Stretta correlazione tra Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali

¾La conoscenza dei processi fisiologici che regolano la crescita e lo sviluppo della pianta consente un intervento Biotec mirato per la selezione e manipolazione di uno specifico carattere di interesse

Contributo della fisiologia vegetale

�Es: per la verifica in planta del ruolo svolto da specifiche componenti (mediante la produzione di piante transgeniche)

Contributo delle biotecnologie vegetali

Importanza della Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali nel

Miglioramento genetico delle piante coltivate

�per costituire varietà con migliorate caratteristiche e più ecocompatibili

(es. più produttive, qualitativamente superiori, più resistenti (quindi utilizzo di meno sostanze chimiche per il controllo dei patogeni)

Biotecnologia ¾L’uso di organismi o parti di essi

per la produzione di prodotti utili

La Biotecnologia ha origini molto antiche

Processi fermentativi di cibi e bevande

6000 a.C. i Sumeri e Babilonesi producevano birra

4000 a.C. -gli Egiziani producevano pane lievitato

-il vino era già conosciuto nei paesi del Vicino Oriente

-diverse specie di ‘muffe’ venivano usate per produrre formaggio

La capacità dei microrganismi di causare processi di fermentazione fu dimostrata da

Pasteur fra il 1857 e il 1876 e quindi fu possibile effettuare un controllo più

consapevole ed efficiente delle fermentazioni

Produzione biotecnologica di farmaci

-negli anni ’40, furono introdotte tecnologie per la coltura massiva di organismi microbici in condizioni sterili per la produzione di antibiotici (es. penicillina), vaccini, enzimi ecc.

Produzione biotecnologica di pesticidi

-es: produzione su larga scala del Bacillus thuringensis come insetticida contro la piralide del mais

L’agricoltura biologica usa prodotti Biotec?

Biotecnologie e Piante coltivate

Non c’è niente di “naturale” in quello che coltiviamo o alleviamo indipendentemente dagli OGM

Azienda agraria

Foresta amazzonica

Azienda agraria • Trattare con antiparassitari

• Concimare • Irrigare

Pomodoro coltivato

Pomodoro selvatico

(circa 1 cm )

Mais coltivato

Mais selvatico

Come si è arrivati a questo?

Attraverso la domesticazione e il miglioramento genetico

Domesticazione delle piante e animali

Cacciatore-raccoglitore Allevatore-agricoltore

10.000-13.000 a.c.

L’uomo primitivo – Professione:allevatore-agricoltore- cominciò a selezionare le piante che

più gli piacevano e presentavano delle caratteristiche utili alla loro raccolta

Esempio di domesticazione da parte dei nostri antenati primitivi

Spiga di grano selvatico matura

In condizioni naturali

Spiga di grano selvatico non matura

Uomo primitivo: Allevatore/agricoltore Oh, guarda una spiga che non disarticola! Che bello ho trovato un MUTANTE!!!

Ottimo: potremmo raccogliere 100 semi tutti insieme!

Esempio di domesticazione operato dai nostri antenati primitivi:

Spiga di grano matura che non disarticola

Spiga di grano matura disarticolata

Un chiaro esempio dell’azione

dell’uomo sulle piante selvatiche

Grano selvatico

Grano coltivato

Dopo una lunga fase in cui l’uomo ha operato come semplice selezionatore della variabilità naturale intorno al XVII-XVIII secolo ha iniziato a ‘combinare’ in modo controllato la variabilità.

Sono di questo periodo i numerosi incroci inter- e intra-specifici con lo scopo principale di studiare le funzioni del polline e ovulo (es: Josef Gottlieb Kolreuter nel 1760 produsse un ibrido tra la Nicotiana paniculata e N. rustica).

Dopo le scoperta da parte di Mendel delle leggi dell’ereditabilità è stato possibile effettuare un miglioramento genetico più consapevole e mirato

Le varietà ad elevata resa prodotte in seguito sono il risultato dell’applicazione delle conoscenze genetiche più avanzate di quel periodo, ovvero tramite:

gli incroci intra- ed inter-specifici

Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Triticale

Origine: incrocio tra il mandarino Avana ed il pompelmo Duncan ottenuto da F. Russo presso l'Istituto Sperimentale per l'agricoltura di Acireale, Italia

Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Mapo

28 febbraio 1953: la scoperta della doppia elica del DNA da parte di James Watson and Francis Crick

“credo di aver scoperto il segreto della vita“ (Crick, nell'Eagle Pub di Cambridge)

Questa scoperta determinò un radicale cambiamento anche nel settore del Miglioramento genetico vegetale, dove la continua ricerca di nuova variabilità da cui selezionare caratteri utili portò allo sviluppo delle tecniche di mutagenesi.

