Signorini

Simonetta

Resp. Settore Autoimmunità

Synlab Italia srl Brescia

CONSOLIDAMENTO NEL

LABORATORIO DI LABORATORIO DI

AUTOIMMUNITA’:

ASPETTI ORGANIZZATIVI ED

ANALITICI

INTRODUZIONE

La tecnologia MULTIPLEX LUMINEX utilizza microsfere magnetiche .

Per il pannello ANA screen le microsfere sono 16 di cui 13 rivestite con gli antigeni nucleari e citoplasmatici più specifici per le connettiviti autoimmuni (dsDNA, Cromatina o nucleosoma, Ssa52 kD, Ssa 60 kD, SSb, Sm, SM/RNP, RNP-A, RNP 68 kD, Scl70, Jo1, P-Ribosoma, Centromero CENPB), e 3 microsfere come controllo (verifica del pipettaggio del campione, verifica del bianco quindi di eventuali interferenze o legami aspecifici, verifica del funzionamento corretto di lettura dei laser).dei laser).

Dopo le reazioni di incubazione e lavaggio l’eventuale presenza di anticorpi che si sono legati agli antigeni adesi alle microsfere, viene identificata mediante 2 laser, uno per l’identificazione dell’anticorpo specifico, l’altro per la determinazione quantitativa.

IndicatoriAnalisi del contesto

Programmazione/ Progettazione

Applicazione/ Cambiamento

Controllo

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contestoAnalisi del contesto

Nel 2007 abbiamo analizzato il numero esami eseguiti nel settore Autoimmunità :

3441 al mese di cui il 61% in Immunofluorescenza Indiretta, per esami anticorpi anti nucleo, anti DNA.

Questa metodica presenta dei vantaggi analitici determinati da un’elevata sensibilità nei confronti degli antigeni nucleari e citoplasmaticinei confronti degli antigeni nucleari e citoplasmatici

Tuttavia esistono anche degli svantaggi analitici rappresentati da:

�Una scarsa specificità in quanto non permette di identificare gli antigeni specifici

�Scarsa riproducibilità dei dati analitici poiché la lettura al microscopio è soggettiva

�Impegno del personale�Il personale deve essere esperto

�Valori di bassa positività (1/80; 1/160) sono spesso determinati da interferenze (infezioni, situazioni infiammatorie in corso etc..)

�Perdita di alcuni antigeni importanti (come ad esempio Ssa, dovuti semplicemente alla procedura di fissaggio delle cellule sul vetrino

Indicatori

Programmazione/ Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contestoINDICATORI

Dall’analisi del contesto abbiamo evidenziato degli Indicatori:

Totale esami eseguiti 2007 (11 mesi) 224.542 suddivisi in:

�Completamente automatizzati:(100.826) 44.90%�Semiautomatizzati (immunofluorescenza indiretta):(109.389) 48.72%�Manuali: (14.327)6.38%�Incremento totale rispetto al 2006 : 7.57% di cui 2.28% automatizzati, 4.27%semiautomatizzati, 1% manuali

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControll o

Analisi del contestoPROGRAMMAZIONE/PROGETTAZIONE

PROGRAMMAZIONE/PROGETTAZIONE

Programmazione prove:

Analisi risultati:

N° campioni

1205

TEST

Anticorpi anti-nucleo

METODI

IFA Test di riferimentoBioPlex nuova tecnologia

PROGRAMMAZIONE/PROGETTAZIONEAnalisi risultati:

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contesto

PROGRAMMAZIONE/PROGETTAZIONE

IFI posBioplex neg

IFI pos cut-off titolo 1/80Bioplex neg

IFI pos cut-off titolo 1/160Bioplex neg

IFI pos cut-off titolo 1/320Bioplex neg

Bioplex pos IFA neg

Analisi dati

Bioplex neg Bioplex neg Bioplex neg Bioplex neg IFA neg

34.03% 14.11% 12.53% 7.39% 4.65%

Titolo 1/80 Titolo 1/160 Titolo 1/320

85.89% 87.47% 92.61%Agreement on pos

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contesto

APPLICAZIONE /CAMBIAMENTO

ENA profilo

ANA LuminexdsDNA

ENA SCREEN

MIDDLEWARE

BioPlex Multiplex Luminex

profilo

ANA Luminex

dsDNA ENA SCREEN

POS /DUB NEG POS/DUB NEG POS NEG

ENA prof .

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contesto

CONTROLLO

Per i dati discrepanti positivi in IFI negativi con BioPlex (~ 10%) abbiamo distribuito a tutti i labs service e ai nostri PP schede anamnestiche per ricevere info pazienti, eventuali dati storici, richieste specifiche di ANA con metodica IFA.specifiche di ANA con metodica IFA.

