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Rifiuti

71Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/2018

Placido Alfredo Lanza1,*, Carmelo Massimo Maida2, Laura Benanti3, Giuseppe Giliberto3, Salvatore Nicosia4

1 Università degli Studi di Palermo, Dip.to DICAM, Palermo .2 Università degli Studi di Palermo, Dip.to di Scienze per la Promozione della Salute e Materno Infantile.

3 Ingegnere libero professionista. 4 Università degli Studi di Palermo, Dip.to DICAM, Palermo.

Sommario – Nella sterilizzazione di rifiuti sanitari a ri-schio infettivo (RSP-I) le microonde (MO) sono propo-ste come alternativa al vapore. L’efficacia è verificatadeterminando la frazione sopravvissuta al processo, diuna certa popolazione di micro-organismi. Convenzio-nalmente, questa popolazione è introdotta nella massadei rifiuti sotto forma di fiale chiuse; queste costitui-scono un ambiente artificiale, sul quale l’agente steri-lizzante potrebbe a priori avere un’efficacia diversa ri-spetto alla massa direttamente esposta. In particolare,un agente fisico penetrante come le MO potrebbe steri-lizzare il contenuto di una fiala standard meglio di quan-to faccia il vapore. Questo indurrebbe a ridurre l’ener-gia somministrata sotto forma di MO rispetto a quellaconsiderata soddisfacente se trasferita col vapore; colrischio che questa dose in realtà per i rifiuti circostantila fiala non basti. La richiesta di validazione di appa-recchi di sterilizzazione a MO ha promosso la speri-mentazione di procedure di misura della carica batteri-ca che non abbiano barriere: cioè che contino le stessecellule traccianti, ma dopo la loro dispersione nell’in-tera massa all’inizio e il loro recupero alla fine. L’og-getto di questa sperimentazione è stato duplice: steriliz-zare in laboratorio con MO dei campioni sintetici diRSP-I, prima contaminati con spore, simulando il per-corso di un rifiuto fino alla sterilità finale perseguita; eprovare una tecnica di conta diretta della carica batteri-ca nella massa. Nelle diverse sessioni sono stati fatti va-riare il contenuto di umidità e l’energia somministratacon le MO; sono stati registrati gli andamenti della tem-peratura e sono state determinate le percentuali di inat-tivazione delle spore. Sono stati individuati alcuni aspet-ti critici della procedura, legati al materiale recuperodelle spore, alla pezzatura del rifiuto e alle caratteristi-che del forno; oltre al prevedibile inconveniente di do-ver maneggiare non delle fiale ma dei campioni di ri-fiuto, con dispendio di tempo-operatore.

Parole chiave: rifiuti infettivi, sterilizzazione, microonde, con-ta batterica, indicatori micro-biologici.

MICROWAVE STERILIZATION OFHEALTHCARE WASTE: DIRECT DE-TERMINATION OF PROCESS EFFI-CIENCY

Abstract – In the sterilization of those Health CareWaste that are marked as possibly infectious, mi-crowaves (MW) have long been proposed as an alter-native means to steam. The effectiveness of the oper-ation is assessed determining the fraction that has sur-vived to the sterilizing agent of a known starting pop-ulation of micro-organisms. Customarily, this popula-tion is introduced into the waste mass in the form ofone or more sealed vials. These make up an artificialenvironment which is completely under control; butonto it the sterilizing agent could a priori behave withhigher or lower effectiveness, compared with the loosemass which is directly exposed to it. As far as the tra-ditional steam sterilization has been the only processavailable, the meaning and representativeness of themicro-organisms’ response in sealed vials have notbeen questioned. In principle, however, a penetrativephysical sterilizing agent – as MWs are – could steril-ize a standard vial’s content better than would dosteam, which will just flow around it. If an operator isabout deciding whether to shift to MWs, this successinduces him to reduce the energy to feed to the wastemass, compared to that he deemed satisfactory before,when transferred by steam. Since the onset of MWsterilization technique, therefore, a need for validationin the most realistic conditions arose. This demanddrives researchers to work out techniques for bacteri-al count that have no barriers: that is, techniques thatcount the same tracing cells, but after they, 1) havebeen freely dispersed in the whole mass; 2) have un-dergone the same disinfecting actions as the surround-ing mass; 3) have been sampled from the mass at theend of the process. It is evident that – in order to gaincertainties in phase 2 – two severe uncertainties havebeen unwillingly introduced as phases 1 and 3. Indeed,the experimental campaign on which this paper reportswas aimed at simulating at lab scale the MW steriliza-tion of synthetic waste samples which had been con-taminated with known amounts of spores; to get quan-titative information on the efficiency and identify thepossibly critical steps of the whole procedure. In the 6different sessions that were run, the operational vari-ables were the waste moisture content (25% – 80%)and the amount of energy supplied as MW; residencetime 40 min instead was common to all tests. The tem-perature patterns were recorded, and at the end thewhole mass was washed to detach the spores for fol-lowing cultivation – count. In this way the critical fea-tures of the procedure were identified and ranked byseverity. It was foreseen that the procedure would be

STERILIZZAZIONE CON MICROONDE DI RIFIUTI SANITA-

RI: DETERMINAZIONE DIRETTA DELL’EFFICACIA DEL

PROCESSO

* Per contatti: Dip.to DICAM – Area Idraulica e Ambienta-le, Viale delle Scienze Ed. 8, 90128 Palermo. Tel.091.23896529; Fax 091.23860810, e-mail: placidoalfre-do.lanza@unipa.it

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Rifiuti time-consuming and would require handling of con-

siderable amounts of water and glassware. The exper-iments showed something more serious: actually, thephysiological solution alone – without any surfactantagent added – is unable to detach quantitatively thespores from the waste chips and the beaker walls. Ad-dition of a few drops of surfactants – as was done byOliveira et al. (2010) – is thus a technical detail whichis critical for the success of the whole treatment – anal-ysis chain. Of course we ought to have the certaintythat the surfactant chosen does not interfere with thegrowing medium and / or the bacterial viability in theplate cultivation following. The loss of viable spores inwashing the waste batches was calculated by us: 1)sampling and cultivating 1 ml wash solution comingfrom the control sample inoculated and not irradiated(called K+); and then, 2) comparing the result with theknown inoculum. Regrettably, less than 2% sporeswere found have been recovered. Under the hypothe-sis that the washing operation is replicable and is notaffected by the “irradiated / non irradiated” condition,the disinfection efficiency was then calculated on K+

number. About the results: the MW reduction of mi-crobial load in irradiated batches was just mediocre(98,2%), short of the prescribed 99,99%. The best re-sult was attained with a sample with 60% moisture andunit power input 272 W, corresponding to a unit inputof 350 W kg-1 of sample waste. In principle, MW irra-diation will heat up waste mass; and this in turn willcontribute to microbial inactivation. Water content hasa complex relationship with this phenomenon, sincethe driest batches interact too weakly, while moistestbatches do interact but their moisture use up most ofthe heat. In this experimental campaign, moisture de-creased by around 10-30%; but no reliable correlationis evident.

Keywords: healthcare waste, sterilization, microwave, bacte-rial count, micro-biological indicators.

Ricevuto il 8-3-2018; Correzioni richieste il 30-5-2018; Accettazio-ne finale il 24-7-2018

1. INTRODUZIONE

Nei processi che avvengono in matrici complessesi presenta regolarmente il dilemma fra i due estre-mi a) di misurare una sola sostanza, che è ritenutarappresentativa e facile da determinare, e b) di ten-tare di determinare le modificazioni dell’interamassa trattata.Lo schema seguente rappresenta l’idea, i cui esem-pi sono noti a tutti. La combinazione A-1 p.es. sirealizza nei “profili di salinità” nelle campagne dimisura in mare, o nella misura continua del poten-ziale redox nel trattamento acque; la situazione B-2descrive la strategia del controllo di un sistema fi-sico basato sul laboratorio, e così via.