L’uomo da semplice selezionatore e successivamente ‘combinatore’ della variabilità naturale diventa l’artefice della produzione di nuova variabilità su cui operare per la selezione di caratteri utili

(anche se gli incroci inter-specifici avevano già rappresentato di fatto i primi tentativi di produrre nuova variabilità)

•Uso di radiazioni per causare mutazioni casuali

In agricoltura per sviluppare nuove varietà …………

Raggi X, g

Es: Cariossidi di frumento irradiate con raggi gamma

Raggi g

Progenie

genotipo selezionato Box 6

Box 7

Il grano duro Creso e' stato ottenuto da un incrocio tra una varieta' messicana, la Cymmit, e una italiana, la Cappelli, la quale e' stata precedentemente sottoposta a bombardamento con raggi X (è stato usato il mutante di Cappelli Cp B144).

In generale, circa 2000 varietà coltivate derivano da questo trattamento

Più recentemente, le conoscenze soprattutto sui fitormoni hanno portato allo

sviluppo di metodologie di Miglioramento genetico che utilizza colture cellulari

Da una singola cellula vegetale possiamo ottenere una pianta intera

• Colture cellulari • Variazione

Somaclonale • Colture aploidi • Semi Artificiali • Ibridi Interspecifici

– Embryo Rescue – Fusione dei

Protoplasti (ibridazione somatica)

• Micropropagazione

Esempio di varietà derivata da variazione somaclonale

Le tecniche del DNA ricombinante (ingegneria genetica) rappresentano

un ulteriore affinamento delle tecniche di manipolazione genetica per il

miglioramento genetico delle varietà coltivate.

•L’agricoltura non è nata in seguito ad un processo di selezione naturale ma è una ‘invenzione’ dell’uomo

•Le piante coltivate non sono il risultato della selezione naturale ma della selezione artificiale operata dall’uomo

•Le piante coltivate derivano da mutanti naturali sottoposti al processo di miglioramento genetico o da mutanti prodotti dall’uomo sulla base delle tecniche di miglioramento genetico

•Le tecniche del miglioramento genetico si basano sulle conoscenze biologiche

•Le tecniche del DNA ricombinate sono metodologie del miglioramento genetico. Esse si basano sulle più attuali conoscenze biologiche

Riassumendo…….

Produzione di piante transgeniche: Passaggi essenziali

� Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un plasmide)

� Preparazione di un costrutto per la trasformazione genetica

� Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale (Trasformazione genetica)

� Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di selezione)

� Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)

Produzione di piante transgeniche: caratteristiche essenziali di un costrutto genico

Promotore Transgene specifico Terminatore

“gene di interesse”

gDNA gDNA

Es. 1) CaMV 35S (343 bp) 2) Ubiquitina di mais (1992 bp)

Es. NOS

Metodi di trasformazione

¾Biologico (Agrobacterium): dicotiledoni

¾Fisico (Biolistico): Monocotiledoni

•Vettori virali: solo per trasformazioni transienti

•Elettroporazione

•Microiniezione •Fusione con liposomi

Valvola della pressione Disco con le particelle d’oro ricoperte di DNA

Piastra di arresto

Campione va qui

Linea per il vuoto Linea del gas

Metodo Fisico: trasformazione diretta

Bombardamento o metodo biolistico (microprojectile or particle bombardment). Questa tecnica si basa sull’uso di un bombardatore (“particle gun” or “gene gun”). Il costrutto viene precipitato su particelle d’oro che vengono ‘sparate’ nel tessuto vegetale. Nella amggior parte dei casi si osserva espressione transiente (il DNA non si integra nel genoma ma viene trascritto finchè non viene degradato). In una piccola percentuale di cellule il costrutto si integra nel DNA genomico e quindi si ha l’espressione stabile. Uno dei principali limiti di questa tecnica è che spesso si ha l’integrazione di copie multiple del transgene.

