiene sufficiente

informazioni per identificare un qualunque mRNA in modo univoco;

- La concatenazione di molte etichette (tag) in un unico clone di

cDNA consente l’analisi in serie degli mRNA in modo più efficiente.

Opportuni programmi al computer saranno successivamente in

grado di convertire le informazioni inizialmente presenti come un’unica


21

stringa di dati in una tabella che riporta per ogni mRNA identificato

descrizione e livello di espressione genica (numero di tag).

Immunofluorescenza

I trofozoiti erano raccolti e lasciati aderire ai vetrini coprioggetto a

37°C per 10’. Il citoscheletro era estratto in situ con una soluzione di Triton

X-100 0.5% in TRIS 10mM pH 8.5, EDTA 2 mM, MgCl2 2 mM, KCl 150 mM

e ditiotreitolo (DTT) 2 mM. Le cellule erano fissate in metanolo e

permeabilizzate con Triton X-100 0.5% in PBS.

Successivamente, trofozoiti venivano prima saturati con la soluzione

bloccate (siero di capra 5%, glicerolo 1%, BSA 0.1%, gelatina di pesce 0.1%

e sodioazide 0.04%) per 1 ora e poi incubati con anticorpi anti-AU1(1/500)

per 1 ora.

I vetrini venivano lavate 3 volte in PBS e, in seguito, incubate con

anticorpo di primario specifico per FDP (1/500), per un ora a temperatura

ambiente. I vetrini coprioggetto, lavati 3 volte in PBS, venivano incubati,

successivamente, con l’ anticorpo secondario policlonale Anti-Mouse

fluorosceinato (FITC)(1/10000). I vetrini, lavati 3 volte in PBS, venivano

postfissati in paralformaldeide 4% per 5’, lavati in PBS e montati con

ProLong Gold con 4’,6-diamino-2-fenilindolo (Molecular Probes). La

localizzazione della proteina avveniva tramite microscopio Nikon Eclipse

E800 con lampada fluorescente X-CiteTM 120.

Western blotting

Le cisti e i trofozoiti in differenti stadi della vita venivano lavati in

PBS e raccolti per centrifugazione 1800 rpm per 10’.

Le proteine totali cellulari erano precipitate con TCA al 6% e

quantificate con Low Density Protein Assay (Pierce).


22

Mediante SDS PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide) su un

gel Tris-HCl al 4-20% (Invitrogen), 5 ug/line di proteine venivano separate e

trasferite in una membrana di nitrocellulosa (iBlot® Transfer Stack,

Invitrogen) mediante iBlot Dry Blotting System (Invitrogen).

Per tutte le corse elettroforetiche è stato seguito il metodo descritto

da Laemmli. Il tampone della corsa elettroforetica era costituito da 24 mM

Tris, 3,4 mM SDS, 192 mM glicina; la corsa veniva inoltre effettuata ad un

voltaggio costante a 131 V.

La membrana veniva saturata con PBST 0.1% (135 mM NaCl, 1,3

mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4, 0,5 mM KH2PO4, 0,05% di Tween 20, pH 7,4),

Siero di capra 1% e latte 3% per 1 ora e poi incubata con anticorpi murini

anti FDP o anti-AU1 per 1 ora in agitatore orbitante.

Gli anticorpi anti-AU1 riconoscono la sequenza aminoacidica

DTYRYI di pOCT-AU1.

Il loading control (LC) era costituito dalle proteine tubulina o

taglina. La membrana veniva incubata con anticorpi murini anti- tubulina

(1/1000) o anticorpi anti-taglina (1/1000) per un ora in agitatore orbitante.

Successivamente la membrana veniva lavata 3 volte in PBST 0.1%

per 5’ e incubata con anticorpi HRP-goat serum anti-mouse IgG (H+L)

(Invitrogen) (1/5000).

Il filtro, lavato 3 volte in PBST 0.1% per 5’, sviluppato con ECL o

ECL plus (Amesham) e il segnale chemiolumiescente era esposto su Hyblot

CL Autoradiography Film.

L’intensita’ delle bande era quantificata mediante il programma

Quantità One (Bio-Rad). L’intensità delle bande AU1 o FDP era

normalizzata con l’intensita’ del LC (FDP/LC o AU1/LC) in modo che C6=1

e C6 FDPAU1=1.