Nello studio e nella “validazione” del processo didisinfezione la strategia corrente è quella C-1. Inestrema sintesi, nella massa di rifiuti che si vuolesterilizzare si sistemano una o più fiale chiuse checontengono degli indicatori biologici – solitamen-te delle spore batteriche, in quanto sono la formapiù resistente dei batteri – che hanno un compor-tamento noto e riproducibile; dalla frazione di que-sti che sopravvive si ricostruisce l’efficacia del-l’operazione sull’intera massa, sulla quale non siesegue nessuna misura. La Norma di riferimento,in ambito nazionale, per tali indicatori è la UNI ENISO 14161:2009.Nella disinfezione i tentativi con la strategia A o Bsono pochissimi; a conoscenza degli scriventi untentativo recente di utilizzare la strategia A-1 è sta-to portato a termine dal gruppo di ricerca di Oli-veira e coll. (Oliveira et al., 2010). Tale gruppocondusse una campagna di esperimenti di tratta-mento con MO di rifiuti sanitari pre-sterilizzati inautoclave e successivamente ri-contaminati conspore di Bacillus subtilis, utilizzando densità di po-tenza di 100, 150 e 200 W kg-1 e umidità del cam-pione del 40, 50 e 60%. All’origine di questa spe-rimentazione era il dubbio che l’ambiente fisico echimico delle fiale o delle strisce inducesse le spo-re a comportarsi in modo diverso da quelle dei bat-teri aderenti ai rifiuti.

1.1. Tecniche correnti per la sterilizzazione

La Norma UNI 10384-1(1994) definisce il proces-so di sterilizzazione come “Insieme delle fasi, com-presi eventuali pretrattamenti del carico ed il cari-camento e lo scarico della sterilizzatrice, idonee alraggiungimento della sterilità del carico”. Per ste-rilità la suddetta norma intende la “condizione diassenza di microorganismi, inclusi sporigeni e vi-rus, in grado di riprodursi”.In Italia, secondo la Farmacopea Ufficiale XII edi-zione (2008) e secondo il d.p.r. 254/2003 il tratta-mento di sterilizzazione deve essere in grado di as-sicurare un abbattimento della carica microbica ta-le da garantire un livello di sterilità, S.A.L. (Steri-lity Assurance Level), non inferiore a 10-6: ciò in-dica la probabilità di trovare non più di un organi-smo vivo su un milione nel materiale finale steri-lizzato.A livello internazionale, per la valutazione dell’ef-ficacia di sterilizzazione in ambito sanitario si fa ri-ferimento ai livelli proposti dallo STAATT III, Sta-te and Territorial Association on Alternative Treat-ment Technologies (2005). Il documento scaturito

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Rifiutidalla Conferenza del dicembre 2005, tenutasi a Or-

lando in Florida (USA), contiene delle raccoman-dazioni per la valutazione dell’efficacia dei tratta-menti di riduzione della carica batterica:• per le spore batteriche è richiesta una riduzione

media di 4 log10 e una riduzione minima di qua-lunque singolo campione testato di 2 log10;

• per le cellule vegetative di micobatteri è richie-sta una riduzione media di 6 log10 e una riduzio-ne minima di qualunque singolo campione testa-to di 3 log10.

Per la sterilizzazione dei RSP-I in ambito ospeda-liero – la situazione che qui interessa – la tecnicatradizionale, soddisfacente, largamente impiegataè il trattamento con calore umido, in particolare avapore saturo, in autoclave. In ambito europeo(Farmacopea Europea, 2016) è stabilito per questotipo di sterilizzazione che il tempo di residenza delrifiuto processato all’interno delle autoclavi sia di6-8 minuti alla temperatura di 134°C oppure di 15-20 minuti a 121°C.Tale metodo è collocato nei processi termici a bas-sa temperatura perché usa l’energia termica perl’inattivazione microbica ma non raggiunge le tem-perature necessarie per rompere i legami chimicidelle molecole (pirolisi). L’inattivazione in praticaè la degradazione dei componenti della membranae della parete cellulare e la denaturazione degli aci-di nucleici, degli enzimi e delle proteine, fino allamorte della cellula.Nel trattamento con MO il riscaldamento è gene-rato in modo volumetrico dall’interno del materia-le. Materiali diversi rispondono in maniera diver-sa alle microonde; in alcuni l’effetto può non limi-tarsi a far “vibrare” le molecole, ma essere più dra-stico. In certe condizioni cioè le MO possono rom-pere dei legami chimici instabili e così modificarela composizione dei materiali.Nelle applicazioni pratiche delle MO, per poter pre-vedere gli effetti sono fondamentali: a) la pre-omo-geneizzazione dei materiali, e b) una razionale pro-gettazione della camera (cavità risonante) in cui ilmateriale – che nel nostro caso è il rifiuto – è posi-zionato (nei processi discontinui); oppure è fattopassare (nei processi continui). Vedi Appleton et al.,2005; Veronesi et al., 2007; Zimmermann, 2017.

1.2. Tecnologia a microonde

Le microonde sono radiazioni elettromagnetiche(EM) con frequenze che ricadono nel campo 300MHz ÷ 300 GHz; a queste frequenze corrispondo-no lunghezze d’onda da 1 m a 1 mm; hanno la ca-

pacità di penetrare i materiali dielettrici producen-do effetti termici e non termici. I microrganismi as-sorbono l’energia delle microonde a livello di mo-lecole cellulari e naturalmente dell’acqua di costi-tuzione. La quantità di energia assorbita dipendedalla costante dielettrica e dalla conduttività elet-trica di queste cellule (Jancović et al., 2014).Diversi Ricercatori hanno avanzato l’ipotesi chenella disinfezione le microonde associno due mec-canismi di azione:• uno tradizionale, ossia le MO nelle sostanze umi-

de producono calore, fino a trasformare l’acquain vapore (effetto termico);

• uno loro caratteristico, ossia le MO trasferisconoenergia direttamente ai tessuti viventi, e questoeffetto può essere esaltato fino a danneggiare de-liberatamente le cellule (effetto non termico).

Sugli effetti delle microonde sulle spore di ceppibatterici scelti come riferimento sono stati effet-tuati numerosi studi. Alcuni risultati hanno corroborato l’idea che l’inat-tivazione delle spore sia prevalentemente legata alcalore indotto dalle microonde, mentre è margina-le il contributo degli effetti non termici (vedi p.es.Jeng et al., 1987; Banana et al., 2013). Gli esperi-menti condotti da Celandroni et al. (2004) concor-dano con questa conclusione. Questi Autori sotto-posero delle spore di B. subtilis a un campo EMappositamente generato in modo tale da poternemisurare esattamente la potenza, una preoccupa-zione che si ritrova nel lavoro di Veronesi (Vero-nesi et al., 2007). Celandroni e coll. dimostrarono che la perdita diacido dipicolinico provocata dal calore è molto piùgrave di quella provocata dalle MO. Le fotografieal microscopio elettronico confermarono che lacorteccia delle spore sottoposte al vapore era as-sottigliata e rilassata in misura quattro volte mag-giore di quelle sottoposte alle MO.L’ipotesi di inattivazione dei batteri per danno fi-sico è sostenuta sperimentalmente da Ojha e coll.(2016). Le fotografie fatte da questi Autori al mi-croscopio elettronico di spore di Clostridium diffi-cile sottoposte alle MO mostrano degli effetti “ma-croscopici” sulla parete cellulare che il solo riscal-damento con vapore non provoca. Le cellule ap-paiono direttamente danneggiate; nel citoplasmapossono esserci aree coagulate; talvolta nella mem-brana cellulare si sono aperti degli squarci.Questa possibilità di danneggiamento fisico-chi-mico era già stata dimostrata da un gruppo di Ri-cercatori (De Pomerai et al., 2003) che aveva con-dotto esperimenti in vitro con soluzioni acquose di