Disco di rottura

Camera del vuoto

Metodo biologico: Agrobacterium tumephaciens Possiede un megaplasmide in aggiunta al suo DNA cromosomico

Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-) responsabili di numerose malattie delle piante A. tumefaciens - crown gall disease – galla del colletto

rose grapevine

A. rhizogenes - hairy root disease- radici pelose Meno studiato ma molto simile all’ A. tumefaciens

A volte il tumore può essere molto esteso!

Agrobacterium: un ingegnere genetico naturale

Il trasferimento del T-DNA segue un preciso meccanismo con numerosi passaggi, alcuni dei quali sono stati chiariti

Agrobacterium e

Ingegneria Genetia vegetale

Osservazioni chiave

Il T-DNA è permanentemente incorporato nel genoma della cellula ospite

Nessuno dei geni codificati dal T-DNA sono necessari per questo; Soltanto i bordi del T-DNA e le funzioni vir sono necessari

Solo le due estremità – circa 25 basi ciascuna - sono necessarie per il trasferimento e l’integrazione del T-DNA

Bordo di sinistra, LB Bordo di destra, RB

Operativamente per la trasformazione sono necessari: • Il gene di interesse posto tra il LB e RB

• Geni Vir

Questi due componenti devono essere presenti nell’A. tumefaciens per poter trasferire il gene di interesse

LB

RB

vir

ori

A

B

G C

D

E

T-DNA

Plasmide Ti

Plasmide Ti

Gene di interesse

ori

Plasmide Ti

vir

ori

A

B

G C

D

E

Plasmide Ti helper

LB

RB

T-DNA

Gene di interesse

•Sistema del Vettore binario

•Sistema del Vettore binario

Fig. 15.6 Watson et al DNA ricombinante

Produzione di piante transgeniche: Passaggi essenziali

�Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un plasmide)

�Preparazione di un costrutto per la trasformazione genetica

�Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale (Trasformazione genetica)

�Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di selezione)

�Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)

Soltanto una piccola frazione delle cellule ospiti subisce la trasformazione

La necessità di usare i marcatori di selezione è dovuta al fatto che:

Capsula di Petri contenente terreno di coltura per la selezione (negativa) di piante trasformate (es. canamicina, erbicida)

Funzione del marcatore di selezione

Quindi, si usano condizioni di coltivazione in cui le cellule trasformate sopravvivono, mentre le cellule non trasformate muoino = pressione selettiva

Produzione di piante transgeniche: Passaggi essenziali

�Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un plasmide)

�Preparazione di un costrutto per la trasformazione genetica

�Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale (Trasformazione genetica)

�Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di selezione)

�Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)

Il rapporto auxina /citochinina

regola la morfogenesi nelle colture di tessuti

Rigenerazione

Piante e tessuti usati per la trasformazione

La scelta del tessuto dipende dalla specie

Alcuni tessuti che si sono riscontrati trasformabili in più piante sono:

•Embrioni immaturi •Dischi fogliari •Meristemi apicali

Il tessuto deve essere capace di generare callo (tessuto indifferenziato) da cui si potrà rigenerare la pianta intera

Es. I fiori di Arabidopsis possono essere semplicemente immersi in una soluzione contenente il costrutto genico (Floral dip transformation)

Metodo fisico Metodo biologico

http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html

Cosa è stato fatto... Approvate per la commercializzazione

negli USA: 12 specie di piante coltivate

Mais

Cotone Soia

colza

patata

Pomodoro

Barbabietola lino

riso zucchine

Papaya Cicoria

Sono stati modificati 6 caratteri

9Controllo nella produzione del polline

9Resistenza agli insetti (Bt) 9Resistenza agli erbicidi

9Resistenza ai virus 9Ritardo nella maturazione dei frutti

9Alterazione nel contenuto in olii

2010 – Aumento nel contenuto in amilopectina

Unico evento autorizzato in EU è il mais Bt MON810 (coltivato in Spagna)

Europa

Mais resistente alla piralide (Ostrinia nubilalis) tramite la proteina Bt

Resistenza agli insetti

Esempio di: •Unica pianta transgenica coltivata in Europa •Implementazione dell’espressione