23

Iperespressione di FDP in Giardia

La proteina FDP è stata ottenuta, a partire da DNA genomico del

clone WBC6, mediante PCR utilizzando i seguenti primers:

FDPover-For: aaactcgagATGTCTTCTAAGCCCAAGTATGTGCAGG

FDPover-Rev: aaagggcccCTGCTTAGGGGCGTTCTTCTCGCAG

La reazione di PCR era ottenuta in un volume 50 ul contenente

Phisium mastermix , FDPover-for e FDPover-rev 10mM, 100 ng DNA

permetteva di ottenere un amplicone di 1245 pb.

3’ 98°C 15’’ 98°C 30’’ 60°C x 2 cicli 50’’ 72°C 15’’ 98°C

H2O 23.5 ul

Phisium mastermix 25.0 ul

Pr. FDP Over-For (10 uM) 0.5 ul

Pr. FDP Over-Rev (10 uM) 0.5 ul

DNA 0.5 ul


24

30’’ 65°C x 29 cicli 50’’ 72°C 5’ 72°C

4°C

Al fine di ottenere l’iperespressione della proteina, FDP era clonata

all’interno del plasmide pOCT-AU1 (Lauwaet et al 2006). Utilizzando 1 mg

di DNA, veniva effettuata una doppia digestione a 37°C per 1 ora con gli

enzimi Apa1 (Promega) e Xhol (Promega):

Plasmide

(ul)

DNA FDP

Over (ul)

DNA 0.5 28

Apa1 1 1

Xhol 1 1

10X Buffer 4 5 5

H2O 42.0 14.5

BSA (stock 10

mg/ml) 0.5 0.5

TOTALE 50 50

Il plasmide e DNA FDP Over erano purificati con PCR products

purification kit (QIAGEN) ed eluiti in 30 ul di acqua. La concentrazione è

stata determinato allo spettrofotometro a 260 nm.

E’ stata fatta una seconda digestione con l’enzima Apa1 a 25°C:


25

Plasmidi (ul) DNA FDP

Over (ul)

DNA 25 29

Apa1 1 1

10X Buffer 4 5 5

H2O 18.5 14.5

BSA (stock 10

mg/ml) 0.5 0.5

TOTALE 50 50

Il vettore OTC è stato purificato con PCR products purification kit

(QIAGEN), eluito in 30 ml di acqua e desfoforilato con Shrimp Alkaline

Phosphatase (Promega).

DNA

vector

30

ul

SAP 1

ul

H2O 5

ul

SAP buffer 10X 4

ul

TOTALE 40

ul

Dopo un incubazione a 37° per 15’ e inattivazione dell’enzima

tramite calore a 65°C per 15’, il vettore è stato caricato su un gel 1%

agarosio in TAE buffer. Il DNA, estratto tramite Gel Extraction kit

(QIAGEN), è stato eluito in 30 ul di H2O.

Per la ligation è stato utilizzato il kit AccuPower® Ligation PreMix

(Bioneer). A 5 ul del vettore vengono addizionati 15 ul di inserto (FDP over o


26

H2O per il controllo) e 20 ul di mix. L’incubazione avveniva per 10’ a

temperatura ambiente.

I plasmidi erano trasformati in E. coli JM109 (Promega). I batteri

erano lasciati crescere over night a 37°C in LB con Ampicillina (500 ug/ml)

e i plasmidi purificati utilizzando con Nucleobond Ax plasmid DNA

purification (MACHEREY- NAGER).

Elettroporazione delle giardia.

I trofozoiti sono stati elettroporati seguendo il protocollo di Yee e

Nash 1995 (Yee e Nash 1995).

A 300 ml contenente 107 cellule, venivano aggiunti 10 ml di DNA (o

H2O per controllo). L’elettroporazione avveniva alle seguenti condizioni:

Trasmittanza 350V

Capacitanza 1000 mF

Resistenza 720 Ohm

Le cellule cosi’ trattate venivano poste in ghiaccio per 15’ e trasferite

in 8 ml di medium fresco con puromicina alla concentrazione finale di

0.054 ug/ml.