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Rifiuti siero bovino. In questi esperimenti le microonde

causarono un piccolo ma consistente effetto di ag-gregazione nelle proteine anche senza variazionimisurabili di temperatura. Infine, l’articolo di M. Bhattacharjee e J. Delsolpubblicato nel 2014 si distacca dai due filoni prin-cipali propendendo invece per un meccanismo diinattivazione chimico. Questo è stato da loro stu-diato coltivando una precisa specie Gram-negativae anaerobia facoltativa, lo Aggregatibacter actino-mycetemconcomitans.Le Autrici partirono dalla constatazione fatta dauna di loro nel 2009: che cioè il terreno di colturadello A. actinomycetemconcomitans ha un effettoinibitore sulle cellule allorquando nella fase di pre-parazione è stato portato all’ebollizione. Per que-sto effetto non fa differenza che siano state usateMO oppure vapore.Bhattacharjee e Delsol ne dedussero che il loro bat-terio indicatore era inattivato da una sostanza chi-mica che si era prodotta nel terreno di coltura. Essefecero l’ipotesi che si trattasse della famiglia di so-stanze (“Maillard reaction products”, MRP) prodot-te dalla cosiddetta Reazione di Maillard, che ha luo-go fra aminoacidi e zuccheri riducenti a temperatu-re sopra 140 °C.Bhattacharjee e Delsol sciolsero in acqua glucosioe lisina come precursori dei MRP, e irraggiarono lebeute con MO fino all’ebollizione e dopo ancoraper alcuni minuti, ripristinando il livello dell’ac-qua per compensare l’evaporazione. Le due Ricer-catrici provarono così che 1) le MO producevanoMRP a una velocità quadrupla dell’ebollizione supiastra scaldante, e 2) un terreno di coltura tratta-to in questo modo dava luogo a crescite di coloniemolto ridotte.Con lodevole scrupolo Bhattacharjee e Delsol nelloro articolo precisarono che E. Coli, usato comespecie di confronto, non sembrava soffrire di alcu-na inattivazione.Alla luce delle ricerche che sono state qui riassun-te, non meraviglia che il dibattito sul meccanismod’azione prevalente ai fini dell’inattivazione batte-rica sia ancora aperto.Dal punto di vista applicativo, i principali vantag-gi della tecnologia a MO sono:• facilmente applicabile dal personale ospedaliero;• adottando le giuste precauzioni, le emissioni so-

no ridotte al minimo;• la tecnologia è automatizzata e facile da usare,

anche se richiede la presenza di un operatore.Questo trattamento ha anche degli svantaggi tra iquali:

• i rifiuti solidi possono essere trattati solo se tri-turati;

• oggetti metallici eventualmente presenti nei ri-fiuti potrebbero generare degli hot spot per ef-fetto della riflessione delle microonde;

• non possono essere trattati i composti organicivolatili, i rifiuti provenienti da chemioterapia, ilmercurio, e i rifiuti radioattivi (WHO, 2014).

Vi sono inoltre pareri discordanti in merito alla con-venienza economica del trattamento a MO: alcuniconsiderano i suoi costi operativi inferiori a quellidelle altre tecnologie (Soares et al., 2013), mentre al-tri ritengono i costi di investimento e di manuten-zione relativamente alti soprattutto se il rifiuto ha unelevato contenuto di metalli (Appleton et al., 2005).

1.3. Procedure di verifica dell’efficacia del trat-tamento

Nello studio e nella “validazione” del processo didisinfezione la strategia corrente è quella definita“C-1” nell’introduzione, consistente in pratica nel-l’introdurre appositamente nell’intera massa uncampione confinato (in pratica, una fiala o una stri-scia) di una sola specie microbica, rappresentativae facile da “contare” dopo ordinarie operazioni diincubazione.I risultati si esprimono con la “frazione di inatti-vazione”, definita e calcolata con l’espressione:

(1)

dove N0r è il numero di micro-organismi recuperatidal campione di controllo (non irraggiato); N è il nu-mero di organismi recuperati dai campioni irradiati. Se si mette in atto la strategia di controllo A-1, ap-paiono evidenti tre fatti:1) il calcolo di X è concettualmente corretto solo

sotto l’ipotesi che il “lavaggio” del campione ab-bia esattamente la stessa efficacia sui rifiuti ir-raggiati e su quelli non irraggiati. Questa parteè variabile e imprevedibile;

2) di contro, nei rifiuti irraggiati il “lavaggio” delcampione non può staccare dalla superficie dei ri-fiuti quelle spore che siano state eventualmenteintrappolate in frammenti rammolliti dal calore;

3) a causa dell’inserimento della fase di lavaggionella sequenza di operazioni di verifica del “li-vello di inattivazione”, questa tecnica richiedepiù tempo, lavoro e materiali rispetto a quelladelle spore confinate in fiale.

Nel “lavaggio” del campione con la soluzione fi-siologica; restando sui campioni di controllo, non

r

r

N NXN

−=

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Rifiutiirraggiati; Oliveira e coll. ottennero “percentuali di

recupero” delle spore – inizialmente distribuite nel-la massa – comprese fra 72 e 93% (Oliveira et al.,2010). Questo introduce un fattore di incertezzanell’intera procedura.Riteniamo che queste percentuali di recupero rela-tivamente alte furono ottenute da Oliveira e coll.grazie all’aggiunta di un tensioattivo all’acqua dilavaggio: questi Autori infatti riferiscono di avereutilizzato “un detergente commerciale nelle pro-porzioni di quattro gocce a litro”. Nei nostri espe-rimenti si è rinunciato a questo ausilio; in parte perverificare quanto esso sia importante, e in parte perpotere escludere interferenze con la successiva col-tivazione delle spore su piastra in terreno di coltu-ra BHI (Brain Heart Infusion). Su questo punto sitornerà nella sezione “Discussione”.Il confronto di questa procedura con quella dellespore confinate fu pubblicato da due degli stessiAutori nel 2015 (de Oliveira e Pisani Jr., 2015). Al-cune ampolle contenenti le spore in mezzo di col-tura BHI furono collocate a tre altezze diverse dalfondo del contenitore con il campione da irradia-re: una sul fondo, una a mezza altezza (centro geo-metrico) e una sulla superficie. Le condizioni spe-rimentali erano le stesse del 2010.Questa campagna di esperimenti può essere cosìriassunta:• il livello di sterilizzazione “4 log10” non fu mai

raggiunto, né nelle ampolle né nella massa;• il livello migliore fu raggiunto nelle ampolle, e fu

99,8% (cioè circa “3 log10”); per le spore disper-se nella massa superò di poco il 70%;

• per le ampolle allungare il tempo di esposizioneda 20 a 40 min produce dei benefici solo margi-nali; per le spore disperse invece si raddoppial’efficacia;

• lo stesso discorso vale per la potenza applicata:per le ampolle la densità di potenza 100 W kg-1

è già sufficiente; per le spore disperse passandoda 100 a 200 si raddoppia l’efficacia.

Gli Autori usarono con successo i risultati per ca-librare un modello cinetico di inattivazione del 1°ordine. Fatto questo, estrapolando i risultati essicalcolarono che per le spore sospese dentro am-polle il livello di sterilizzazione “4 log10” sarebbestato effettivamente raggiunto in 36-37 minuti; conle spore disperse invece sarebbero stati necessaritempi compresi tra 260 e ben 780 minuti.Da questi risultati è evidente che lo stato fisico delmezzo in cui sono disperse le spore del bioindica-tore influenza fortemente il grado di disinfezioneraggiunto, a parità di condizioni nell’autoclave.