Ciclo vitale della piralide: ciclo annuale

Ciclo vitale della piralide: danni della pianta

Infezioni secondarie su mais attaccata dalla piralide

Diffusione della piralide in Europa

Le piante di mais GM esprimono la proteina insetticida del Bacillus thuringensis

Isolamento del gene Bt

Preparazione del costrutto genico

Trasformazione genetica

Rigenerazione della pianta

Cultivar resistente alla piralide

Madalità di azione della proteina Bt

Maisgard (Monsanto)

Sezione del fusto di mais transgenico

per il gene Bt

Pianta di mais NON

transgenica

Maisgard (Monsanto)

9bromoxynil cotone

9sulfonil urea cotone, lino

9glufosinato barbabietola, colza, mais, soia 9glifosato barbabietola, mais, cotone, soia

Resistenza agli erbicidi (carattere GM più diffuso)

Eritrosio-4-fosfato fosfoenolpiruvato

3-deidrochinato

3-deidroshichimato

Corismato

Triptofano Fenilalanina Tirosina

EPSP

EPSP sintasi

acido scichimico 3-fosfato fosfoenolpiruvato

glifosato

Modalità d’azione delle piante di mais NK603 tolleranti al glifosato EPSPS: 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasi CTP: proteina di trasporto nel cloroplasto

Riso dorato – Ricco di provitamina A

Patata d’oro

AMFLORA

Patata autorizzata alla coltivazione nel 2010, produce solo amilopectina

1. La diffusione di caratteri GM alle specie affini selvatiche;

2. La diffusione della resistenza agli antibiotici nelle popolazioni selvatiche di microrganismi;

3. Diffusione del materiale GM sulle coltivazioni “biologiche”: es: attraverso le api (che renderebbe la produzione biologica impossibile con l’attuale normativa)

Principali preoccupazioni per ambiente e consumatori:

Limite 0.9%)

Scoperta Sviluppo del Prodotto Commercializzazione

I prodotti Biotech vengono Continuamente Controllati

USDA - U.S. Department of Agriculture Determina se è sicura da crescere

EPA - U.S. Environmental Protection Agency Determina se è sicura per l’ambiente

FDA - U.S. Food and Drug Administration Determina se è sicura come cibo

NIH-Natinal Institute of Healt Linee guida

Post Market

Trasformazione

Selezione della linea

Sviluppo della varietà

Produzione in campo Market Isolamento

del gene

Valutazione della pianta in serra e in

campo

Es. negli USA

Grazie a questi controlli non ci sono sul mercato i famosi mostri fragola-

pesce o pomodoro-pesce

Cosi come non è presente in commercio la soia GE allergenica

Le piante GM sono più pericolose delle altre piante?

No. Dagli studi pubblicati relativi alla sicurezza degli OGM (ca. 3.500) e dai dati ottenuti da una serie di studi finanziati dalla Comunità Europea durato 15 anni (70 milioni di €, 400 Centri di ricerca pubblici coinvolti) emerge che gli OGM non manifestano un comportamento diverso da quello delle colture tradizionali

Regolamenti sulla Etichettatura degli alimenti contenenti OGM

Stati Uniti: Concetto di alimenti OGM sostanzialmente equivalenti ai convenzionali. Se sostanzialmente equivalenti non c’e’ necessità di etichettamento

Europa: Alimenti contenenti >0.9% di OGM devono essere etichettati (49/2000) (solo per favorire la libera scelta del consumatore)

Controllo presenza OGM negli alimenti

Si utilizza la tecnologia della reazione a catena della DNA Polimerasi (PCR) che consente di rilevare la presenza di OGM anche a livelli inferiori allo 0.1%

Analisi OGM sugli alimenti

Estrazione del DNA Allestimento

della reazione

Analisi PCR Risultato

• Cibo più sano • Minore impatto ambientale • Minori costi di produzione

Conclusioni

Gli OGM offrono diversi potenziali benefici se utilizzati appropriatamente:

La valutazione deve essere sicuramente fatta caso per caso

Inoltre, si può sempre migliorare……….. Le piante cisgeniche: utilizzo della procedura di trasformazione genetica per l’inserimento di geni proveniente da piante sessualmente compatibili