Riconoscimento della FDP con anticorpi specifici mediante Western Blotting

L’esperimento è stato condotto al fine di verificare se la

proteina ricombinante FDP, espressa in E. coli, stimolasse il sistema

immunitario dell’ospite ed inoltre se gli anticorpi murini potessero


27

riconoscere la proteina di interesse anche in vivo, al fine di confermare

l’espressione di FDP nei protozoi.

Le cellule sono state staccate ponendo 20 minuti i tubi in ghiaccio e

sono state lavate 2 volte in PBS (135 mM, 1,3 mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4,

0,5 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifugando a 1800 rpm per 10 minuti a

temperatura ambiente. Sono state prelevate 106 cellule, centrifugate a 1800

rpm per 10 minuti. Il pellet è stato risospeso in 20 ml di Laemmli buffer

(4% SDS, 20% glicerolo, 0,125 M Tris HCl, 0,004% Blu di bromo fenolo,

10% b-mercaptoetanolo) e posto in termoblock a 75°C per 15 minuti al fine

di denaturare completamente le proteine.

In seguito alla corsa elettroforetica, viene eseguito il Western

Blotting (Fig.6) come descritto in precedenza.

Risposta di Giardia allo stress ossidativo e nitrosativo

Il fine dell’esperimento era capire quale fosse il destino della

proteina in condizioni di stress ossidativo e nitrosativo.

Per eliminare l’ossigeno dal medium di coltura, vengono utilizzati

due enzimi:

D-GLUCOSIO OSSIDASI (GOD)

CATALASI (CAT)

I due enzimi svolgono una reazione accoppiata, D-Glucosio Ossidasi

metabolizza il glucosio rilasciando H2O2 che a sua volta viene consumato

dalla Catalasi.


28

Fig. 4 Rappresentazione schematica del sistema GOD/CAT

Inoltre per testare gli effetti dell’ NO sulla FDP, ho utilizzato una

molecola capace di rilasciare cronicamente NO nell’ambiente, il DETA

NONOate (Cayman).

Fig. 5 Formula del DETA NONOate.

Sono state allestite tre condizioni diverse. Ad 1 ml di sospensione

cellulare, contenente 5x106 cellule sono stati aggiunti:

• 6 µl di GOD 17 U/ml (Sigma) e 6 µl di CAT 130 U/ml (Sigma).

• 250 mM

• 500 mM

Un uguale numero di cellule costituiva il mio controllo.


29

Le cellule sono state poste in incubatore a 37°C per 12 ore.

Successivamente sono state risospese tenendo le provette in ghiaccio per

20 minuti. Le cellule sono state quindi lavate in PBS e centrifugate per 10

min a 1800 rpm a temperatura ambiente. I pellet di cellule, a cui vengono

aggiunti 15 µl di Laemmli Buffer, sono stati posti successivamente in

termoblock a 75°C per 15 minuti al fine di denaturare completamente le

proteine.

I campioni sono stati caricati in un gel di poliacrilammide al 12%. In

seguito alla corsa elettroforetica, è stato eseguito il Western Blotting.

Espressione della proteina FDP cellule farmaco sensibili e farmaco resistenti

L’esperimento era volto a verificare se ci fossero differenze

nell’espressione della proteina in linee cellulari di Giardia resistenti e

sentibili al Metronidazolo.

A 5 ug di proteine totali, appartenenti linee cellulari C6, 106, 106-

21D10 (MzR), 713, 713 MzR, venivano aggiunti 3 ul di DTT , portato il

volume a 20 ul con simple buffer e bolliti a 100°C per 5’.

Dopo SDS-PAGE e blotting, la membrana veniva saturata e incubata

con l’anticorpo primario policlonali murino Anti-FDP (1/1000) e

successivamente incubata con l’anticorpo secondario HRP-goat serum anti-

mouse IgG (H+L) (Invitrogen) (1/5000).

Il filtro, lavato 3 volte in PBST 0.1% per 5’, sviluppato con ECL o

ECL plus (Amesham) e il segnale chemiolumiescente era esposto su Hyblot

CL Autoradiography Film.

L’intensita’ delle bande era quantificata mediante il programma

Quantità One (Bio-Rad).


30

Espressione della FDP durante il fenomeno di incistamento

E’ stata studiata l’espressione della proteina durante l’incistamento

mediante western blotting.