Poiché le spore disperse in un mezzo liquido sonorisultate più facilmente inattivabili dalle microon-de rispetto al mezzo solido, si deve concludere chei buoni livelli di sterilizzazione calcolati dall’inat-tivazione nelle fiale non si ritrovano se si vuole ap-plicarli all’intera massa.In questa ricerca si è voluto provare a riprodurrequegli esperimenti con un campione sintetico rap-presentativo di un rifiuto ospedaliero, utilizzando –come specie indicatrici – delle spore batteriche di-stribuite nell’intera massa, e come agente di disin-fezione le microonde.Gli esperimenti di disinfezione sono stati con-dotti con lo scopo di identificare i passaggi criti-ci ai fini della riproducibilità dell’intero proces-so e potere quindi intraprendere un percorso divalidazione che ponga questo metodo sullo stes-so piano di quello standard attuale. Obiettivo spe-cifico della ricerca è stato, dunque, quello di va-lutare il livello di sterilizzazione raggiunto daicampioni.L’utilizzo di spore inoculate in modo distribuito nelcampione di rifiuto, appositamente preparato, è unmodo di simulare la presenza di organismi patoge-ni nei rifiuti infettivi che aderisce meglio alla real-tà, rispetto alla modalità di utilizzare ampolle/fia-le di coltura posizionate in diversi punti nel cam-pione.L’utilizzo delle microonde nel campo sanitariorisale agli anni ’50 per le applicazioni terapeuti-che (Guy, 1984); l’utilizzo specifico nel tratta-mento di rifiuti sanitari è degli anni ’90. Ad es. èdel 1975 un brevetto statunitense di un apparec-chio per la sterilizzazione con MO di fiale con-tenenti liquidi (Murayama et al., 1975). Una ri-presa dell’interesse indirizzata ai rifiuti è dimo-strata circa vent’anni dopo dal deposito di un bre-vetto su un metodo per processare rifiuti infetti-vi con MO (Brent, 1992) e da quello sull’usocombinato delle MO e del vapore sotto pressio-ne (Drake, 1993).In effetti diverse apparecchiature in piena scala pre-senti oggi in commercio si basano sull’azione com-binata di MO e vapore saturo sotto pressione.Per raggiungere alte efficienze del trattamento so-no necessari sia la pre-triturazione che il condizio-namento con vapore: la prima perché riduce la tes-situra del rifiuto e migliora la sua esposizione; il se-condo perché favorisce l’effetto termico.Alcune ricerche dimostrano che il pre-miscela-mento/triturazione dei RSP-I riduce i tempi di trat-tamento richiesti nella sterilizzazione a vapore(Maamari et al., 2016).

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Rifiuti L’effetto “termico” sembra prevalere (Vela e Wu,

1979; Bryant et al., 2007) su quello “non termico”(Jancović et al., 2014) cioè di azione diretta delleMO in particolare sulle pareti cellulari (Woo et al.,2000). L’effetto delle MO sulle strutture cellularidifferisce però da quello causato da un riscalda-mento con mezzi tradizionali (Celandroni et al.,2004) ed inoltre l’uso combinato di MO e vaporesaturo sotto pressione sembra instaurare un mec-canismo di trasporto di massa che genera una di-namica particolare tale da favorire l’azione steri-lizzante (Drake, 1993).

2. MATERIALI E METODI

2.1. Esperimenti a scala di laboratorio

Nell’ambito universitario al Dipartimento di Inge-gneria Civile, Ambientale, Aerospaziale, dei Ma-teriali dell’Università degli Studi di Palermo, incollaborazione con il Dipartimento Scienze per lapromozione della Salute e Materno Infantile, Scuo-la di Medicina e Chirurgia della stessa Università,è stata condotta una sperimentazione con i seguentiobiettivi:• realizzare, a scala di laboratorio, la sterilizzazio-

ne di RSP-I mediante il trattamento con micro-onde individuando gli aspetti critici dell’interaprocedura;

• simulare tutte le fasi del percorso di un rifiuto sa-nitario: dalla contaminazione alla sterilità finale;

• standardizzare i metodi di analisi, al fine di defi-nire un protocollo di laboratorio che permetta divalidare in modo riproducibile l’efficacia di taletrattamento.

Sono stati condotti, a questo scopo, numerosiesperimenti su dei campioni sintetici, riprodottiin laboratorio e rappresentativi di un rifiuto ospe-daliero, composti da frazione secca, frazione or-ganica e un contenuto di umidità variabile (ag-giungendo quantità note di soluzione fisiologicasterile).Al fine di assimilare tale campione a un rifiuto sa-nitario pericoloso a rischio infettivo, si è scelto dicontaminarlo appositamente con una quantità notadi spore del ceppo batterico Bacillus pumilusATCC 14884 – ceppo acquistato in forma liofiliz-zata – ritenute in ambito internazionale un buon in-dicatore biologico per l’inattivazione da radiazio-ni (STAATT, 2005) essendo caratterizzate da ele-vata resistenza ambientale. Nell’ambito di tale stu-dio, per ogni sessione di sperimentazione, sono sta-te riprodotte tre tipologie di campioni:

• Tesi T: campioni a contenuto di umidità noto,inoculati con una sospensione nota di spore e sot-toposti al trattamento nel forno a microonde;

• K+: campioni inoculati con spore ma non trattaticon microonde (controllo positivo), per la valu-tazione dell’efficienza di recupero delle spore;

• K-: campioni non inoculati e non trattati (con-trollo negativo), per verificare le condizioni disterilità dei campioni.

Dopo aver verificato le condizioni di sterilità delcampione prima dell’inoculo, e irradiato le tesi inun forno a microonde (trattamento in batch), è sta-ta calcolata l’efficienza di inattivazione microbica,sulla base del confronto tra la concentrazione fina-le e iniziale di colonie di spore presenti.La relazione matematica utilizzata per tale calcoloè la seguente:

(2)

dove:• Cf in: concentrazione di spore finale. In questo ca-

so si parla di spore residue, ossia di spore vitalirecuperate nonostante il trattamento con micro-onde. Esse sono recuperate tramite la proceduradi lavaggio della tesi in esame. Il valore Cf in si ri-cava come media a partire dalla lettura di alme-no due piastre, relative alla tesi, su cui si svilup-pano tali spore.

• Cin: concentrazione di spore iniziale. In questocaso si parla di spore recuperate in seguito al la-vaggio del campione inoculato ma non trattato(K+). Il valore Cin si ricava come media a partiredalla lettura di almeno due piastre su cui si svi-luppano tali spore.

I campioni, nel forno, sono stati irradiati dalle mi-croonde per 40 minuti al fine di rendere tale meto-do confrontabile in termini di tempo di trattamen-to, con quello tradizionale dell’autoclave con va-pore saturo. Tempi maggiori, infatti, non lo rende-rebbero alternativo a quest’ultimo; tempi minori,invece, non garantirebbero alti livelli di inattiva-zione microbica, come dimostrato da esperimentisvolti in passato (Insinga, 2014).Dunque è stata valutata l’efficienza di sterilizza-zione (E) mediante l’esecuzione di numerose pro-ve mantenendo costante il tempo di esposizione al-le microonde e variando, come parametri di pro-cesso, il contenuto di umidità delle tesi e la poten-za nominale del forno utilizzato.Per la determinazione della variazione di umiditàdei campioni, a seguito del trattamento con MO,sono stati preparati specifici campioni, ottenuti con

fin

in

CE

C= − ×

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il metodo della quartatura, con umidità 50, 60, 70e 80% che sono stati sottoposti alle stesse condi-zioni di irraggiamento delle Tesi.La variazione di umidità è stata calcolata con la se-guente formula:

(3)

2.1.1. Preparazione di campioni sterili di rifiuti ospe-dalieri

Sono stati riprodotti in laboratorio i campioni sin-tetici rappresentativi di un rifiuto ospedaliero, sul-la base della composizione merceologica ricavatada dati di letteratura (Fig. 1/a).I materiali utilizzati, rappresentativi di alcune del-le frazioni merceologiche, sono stati:• carta: coriandoli o ritagli di giornale;• tessile: lenzuolini monouso in TNT (tessuto non

tessuto) per i lettini degli ospedali;• plastica dura: bottiglie di plastica in polietilene

tereftalato (PET);• film di plastica: imballaggi di plastica dell’acqua

o sacchi per bidoni;• gomma: guarnizioni;• organico: scarti alimentari, in particolare bucce di

arance e mele.Si è deciso di escludere dalla composizione delcampione tipo la componente metallica poiché pre-sente in quantitativo trascurabile rispetto alle altre.In Figura 1/b sono mostrate le frazioni merceologi-che costituenti il campione riprodotto in laboratorio.Dopo aver triturato manualmente le varie frazionimerceologiche, è stata effettuata la caratterizzazionedel campione rappresentativo di rifiuto ospedaliero.