Sono stati raccolti campioni a tempi 12, 21 42 ore, a partire

dall’inizio del processo.

Le cellule sono state coltivate in medium di crescita per 28 ore e

successivamente trasferite in terreno di incistamento. Dopo 4, 12, 21 e 42

ore, le cellule era raccolte mediante centrifugazione a 2000 rpm per 10’ a

4°C.

Le cellule lavate due volte con PBS e le proteine totali erano

precipitate con TCA al 6%. Le proteine, previa centrifugazione a 10000 rpm

a 4°C per 7’, venivano risospese in simple buffer e quantificate con Low

Density Protein Assay (Pierce).

Il SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ha mostrato che i

trascritti di FDP sono upregolati durante l’incistamento. Il livello di

espressione è più alto a 21ore.

I risultati del western blotting con linea trasfettata C6FDPAU1 e

anticorpi anti-AU1 hanno mostrato che FDP è down regolata

nell’incistamento.

La più alta espressione si trova nei trofozoiti.


31

50

RISULTATI

Il primo esperimento è stato condotto al fine di verificare se la

proteina ricombinante FDP, espressa in E. coli, stimolasse il sistema

immunitario dell’ospite (topo) ed inoltre se gli anticorpi murini potessero

riconoscere la proteina di interesse anche in vivo.

Fig. 6

Gli anticorpi murini sembrano riconoscere in maniera specifica una

proteina in G. intestinalis.

Si puo’ osservare che nelle linee 2 e 3, in cui sono state caricate

cellule di G. intestinalis a concentrazioni diverse, è presente un unica banda

di circa 50 KDa. Questa banda sembra avere lo stesso peso molecolare

della proteina ricombinate (K+) che ha il peso di 45 kDa. Questi risultati

indicano quindi che FDP è espressa dai trofozoiti di giardia in condizioni di

crescita normali.

Successivamente, indagini preliminari di caratterizzazione, hanno

permesso di verificare quale fosse il comportamento della FDP di G.

intestinalis in condizioni di stress ossidativo ed in assenza di O2.

37

50

1 2 3 4


32

Quando l’O2 viene eliminato dal medium di coltura mediante

l’aggiunta di D-glucosio ossidasi e catalasi, la banda di 45kDa scompare.

Al contrario, la presenza di NO nel medium non ha alcun effetto

sulla espressione della proteina.

Questi risultati sembrano indicare un preciso ruolo di FDP nel

controllo delle condizioni di ossidazione cellulari

Fig. 7

L’immunoflurescenza, effettuata con anticorpi policlonali murinici

anti-FDP, mostra la localizzazione cellulare della proteina.

Fig. 8 e 9. Immunofluorescenza di G. lamblia.

Dalle immagini si puo’ osservare la distribuzione citosolica della

proteina mentre, nell’immagine adiacente, si puo’ notare l’assenza della

CTR H2O2 500 µM

1 2 3 4 5 6 7

1 FDP ricombinante

2 Giardia CTL

3 Giardia CTL

4 Giardia + GOD/CAT

5 Giardia + GOD/CAT

6 Giardia + 250 µM DETANONoati

7 Giardia + 500 µM DETANONoati

50

37


33

proteina nelle cellule esposte ad alte concentrazioni di H202 confermando i

risultati già osservati mediante western blotting.

In collaborazione con l’Universita’ La Sapienza di Roma sono stati

effettuati ulteriori esperimenti in condizione di stress ossidativo, volti a

verificare modulazione nell’espressione della proteina che mostrava, da dati

biochimici ( Di Matteo et al 2008), attivita’ ossidativa.

I trofozoiti erano risospesi in buffer di PBS+Glucosio 30 mM con

H2O2. Brevi esposizioni a H2O2 modificavano l’espressione della proteina e,

a concentrazioni di maggiori di 100 uM di H2O2, l’espressione della proteina

mostrava livelli piu’ bassi rispetto al controllo. A concentrazioni maggiori si

osservava fino alla scomparsa della banda al peso molecolare atteso.

Una preincubazione delle cellule con inibitore di proteasoma MG132

previene la degradazione della proteina indotta da H2O2. A concentrazione

di 500 uM di H2O2, la banda a corrispondente alla FDP era presente.