Sono state valutate densità apparente (kg m-3) eumidità (%) medie dei campioni da trattare. I va-lori ottenuti sono stati:• per la densità apparente Dapp = 49,2 kg m-3;• per l’umidità U = 11%.Per ricavare la massa totale di un campione di ri-fiuto, si è partiti fissando un valore di potenza ef-fettiva del forno a microonde pari a 68,34 W (cor-rispondente al primo livello di potenza nominale,ossia 272 W) e una densità di potenza pari a 350W kg-1.Tramite il rapporto delle due grandezze preceden-ti è stato ricavato un valore di massa totale pari aMtot = 195,22 g, da ripartire tra massa secca e umi-dità.Tale valore è stato mantenuto costante nei variesperimenti, mentre è stato fatto variare il conte-nuto di umidità del campione (parametro operati-vo) e di conseguenza la massa secca e organica.Per gli esperimenti sono state realizzate delle Te-si con differente contenuto di umidità U dal 25%al 80%, dei K- con U pari al 50% e dei K+ con Upari al 50% o uguale a quello delle Tesi. Le ses-sioni di esperimenti condotte sono state sei, indettaglio:• I à Pn = 272 W; U = 50, 60, 70%;• II à Pn = 272 W; U = 50, 60, 70%;• III à Pn = 272 W; U = 25, 80%;• IV à Pn = 528 W; U = 25, 50%;• V à Pn = 272 W; U = 60, 70%;• VI à Pn = 272; U = 50, 80%;dove Pn indica la potenza nominale del forno a mi-croonde utilizzata e U l’umidità dei campioni sot-toposti a irraggiamento. Le sessioni II, III, V e VIsono quelle che hanno dato risultati utili.

f i

i

U UU

U−

Δ = ×

Figura 1/a – Frazioni merceologiche

Figura 1/b – Frazioni merceologiche del campione ri-prodotto in laboratorio: a) carta; b) car-tone; c) tessile; d) plastica dura; e) film diplastica; f) gomma; g) vetro; h) organico

IdA

Rifiuti

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/201878

2.1.2. Preparazione di campioni contaminati artifi-cialmente

Nella Figura 2 è mostrato lo schema di produzio-ne delle spore partendo da una coltura pura di B.pumilus.La procedura di sporulazione ha previsto le fasi ri-portate in Figura 3.In tale procedimento lo shock termico finale con-sente l’attivazione delle spore.Per verificare l’avvenuta sporulazione è stata ado-perata la colorazione differenziale di Schaeffer –Fulton (Tortora et al., 2016). Questa tecnica permette di distinguere le spore, co-lorate in verde, dalle cellule vegetative (colorate inrosso).

La colorazione prevede l’utilizzo del Verde mala-chite (colorante principale) per la colorazione del-le spore e la Safranina (colorante secondario) perla colorazione delle cellule vegetative.Osservando il preparato al microscopio ottico coningrandimento di 1000x, mediante immersione inolio minerale, si è potuto verificare la presenza del-le spore, di forma rotondeggiante e colorate in ver-de, e dunque l’avvenuta sporulazione.Prodotta la sospensione e verificata l’avvenuta spo-rulazione, l’ultimo passo compiuto è stato la tito-lazione della sospensione, ossia la valutazione del-la concentrazione, espressa in CFU ml-1 (dove CFUindica Unità Formante Colonia), mediante quanti-ficazione su piastra (Fig. 4).

Figura 2 – Procedura microbiologica

Bacillus pumilus

Figura 3 – Procedura di sporulazione

Diluizioni seriali decimali,

semina su piastre (fino a 1012)

Incubazione a 37°C per 24 ore,

conta delle colonie

Calcolo Cinoculo

[CFU ml-1]

Figura 4 – Titolazione della sospensione di spore

IdA

Rifiuti

La concentrazione della sospensione di spore nel-l’inoculo è stata calcolata, tenendo conto del fatto-re di diluizione FD, nel seguente modo:

(4)

dove N è il numero di colonie contate su piastra(CFU ml-1).Le procedure seguite per le tesi, K+ e K- sono mo-strate in Figura 5 dove: le fasi contenute nel ri-quadro tratteggiato costituiscono il reale tratta-mento; i blocchi grigi le fasi/procedure per i con-trolli; i blocchi senza sfondo fasi/procedure noneseguite.Le frazioni secca e organica sono state ripartite,mediante singola pesatura delle frazioni merceolo-giche, in sacche autoclavabili in base al contenutodi umidità U e sono state pre-sterilizzate a 121°Cper 20 minuti in autoclave al fine di eliminare qua-lunque forma di contaminazione prima della sedu-ta di sperimentazione.La pre-sterilizzazione delle due frazioni è stata ef-fettuata in due momenti diversi. Quella della fra-zione secca è stata realizzata qualche giorno primadell’esperimento per permetterne l’essiccazione per4-5 giorni; quella della frazione organica, invece,il giorno stesso per evitare che una successiva es-siccazione, anche a temperatura ambiente, potessecomportare l’insorgere di muffe.L’essiccazione della frazione secca è stata realiz-zata in un incubatore a 37°C per la rimozione del-l’umidità conferitagli dal vapore saturo dell’auto-clave.

Nello schema precedente sono riportate le varie fa-si della procedura seguita per la valutazione del-l’efficienza di sterilizzazione (Fig. 6).

2.1.3. Calibrazione del forno

Il forno utilizzato per gli esperimenti è stato un FI-MAR, modello ME/1630 – EASYLINE, forno di ti-po “domestico” caratterizzato da un sistema di fun-zionamento rotawave (costituito da una ventola didistribuzione delle microonde rotante posta sul tetto),dalla potenza nominale (Pn) massima 1600 W, fre-quenza 2450 MHz e dimensioni della cavità del for-no (330 x 345 x 219 mm). Il forno è stato utilizzatoalla potenza nominale di 272 W per le prove di ste-rilizzazione, mentre per la calibrazione si è fatto usodi tutti e cinque i livelli di potenza selezionabili.La procedura di calibrazione è servita a calcolarela potenza effettiva (Pe), ossia quella realmente as-

inoculo DC N F= ⋅

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/2018 79

Cfin

Cin

Figura 5 – Procedure seguite per Tesi, K+ e K-

Figura 6 – Procedura seguita per il calcolo dell’effi-cienza di sterilizzazione

IdA

Rifiuti

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/201880

sorbita dal campione durante il periodo di perma-nenza all’interno del forno. Essa è dipendente daiparametri relativi al forno e al campione di sostan-za utilizzata e dalla geometria del contenitore(Houšová e Hoke, 2002).Le prove di calibrazione sono state condotte uti-lizzando un becher in vetro pyrex di capacità 2 li-tri, un campione di acqua distillata di 1 litro e untermometro a mercurio, e variando il tempo diesposizione alle microonde e le potenze nominali.Sono stati scelti due tempi: t = 120 s (IMPI, 1991)e t = 240 s.Per ciascuna prova è stato calcolato il valore di po-tenza effettiva utilizzando l’espressione:

(5)

Dove:• Pe è la potenza effettiva (ossia quella assorbita

dal campione d’acqua) [W];• Ma è massa dell’acqua [kg];• cp,a è il calore specifico dell’acqua [kJ kg-1·°C-1];• ΔT è la differenza di temperatura dell’acqua pri-

ma e dopo il riscaldamento [°C];• t è il tempo di esposizione alle microonde [s].Nell’equazione 5 si è trascurato il contributo datodal vetro pyrex (vetro borosilicato).Lo standard IEC 705 (1988), il più diffuso in Eu-ropa, stabilisce, invece, di fissare un determinatoaumento di temperatura e misurare il tempo perconseguirlo. Per ragioni pratiche è stato scelto diutilizzare lo standard americano come sopra de-scritto.In Figura 7 è mostrato l’andamento della potenzaeffettiva in funzione di quella nominale per t =120s, quello relativo a t = 240 s è sovrapponibile adesso.