Espressione di FDP in linee cellulari Mz sensibili e Mz resistenti

Per studiare l’espressione se l’espressione della proteina fosse o

meno correlata con la sensibilita’ al farmaco, erano fatti esperimenti di

western blotting.

Le linee sensibili era costituite C6, 713 e 106 mentre le linee

resistenti corrispondenti erano 713-MzR e 106-21D10.

Le proteine cellulari venivano raccolte e quantificate come indicato

precedentemente. Per riconoscere la proteina nativa, venivano usati

anticorpi murini anti-FDP (1/1000).

L’espressione della proteina era normalizzata con espressione della

tubulina.


34

FDP

LC

Graf. 1 espressione di FDP in diverse linee di Giardia

Come si puo’ notare dal grafico l’espressione della FDP è maggiore

nelle linee 106-21D10 e 713-MzR. L’espressione, rispetto alle cellule C6 che

fungono da controllo, è maggiore di circa un 50% nelle cellule 106-21D10 è

circa il 180% in piu’. L’espressione sembra quindi essere maggiore nelle

linee resistenti al farmaco. Tale differenza è evidente nel grafico 2. Nel

grafico sono confrontate le linee sensibili e resistenti ad Mz.


35

La differenza è osservabile se si considerano le cellule MzS e le

corrispettive cellule MzR. La differenza maggiore è presente nelle cellule

713 che mostra, da dati in letteratura, una maggiore resistenza al farmaco.

Graf.2 Espressione di FDP in linee sensibili e resistenti a MZ

Trasformati Iperesprimenti FDP

Al fine di studiare possibili differenze nell’iperespressione di FDP,

venivano trasformate diverse linee di G. lamblia.

Erano utilizzate linee Mz sensibili (106, 713) ed Mz resistenti (106-

21D10, 713 MzR). Le cellule venivano elettroporate con il vettore pOCT-AU1

come descritto precedentemente.

Tutte le linee sono state trasfettate con successo. L’iperespressione

della FDP sembra essere compatibile con la vitalita’ cellulare.


36

Incistamento

E’ stata studiata l’espressione della proteina durante l’incistamento

mediante western blotting. Sono stati raccolti campioni a tempi 12, 21 42

ore, a partire dall’inizio del processo.

Le bande sono state evidenziate con anticorpi anti-AU1.

Il SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) ha mostrato che i

trascritti di FDP sono upregolati durante l’incistamento. Il livello di

espressione è più alto a 21ore come si puo’ osservare anche nella tabella.

Fig 10. Espressione della proteina FDP in diverse fasi della vita di G. lamblia


37

Fig 11. Espressione di FPD in una popolazione di G. lamblia

I risultati del western blotting con linea trasfettata C6FDPAU1 e

anticorpi anti-AU1 hanno mostrato che FDP è downregolata

nell’incistamento.

La più alta espressione si trova nei trofozoiti.

T kDa

LC

21 12 42

50 37

20

25

FDP


38

Fig. 12. Western blotting di Giardia a 12, 21 e 42 ore dall’incistamento.

Immunofluorescenza in cellule iperesprimenti

Al fine di confermare la localizzazione cellulare della proteina, sono

state utilizzate linee trasfettate con FDPAU1 e AU1 (controllo negativo).

Fig 13 e 14. Immunofluorescenza di Giardia.

La FDP mostra localizzazione citosolica ed ha una distribuzione

uniformente. Non sembra ci siano differenze tra le diverse linee cellulari

che mostrano tutte un segnale molto forte.

La distribuzione è la medesima anche nei trofozoiti incistanti. A 21 e

42 ore dall’incistamento è talvolta osservabile una piccola popolazione

cellulare (talvolta in cui FDP sembra associato alla membrana delle ESV.

Queste vescicole si formano solo durante l’incistamento ed al loro interno si

trovano proteine (tra cui CW1 e CW2, proteine della parete della cisti). Non

sono state trovate cisti in cui FDP fosse espressa.


39

DISCUSSIONE

Le flavoproteine a doppio ferro (FDP) sono espresse in procarioti

anaerobi, stretti o facoltativi e in alcuni protozoi parassiti microaerofili.