2.1.4. Trattamento di sterilizzazione con microonde econtrolli

Successivamente è stato preparato il materiale: so-no stati sterilizzati becher da 2 e 3 litri ed è stataprodotta e sterilizzata una soluzione fisiologica (SF)allo 0,9% ossia una soluzione salina contenente clo-ruro di sodio (NaCl) allo 0,9% in acqua distillata.Essa, nell’ambito di tale studio ha costituito l’umi-dità di ogni campione ed è stata utilizzata nella fa-se di lavaggio per il recupero delle spore residue,vitali nonostante il trattamento.Le procedure microbiologiche seguite per le Tesi,i K+ e i K- sono schematizzate in Figura 8 (a pagi-na seguente): in alto per il campione inoculato e ir-radiato (Tesi); al centro per il campione inoculatoe non irradiato (K+); in basso per il campione noninoculato e non irradiato (K-).Successivamente è stato effettuato il lavaggio delcampione per il recupero delle spore.È stato necessario, innanzitutto, trasferire il cam-pione in un becher da 3 l. Il volume limitato delbecher utilizzato per l’inoculo e il trattamento del-la tesi, infatti, non è adatto anche al lavaggio.Il lavaggio del campione è stato realizzato in con-dizioni sterili, all’interno di una cabina biologi-ca di classe II, con agitazione manuale medianteuna pipetta sterile da 10 ml per 20 minuti, de-cantazione per 10 minuti e successiva rapida agi-tazione per qualche minuto, al fine di far trasfe-rire il più possibile le spore dal rifiuto alla SF dilavaggio.Dai becher contenenti le Tesi e i K+ sono stati co-sì prelevati sterilmente 100 µl della sospensionecontenente le spore residue mediante una micropi-petta, previa agitazione, e sono state effettuate del-le diluizioni seriali in apposite provette da 15 ml ditipo Falcon.

a p ae

M c TP

t⋅ ⋅Δ

= ×

y = 0,47x - 24,401R² = 0,9741

Figura 7 – Potenza nominale (Pn) e potenza effettiva (Pe) per t=120s

IdA

Rifiuti

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/2018 81

Campione contaminato

Campione contaminato

Campione contaminato

Figura 8 – Procedure microbiologiche. In alto: procedura per la Tesi (campione inoculato e irradiato). Al cen-tro: proced. per il K+ (camp. di controllo, inoculato e non irradiato). In basso: proced. per il K-

(camp. di controllo, non inoculato e non irradiato)

IdA

Rifiuti

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/201882

Si è deciso di diluire la sospensione fino a 10-6.Ottenute le soluzioni diluite, 100 µl sono stati ino-culati su piastre di Petri contenenti agar Mueller-Hinton (MH) ottenendone un’ulteriore diluizioneseriale in base 10.Le piastre relative alle diluizioni 10-2, 10-3,10-4, 10-5,10-6, 10-7 sono state incubate in un termostato a 37°Cper 24 ore per permettere lo sviluppo delle colonie.Dai becher, contenenti i K-, invece sono stati pre-levati 100 µl della sospensione e seminati diretta-mente su piastra, omettendo il passaggio delle di-luizioni seriali. Anche tale piastra è stata posta aincubazione in un termostato a 37°C per 24 ore. Dopo l’incubazione è stata effettuata la lettura del-le piastre relative alle Tesi, ai K+ e K-.L’assenza di sviluppo batterico nel K- ha dimostratoassenza di contaminazione nei materiali utilizzati.Successivamente si è passati alla lettura delle altrepiastre mediante la conta delle colonie in quelleche ne presentavano un numero facilmente conta-bile (Fig. 9).

Dopo la conta delle colonie è stata calcolata, perciascuna coppia (Tesi e K+), il valore della con-centrazione di spore recuperate CR [CFU ml-1], me-diante la seguente relazione che tiene conto del-l’ulteriore diluizione ottenuta con i 2 l, ossia 2·103

ml, di SF durante la fase di lavaggio.

(6)

La concentrazione CR della formula 6 corrisponde,quindi, a Cfin per la Tesi e a Cin per il K+.Tutti i campioni sono stati seminati in doppio e laconta delle colonie è stata effettuata calcolando il va-lore medio della lettura delle due piastre. Per ciascu-na tesi è stata, così, valutata l’efficienza di inattiva-zione microbica E [%], indicativa dell’efficacia deltrattamento di sterilizzazione tramite la formula 2.È importante sottolineare che il confronto fra con-centrazione iniziale e finale è in realtà effettuatonon usando Cinoculo, bensì il valore di concentrazio-ne di spore K+ (Cin), per tenere conto della perditadi spore ottenuta durante la fase di lavaggio.Naturalmente il lavaggio è stato effettuato in ma-niera identica nelle due procedure al fine di avereuna situazione di conformità. Se il lavaggio fosseefficace al 100%, si otterrebbe una Cin pari a quel-la dell’inoculo.

3. RISULTATI

Di seguito si riportano nella Figura 10 gli anda-menti della temperatura finale e della variazione ditemperatura del campione in funzione dell’umidi-tà crescente, misurate durante le sessioni II, III e V,VI. Le temperature iniziali, rispettivamente, si at-testano circa sui 28 °C e 30 °C.Nel caso delle sessioni di esperimenti II e III il con-trollo positivo K+ (campione inoculato ma non trat-

R DC N F= ⋅ ⋅ ⋅

Figura 10 – Andamento di Tf e ΔT in funzione di U

Figura 9 – Piastre relative alla Tesi (in alto) e al K+

(in basso) utilizzate per la conta delle co-lonie in uno degli esperimenti

IdA

Rifiuti

tato) è stato effettuato con riferimento esclusivo alcampione di umidità pari al 50% in peso. Nel cor-so della sperimentazione ci si è resi conto dell’op-portunità di confrontare le concentrazioni delle te-si con quelle dei controlli positivi eseguiti con lamedesima umidità per ottenere dei risultati ancorpiù attendibili.Nella Figura 11 si riportano i risultati degli esperi-menti in funzione dell’umidità in termini di concen-trazione di spore vitali residue (CFU ml-1) per le te-si e per i corrispondenti campioni non irradiati (K+),asse delle ordinate destro, e l’andamento dell’effi-cienza di sterilizzazione, asse delle ordinate sinistro.Come mostrano i grafici riassuntivi degli esperi-menti della sessione V e VI, le concentrazioni cosìriscontrate nei K+ dei campioni a differente umidi-tà si attestano sul medesimo ordine di grandezza.Il grafico in Figura 12 mostra i valori del contenu-to d’acqua finale del campione nonché la variazio-

ne, espressa in percentuale di tale parametro, cal-colate con l’equazione 3, rispetto ai quattro valoridi umidità iniziali considerati.

4. DISCUSSIONE

In totale sono state effettuate sei sessioni di espe-rimenti (numerati come I – VI). In termini di ridu-zione della carica microbica per effetto delle mi-croonde, i risultati sono stati interessanti ma lonta-ni dall’efficienza della tradizionale autoclave, e in-feriori fra l’altro al limite prescritto dallo STAATT(cioè 99,99%) (Benanti, 2016). Il massimo valoreè stato 98,2%, ottenuto con un campione al 60% diumidità.Nello sviluppo degli esperimenti si è deciso dimantenere costante il tempo di esposizione – pre-cisamente 40 minuti – in quanto tale valore corri-sponde alla durata di un ciclo di autoclave. Ogni

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/2018 83

Figura 11 – Efficienza del trattamento (asse sx) e concentrazione di spore per i campioni irradiati (Tesi) e per ilcontrollo positivo (K+) (asse dx) in funzione dell’umidità

0,50 0,

60 0,70 0,

80

0,33

0,53

0,46

0,69

0,34

0,11

0,35

0,14

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

Umidità

Campioni

Ui Uf - U %

Figura 12 – Umidità finale e variazione di umidità nel campione, per 4 valori di umidità iniziale