Questa proteina sembra essere sintetizzata in risposta a stress ossidativi e

nitrosativi. Le FDP sono state recentemente identificate in un ristretto

gruppo di protozoi, tra questi, Giardia intestinalis, l’agente eziologico della

giardiasi, una malattia infettiva umana.

L’FDP di G. intestinalis, a partire da un gene sintetico è stata

espressa, purificata, e caratterizzata utilizzando tecniche come: raggi X,

cristallografia e spettroscopia.

Esperimenti preliminari da me effettuati avevano il fine di verificare

se la proteina ricombinante, espressa in E. coli, stimolasse il sistema

immunitario dell’ospite e se gli anticorpi così ottenuti, potessero

riconoscere la proteina anche in vivo, dimostrandone l’espressione nei

trofozoiti.

Si puo’ osservare dalla foto 6, la presenza di un unica banda per

line al peso molecolare atteso. La proteina ricombinate stimola il sistema

immunitario del topo e sembra comportarsi come la proteina nativa di G.

intestinalis.

Il siero iperimmune di topo, ottenuto dopo stimolazione con FDP

ricombinate, è in grado di riconoscere la proteina nativa espressa dal

protozoo.

Da esperimenti di immunofluorescenza si puo’ osservare che la FDP

in giardia ha una distribuzione citosolica uniforme.

Indagini preliminari sulla proteina, hanno mostrato che FDP ha

attivita’ ossidatati a nitrosativa. Per investigare in tal senso i trofozoiti sono


40

stati esposti a diverse concentrazioni differenti di NO, e in presenza o

assenza di ossigeno.

Differenti concentrazioni di NO non alterano l’espressione della

proteina.

Se viene rimosso l’ossigeno dal medium si puo’ osservare la

scomparsa della banda a 45KDa. Lo stress ossidativo, ma non quello

nitrosativo, elimina totalmente la reattività anticorpale. Questi risultati

sembrano indicare un ruolo nel controllo dello stato di ossidazione

cellulare.

L’esposizione delle cellule a H2O2 causa la scomparsa della proteina,

nel caso vengano usate concentrazioni maggiori di 100 uM. La scomparsa

della proteina potrebbe essere causata o da una rapida proteolisi oppure da

una secrezione nel surnatante. Fin ora non è stato possibile trovarla nel

surnatante, suggerendo che non È coinvolto un fenomeno legato alla

secrezione specifica di FDP. Tuttavia l’utilizzo di un inibitore di proteasi,

quale MG132, sembra impedire la scomparsa della proteina. Non è ancora

chiaro il meccanismo di protezione sia diretto (protezione dalla proteolisi) o

indiretto (blocco del meccanismo di secrezione della proteina). Ulteriori

studi sono in corso per chiarire il fenomeno.

Non è ancora noto il motivo per il quale G. lamblia colonizzi

preferenzialmente duodeno o digiuno, piuttosto che il colon (meno

aerobica), dove è presente la maggior parte della microflora batterica. I

trofozoiti di Giardia sono molto vulnerabili a H2O2, soprattutto perché

mancano sia catalasi e H2O2-reduttasi. Pertanto, si è tentati di sostenere

che la localizzazione peculiare di Giardia nel tratto prossimale dell’intestino

tenue sia legata al potere tampone redox più elevato di questo tratto

intestinale rispetto a quello intestino crasso (Fig. 6); L’ipotesi sul perchè

questo parassita colonizzi preferenzialmente la parte prossimale

dell’intestino è perché qui vi è una maggiore capacità di tampone redox e

quindi una minore propensione allo stress ossidativo rispetto al colon.

Dati di immunoflurescenza mostrano che la localizzazione della

proteina è citosolica. E’ possibile osservarla sia nei trofozoiti in fase


41

vegetativa ma anche in trofozoiti incitanti. A 12 ore dall’incistamento è

stata talvolta osservabile un’aggregazione di FDP nel citosol invece di una

distribuzione uniforme. Tuttavia questo potrebbe non essere significativo.

FDP non è presente nelle cisti tuttavia qualche volta è stata osservabile un

aggregazione della proteina alle pareti della cisti. A tempo 21 e 42 ore,

sembra che FDP non si trovi nelle ESV anche se sembrerebbe esservi

associata. Il forte segnale nel citosol non sembra pero’ chiarire

definitivamente l’esistenza di questa associazione.

L’utilizzo di anticorpi da noi prodotti suggerisce che la proteina era

piu’ abbondante in linee cellulari Mz-resistenti piuttosto che nelle linee

parentali sensibili al farmaco. Questo potrebbe suggerire una correlazione

tra livello di espressione della proteina e resistenza ad Mz. Per investigare

in questa direzione, ciascuna linea, sensibile e resistente ad Mz, era stata

trasformata con FDP-AU1 e selezionata con puromicina. Tutte le linee sono

stabili e vitali. Sono eseguiti western blotting ma non è stato possibile

apprezzare differenze utilizzando anticorpi anti-AU1. E’ possibile che il forte

segnale mascheri differenze tra le linee cellulari.

Il SAGE ha mostrato che i trascritti di FDP sono up-regolati durante

l’incistamento con la piu’ alta espressione a 21 ore. I risultati del western,

usando linee iperesprimenti FDP e utilizzando anticorpi anti-AU1, hanno

mostrato che FDP è down-regolata durante l’incistamento. La piu’ alta

espressione è nei trofozoiti della fase vegetativa. Tali risultati sono

confermati anche da esperimenti di immunofluorescenza.

E’ necessario condurre ulteriori esperimenti per determinare se la

iperespressione della proteina porti dei vantaggi alla cellula, quali una

maggiore resistenza al farmaco. Verificare se il knock-down di FDP possa

essere vitale ed avere effetti sulla resistenza al farmaco ed infine, effettuare

studi in vivo, in condizioni fisiologiche, per verificare o meno una maggiore

efficacia nella colonizzazione dell’intestino da parte delle diverse popolazioni

cellulari iperesprimenti.


42

Sequenza vettore AU1 TACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCAGCTGATCGGCGCCGGGATGGGGGT

CCTGGGGCAGATAGCCGTTGGAACGGACAGCGACTTCCGCATCGTCAAGCACGCCCGTCGAACCCGGAAAAGGTAA

ATATTCACTTCAGCCCTCACTCGAGGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCACCAGGTGCGCGGTCCTTCGGGCACCTC

GACGTCGGCGGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAAAAGGGGAGGTTGCGGGGCGCGGAGGTCTCCAGGAAGGC

AGGCACCCCGGCGCGCTCGGCCGCCTCCACTCCGGGGAGCACGACGGCGCTGCCCAGACCCTTGCCCTGGTGGTC

GGGCGAGACGCCGACGGTGGCCAGGAACCACGCGGGCTCCTTGGGCCGGTGCGGCGCCAGGAGGCCTTCCATCTG

TTGCTGCGCGGCCAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCTGCGCGGGCCGATCTCGGCGAACACCGCCCCCGCTTCG

ACGCTCTCCGGCGTGGTCCAGACCGCCACCGCGGCGCCGTCGTCCGCGACCCACACCTTGCCGATGTCGAGCCCG

ACGCGCGTGAGGAAGAGTTCTTGCAGCTCGGTGACCCGCTCGATGTGGCGGTCCGGGTCGACGGTGTGGCGCGTG

GCGGGGTAGTCGGCGAACGCGGCGGCGAGGTGCGTACGGCCCGGGGGACGTCGTCGCGGGTGGCGAGGCGCAC

CGTGGGCTTGTACTCGGTGCCCATGGATTTTAAAATCTGGGGCGCCTGTAATTAAAGGCGTTATTTGTGGTCAAGCTT

GATATCGAATTCGGGCCCGACACGTACCGCTACATCTAGACTCCTCAACAGAGAGTCAGAGTAAACGAATTTCTGCC

GGTCAGGTCGTCTTGGGGACGGGGGAGATGTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCC

AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTA

CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCT

TCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG

TTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCA

CGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCG

ACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGT

TGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGAT

TTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAA

AATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATAC

ATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATT

CAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGA

AAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG

AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTAT

TGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGA

AAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAAGCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA

CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCT

TGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAA

CAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGGGCGGA

TAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC

GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGC

AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCA

GACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTG

ATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATC

TTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTG

CCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTA

GTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA

GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCG

GTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAG

CGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAA


43

CAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGA

CTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACG

GTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACC

GCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAA

GAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGA

CTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT

GCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGAT


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