IdA

Rifiuti esperimento è stato condotto per cinque differenti

livelli di umidità del campione (dal 25% all’80%);ma di queste, tutte le prove con l’umidità minimanon sono risultate attendibili.Per calcolare l’efficienza del trattamento con MOper i singoli campioni è stata adoperata la formu-la 2. Come mostrato nel grafico di Figura 11, nel-le sessioni di sperimentazione con umidità del 50-80% i valori dell’efficienza sono stati 71,4-98,2%,che non si possono certo definire alti. Riteniamoche gli errori di varia natura associati alle opera-zioni di trasferimento e lavaggio del campione –caratteristiche della procedura di determinazionediretta della carica microbica – non permettano diarrivare a risultati più precisi.La tecnica di determinazione diretta si compone in-fatti di tanti passaggi, dei quali trasferimento e la-vaggio costituiscono i più critici. Questi sono statida noi eseguiti in un becher diverso (e più grande)da quello utilizzato per la contaminazione e la ste-rilizzazione del campione; il travaso però ha com-portato una grave perdita di spore rispetto all’ino-culo, addirittura di due ordini di grandezza, in ter-mini percentuali il recupero calcolato è risultato sot-to il 2%. Evidentemente una consistente parte del-le spore rimane adesa alla superficie del campioneo anche alle pareti del contenitore, e va riconosciu-to che l’aggiunta di tensioattivi alla SF usata per illavaggio – come fu fatto negli esperimenti descrit-ti in Oliveira et al. (2010) – è un particolare tecni-co decisivo per il successo del recupero.Le perdite di spore nel recupero sono state da noicalcolate confrontando il numero di spore contatenel campione di controllo inoculato e non irradia-to (chiamato K+) con quello dell’inoculo di par-tenza, prendendo e coltivando il volume di 1 ml.Fatta l’ipotesi che l’operazione di lavaggio delcampione di rifiuto 1) sia ripetibile e 2) non risen-ta della condizione “irradiato / non irradiato”, an-che l’efficienza è stata calcolata sul numero K+,non sul numero di spore costituenti l’inoculo.Quindi i valori di mortalità di cellule (e dunque diefficienza di sterilizzazione) 71,4-98,2%, detti so-pra, restano validi.Sul livello di sterilità raggiunto influisce – a pari-tà di tempo di esposizione – l’aumento di tempe-ratura rispetto a quella ambiente. Questa è l’effet-to dell’interazione delle MO con le molecole pola-ri presenti nel campione, principalmente molecoled’acqua sotto forma di umidità.Per ottenere una relazione fra il riscaldamento oc-corso e l’umidità del campione sono state misurate letemperature dei campioni di rifiuto prima e dopo il

trattamento a microonde, per data potenza applicata(Pn = 272 W) e per dato tempo di esposizione (40minuti). Tuttavia tra le sessioni II e III e quelle V eVI si riscontrano due andamenti diversi (Fig. 10).Tale incongruenza potrebbe essere conseguenzadella precauzione di non misurare la temperatura inun forno a MO con un termometro che abbia unasonda come elemento sensibile: come è noto, in-fatti, i metalli in questi forni si comportano comeconduttori in corto circuito.Poiché non si disponeva di una micro-camera araggi infrarossi da collocare nel forno, il becher ap-pena estratto era messo sotto una cappa a flusso la-minare, e la sonda era immediatamente immersa alcentro del volume di campione, facendo attenzio-ne che fosse a contatto con il rifiuto con la sua umi-dità residua. Questo percorso non è privo di ritar-di, e comunque la priorità è stata l’evitare possibi-li contaminazioni del campione.In merito alla variazione di umidità del campionedi rifiuto durante l’irraggiamento (al variare diquella iniziale) i risultati degli esperimenti fatti so-no di diminuzione del 10-30% circa, ma non for-niscono una correlazione attendibile. Non è possi-bile cioè affermare se un campione inizialmentepiù umido perda più o meno acqua di uno menoumido (Fig. 12) (Giliberto, 2016).

5. CONCLUSIONI

L’impiego delle microonde per la sterilizzazionedei “rifiuti sanitari pericolosi a rischio infettivo” èproposta da alcuni anni come una valida alternati-va ai metodi di trattamento tradizionali; in partico-lare a quello col vapore.Poiché si ritiene che le MO esplichino sui micro-organismi un’azione supplementare rispetto al va-pore – azione consistente nel danneggiare diretta-mente le cellule – è comprensibile che Ricercatoried Enti di controllo lavorino per accertare quantosia importante questa parte del processo steriliz-zante complessivo.Nel tentativo di semplificare il quadro, approssima-tivamente dall’anno 2000 in poi in diversi Labora-tori nel mondo si è provato a contaminare dei cam-pioni artificiali usando spore disperse direttamentenel campione, invece che contenute in ampolle.In questo modo si realizza teoricamente una situa-zione che rappresenta meglio quella reale; negli ar-ticoli pubblicati tuttavia si legge sempre di critici-tà inerenti la procedura di recupero delle spore.La nostra campagna di esperimenti ha riguardatocontemporaneamente: 1) la determinazione del-

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/201884

IdA

Rifiutil’efficienza delle MO come mezzo di sterilizza-

zione di un rifiuto ospedaliero tipico; 2) la possi-bilità di applicare la tecnica della “contaminazio-ne diretta – recupero delle spore” in modo ripro-ducibile, per calcolare appunto l’efficienza.I risultati dell’applicazione delle MO per 40 minu-ti non sono stati brillanti (riduzione non superioreal 98%), considerato che si è lavorato alla scala dellaboratorio – dunque senza preoccupazioni per lapenetrazione delle MO nel campione – e con den-sità di potenza effettiva di 350 W kg-1. I risultatimigliori sono stati ottenuti con i campioni inizial-mente umidi al 60%; fatto che potrebbe conferma-re la tesi che parte dell’efficacia delle MO è in re-altà associata al vapore che esse stesse producono.Incidentalmente, questi risultati sperimentali con-fermano quelli ottenuti da Oliveira e coll. (Oliveiraet al., 2010; Oliveira e Pisani, 2015). Ulteriori ri-cerche sperimentali potrebbero contribuire non soloa chiarire il meccanismo di azione delle MO sui mi-croorganismi ma anche al superamento degli attua-li limiti della tecnologia che utilizza le MO da sole.La tecnica della “contaminazione diretta – recupe-ro delle spore” dal campione di rifiuto, nella no-stra campagna di esperimenti ha confermato le suecriticità intrinseche. Questa tecnica richiede fral’altro 1) grandi quantità di acqua sterile per il la-vaggio dei campioni, e 2) l’impiego di personaleaddestrato in tutte le sue fasi.Per poter recuperare alte percentuali di spore dai ri-fiuti irraggiati sembra comunque necessario ag-giungere un tensioattivo all’acqua di lavaggio, co-me riferito nel 2010 da Oliveira e coll. che aveva-no utilizzato “un detergente commerciale nelle pro-porzioni di quattro gocce a litro”. Nei nostri espe-rimenti si è rinunciato a questo ausilio; in parte perverificare quanto esso sia importante, e in parte perpotere escludere interferenze del tensioattivo colterreno di coltura BHI nella coltivazione delle spo-re che segue. Questa scelta non è stata felice.In una ipotetica applicazione della “contamina-zione diretta – recupero delle spore” al controllodi esercizio di un impianto di sterilizzazione, lanecessità di maneggiare grandi volumi di acquanon solo graverebbe sulla struttura sanitaria chegestisce l’impianto, ma introdurrebbe un fattoredi incertezza per ogni operazione manuale effet-tuata nella sequenza di: contaminazione per di-spersione → lavaggio e recupero → semina →conta su piastra.La misurazione della temperatura del campione du-rante e dopo il trattamento a MO è di primaria im-portanza; per poterla eseguire bisogna attrezzare il

forno con micro-camere a raggi infrarossi, che noninterferiscono con le MO. In mancanza di queste,si dovrebbe determinare (e poi applicare) la velo-cità con la quale il campione si raffredda, e trova-re il modo di introdurvi il termometro in manierarapida e riproducibile.L’adozione di un forno a MO da laboratorio e nondi uno domestico per gli esperimenti; oppure il pas-saggio da una cavità multi-modale a un sistemamono-modale (nel quale le guide d’onda diriganole radiazioni direttamente sul campione, senza ri-flessioni dentro la cavità); potrebbero aumentare ilpotere di controllo del processo e portare a risulta-ti migliori e più riproducibili.L’eterogeneità del rifiuto sanitario (reale o sinteti-co) 1) rende più complicata la contaminazione uni-forme del campione, e 2) comporta una penetra-zione disomogenea delle MO; il calore sviluppatoe la temperatura all’interno del becher cambianodunque da punto a punto, probabilmente abbas-sando l’efficienza del trattamento.Peraltro la triturazione preventiva di campioni comequesti, che sono fatti per quasi un quarto di plastichemorbide, non può essere ideale; a meno di raffred-dare il campione nella macchina, ad es. con “ghiac-cio secco” per renderlo duro e fragile. Questa peròsarebbe una tecnica da mettere interamente a punto.Nel complesso gli esperimenti da noi condotti in la-boratorio suggeriscono di continuare a lavorare perdeterminare l’efficacia sterilizzatrice delle MO, mausando come specie indicatrici delle spore in fialacome è tradizionale. Non sembra che attualmentela tecnica della “contaminazione diretta – recupe-ro delle spore” dai campioni di rifiuto, gravata co-me è dalle numerose indeterminazioni sopra de-scritte, possa fornire un aiuto verso l’obiettivo prin-cipale della ricerca.

6. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

AA. VV. (2008) Farmacopea Ufficiale della Repubblica Ita-liana XII Edizione. Istituto Poligrafico Zecca dello Stato.

AA. VV. (2016) Farmacopea Europea (European Pharma-copeia), IX Edizione.

Appleton T. J., Colder R. I., Kingman S. W. et al. (2005) Mi-crowave technology for energy-efficient processing ofwaste. Applied Energy 81:85-113.

Banana A. A. S., Norulaini N. A. N., Baharom J., et al. (2013)Inactivation of pathogenic micro-organisms in hospitalwaste using a microwave. Journal of Material Cycles andWaste Management 15(3):393-403.

Bhattacharjee M.K., Delsol J.K. (2014) Does microwave ster-ilization of growth media involve any non-thermal effect?Journal of Microbiological Methods 96:70-72.

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/2018 85

IdA

Rifiuti Benanti L. (2016) Sterilizzazione con microonde dei rifiuti os-

pedalieri. Standardizzazione dei metodi analitici. Tesi diLaurea Magistrale, Università degli Studi di Palermo, A.A.2015/2016.

Brent D.A. (1992) Method for processing infectious waste us-ing microwaves. United States Patent, 5, 124, 125, Jun. 23.

Bryant S., Rahmanian R., Tam H., et al. (2007) Effects of Mi-crowave Irradiation and Heat on T4 Bacteriophage Inacti-vation. Journal of Experimental Microbiology and Im-munology (JEMI) – M&I UBC 11:66-72.

Celandroni F., Longo I., Tosoratti N., et al. (2004) Effect of mi-crowave radiation on Bacillus subtilis spores. Journal ofApplied Microbiology. 97:1220-1227.

de Pomerai D.I., Smith B., Dawe A., et al. (2003) Microwaveradiation can alter protein conformation without bulk heat-ing. Federation of European Biochemical Societies (FEBS)Letters 543:93-97.

D.P.R. 15/07/2003, n.254 “Regolamento recante la disciplinadei rifiuti sanitari a norma dell’articolo 24 della legge 31luglio 2002, n. 179”. (GU Serie Generale n. 211 del11/09/2003).

Drake R.C. (1993) Apparatus for sterilizing medical waste bymicrowave autoclaving. United States Patent, 5, 223, 231,Jun. 29.

Giliberto G. (2016) Sterilizzazione con microonde dei rifiutiospedalieri. Effetti delle condizioni operative. Tesi di Lau-rea Magistrale, Università degli Studi di Palermo, A.A.2015/2016.

Guy A.W. (1984) History of Biological Effects and MedicalApplications of Microwave Energy. IEEE Transactions onMicrowave Theory and Techniques, MTT-32(9):1182-1200.

Houšová J., Hoke K. (2002): Microwave heating – the influ-ence of oven and load parameters on the power absorbedin the heated load. Czech J. Food Sci., 20(3): 117-124.

IEC Publication 705 (1988) Methods for measuring the per-formance of microwave ovens for household and similarpurposes. 2th ed. Int. Electrotech. Commis. Geneve.

IMPI (1991) Report of Standard Committee. International Mi-crowave Power Institute. Clifton (VA), USA.

Insinga C. (2014) Produzione dei rifiuti sanitati a rischio in-fettivo in un “Centro Trapianti” e ipotesi di sterilizzazionecon microonde. Tesi di laurea magistrale, Corso di LaureaMagistrale in Ingegneria per l’Ambiente e il Territorio,Università degli di Palermo, A.A. 2013/2014.

Janković S.M., Milošev M.Z., Novaković M.LJ. (2014) TheEffects of Microwave Radiation on Microbial Cultures.Hospital Pharmacology. 1(2):102-108.

Jeng D.K.H., Kaczmarek K.A., Woodworth A.G., et al. (1987)Mechanism of Microwave Sterilization in the Dry State.Applied and Environmental Microbiology 53(9):2133-2137.

Maamari O., Mouaffak L., Kamel R. et al. (2016) Comparisonof steam sterilization conditions efficiency in the treatmentof Infectious Health Care Waste. Waste Management49:462-468.

Murayama T. et al. (1975) Apparatus for sterilizing ampoulesand reject control system therefor. United States Patent, 3,880, 586, Apr. 29.

Ojha S.C., Chankhamhaengdecha S., Singhakaew S. et al.(2016) Inactivation of Clostridium difficile spores by mi-crowave irradiation. Anaerobe 38:14-20.

Oliveira E.A., Nogueira N.G.P., Innocentini M.D.M., et al.(2010) Microwave inactivation of Bacillus atrophaeusspores in healthcare waste. Waste Management 30:2327-2335.

Oliveira E.A., Pisani R. Jr (2015) Influência do meio suportena inativação de endósporos de Bacillus atrophaeus emresíduos de serviços de saúde por micro-ondas. Eng SanitAmbient 20(2):289-296.

Soares S.R., Rodrigues Finotti A., da Silva V.P., AlvarengaR.A.F. (2013) Application of life cycle assessment and costanalysis in health care waste management. Waste Manage-ment 33:175-783.

STAATT, State and Territorial Association on AlternativeTreatment Technologies (2005) Conference, Orlando (FL),USA, December 5-7, Executive Summary.

Tortora G.J., Funke B.R., and Case C.L. (2016) Microbiolo-gy. An introduction. 12th Edition. USA: Pearson Education,Inc.

UNI (1994) Norma UNI 10384-1:1994 Impianti e processi disterilizzazione dei rifiuti ospedalieri. Requisiti generali.

UNI (2009) Norma UNI EN ISO 14161:2009 Sterilizzazionedei prodotti sanitari – Indicatori biologici – Guida per la se-lezione, l’uso e l’interpretazione dei risultati.

Vela G.R., Wu J.F. (1979) Mechanism of Lethal Action of2,450-MHz Radiation on Microorganisms. Applied and En-vironmental Microbiology 37(3):550-553.

Veronesi P., Leonelli C., Moscato U., et al. (2007) Non-incin-eration microwave assisted sterilization of medical waste.Journal of Microwave Power & Electromagnetic Energy.40(4):211-218.

WHO World Health Organization (2014) Safe management ofwastes from health-care activities. II Edition, edited by Y.Chartier et al. Geneva: WHO Press.

Woo I.-S., Rhee I.-K., Park H.-D. (2000) Differential Damagein Bacterial Cells by Microwave Radiation on the Basis ofCell Wall Structure. Applied and Environmental Microbi-ology 66(5):2243-2247.

Zimmermann K. (2017) Microwave as an emerging technol-ogy for the treatment of biohazardous waste: A mini-re-view. Waste Management & Research, 35(5): 471-479.

RINGRAZIAMENTI

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato at-traverso il Progetto SIGLOD – Sistema Intelligen-te per la Gestione e Localizzazione Ottimale delleDiscariche a valere sull’Asse II del ProgrammaOperativo Nazionale “Ricerca e Competitività”,Italia 2007-2013 – finanziato dall’Unione Europeae dalla Repubblica Italiana in seno al “PON04a2_F– Smart Cities and Communities and Social Inno-vation”.I reagenti utilizzati nella Ricerca sono stati acqui-stati con il Fondo Finalizzato alla Ricerca (FFR)2012 di Ateneo dei docenti L. Ercoli, S. Nicosia eN. Nocilla, Università degli Studi di Palermo.

Ingegneria dell’Ambiente Vol. 5 n. 2/201886

per il 2018 è sostenuta da:

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INGEGNE R IADE LL ’AMB I ENTE

N. 2/2018

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