Indicatori

Programmazione/

Progettazione

Applicazione/ CambiamentoControllo

Analisi del contestoAnalisi del contesto

(Casistica 129 campioni)

Campioni BioPlex Pos IFA Neg 6.20% Informazioni cliniche/Sintomatologia

� Sinoviti, esofagiti, screen per tiroide

� Manifestazioni cutanee, dolori articolari

� Alopecia, fibromialgia� Alopecia, fibromialgia

� LES

Campioni IFA Pos BioPlex Neg 5.43% Informazioni cliniche/Sintomatologia

� MCTD-UCDT

� Patologie epatiche

� Manifestazioni cutanee

� AR

Bioplex ANA total pos and eqv total neg pos/total neg/total

Neg Eqv Pos BP 37 BP 5 BP 88,10% 11,90%

42 campioni con informazioni da schede anamnestiche confronto esiti

ANALISI DATI SELEZIONE CAMPIONI

Neg Eqv Pos BP 37 BP 5 BP 88,10% 11,90%

neg 2 4 15 IIF 21 IIF 21 IIF 50,00% 50,00%

pos 3 3 15IIF

CONCORDANTI

Sindrome Sjögren 1 SSa Ro52&60 abs Speckled

Polymyalgia Rheumatica 2 dsDNA and RNPA abs Speckled

Systemic Lupus Eritematosus 3 SSa 60 kDa abs; dsDNA+Sm abs Speckled

Rheumatoid Arthritis 5

dsDNA abs; Scl70 abs; SSa

60kDa+dsDNA;dsDNA abs;

RNPAabs

Speckled;

Nucleolar;

Speckled+

Homogenous

Mixed connective tissue disease 2

Chromatin/Nucleosom+RNPA+

Sm/RNP abs; SSa 52&60 kDa+

SSb+ RNPA abs

Speckled

IIF patternNUMBER OF PATIENTS/CLINICAL SUSPICION BP POS/EQV IIF POS BP antigens

SSb+ RNPA abs

Scleroderma 1 CENP-B abs Centromere

Undif. connective tissue disease 2 SSa 52kDa abs; dsDNA abs

Speckled+

Homogeneous;

Speckled

Ulcerative colitis 1 dsDNA absSpeckled+

Homogeneous

Cholangitis 1 CENP-B abs

Speckled+

Homogeneous

+ Centromere +

F actin

Rheumatoid Arthritis 1

Systemic Lupus Eritematosus 1

NUMBERS BP NEG IIF NEG AND CLINICAL DEMAND

Myositis 1 Jo1 abs

Rheumatoid Arthritis 52 dsDNA abs; 2 RNPA abs; 1 SSB

abs

Sindrome Sjögren 2 Chromatin/Nuclosome abs

Autoimmune vasculitis 1 Sm/RNP+ RNP abs

Liver autoimmune disease 1 SSa 52 kDa abs

Hashimoto Chronic Thyroiditis 1 RNPA abs

Granulomatosis 1 dsDNA abs

Polymyalgia Rheumatica 1 RNPA abs; dsDNA abs

DISCREPANCIES NUMBERS BP POS/EQV IIF NEG AND CLINICAL DEMAND BP antigens

DISCORDANTI

Polymyalgia Rheumatica 1 RNPA abs; dsDNA abs

Eczema Angular cheilitis 1 RNPA abs

Sterility 1 dsDNA abs

chronic urticaria for allergy 1 dsDNA abs

no clinical information 2 Sm/RNP; Jo1 + SSa 52kDa abs

test requested for born

densitometry Vit D low1

dsDNA abs

no clinical information 2 Nucleolar and speckled

Serum sent from Neurology

hospital department, high anti

TPO and Anti TG

1 Nucleolar

DISCREPANCIES NUMBERS IIF POS BP NEG IIF pattern

MDSS AUTOANTIBODIES CLINICAL DEMAND/ DIAGNOSIS

SLE SSa Ro52&60 kDa abs Sindrome di Sjögren

SLE Chromatin/Nucleosome Sindrome di Sjögren

SLE Chromatin/nucleosome

+Sm/RNP + RNPA 1abs

Mixed Connective Tissue Disease

(MCTD) in monitoring

SLE Sm/RNP + RNP abs Autoimmune vasculitis

SLE SSa Ro52kDa absUndifferentiated Connective

Tissue Disease (UCTD)

SLE Sm/RNP abs no clinical information

SLE RNPA abs Rheumatoid Arthritis

SLE SSa 60 kDA + dsDNA absRheumatoid Arthritis and Psoriasis

in monitoring

SLE SSa 60 kDA abs SLE

MDSS AUTOANTIBODIES CLINICAL DEMAND/DIAGNOSIS

no association RNPA abs Polymyalgia rheumatica

no association dsDNA abs Rheumatoid Arthritis

no association RNPA absRheumatoid Arthritis

no association Chomatin/nucleosome abs Sjögren's Syndrome

no association dsDNA absRheumatoid Arthritis

no association RNPA abs Rheumatoid Arthritis

no association dsDNA abs Rheumatoid Arthritis

no association Scl70 absRheumatoid Arthritis diagnosed

no association dsDNA abs

AR? Polymyalgia rheumatica?

Undifferentiated connective

tissue disease ?

ANALISI DATI SELEZIONE CAMPIONI MDSS

SLE SSa 60 kDa abs SLE

SLE SSa 52 kDA abs Liver autoimmune disease

SLESSa 52&60 kDA abs ; Blot

pos for PL-12 absPolymyositis

SLE or Scleroderma CENP-B abs Scleroderma

Scleroderma Scl70 abs

Undifferentiated Connective

Tissue Disease (UCTD) in

monitoring

Scleroderma CENP-B abs + Actina F Cholangitis

Polymyositis Jo1 abs Myositis

Polymyositis Jo1 + SSa 52kDa abs no clinical information

no association RNPA abs Eczematous angular cheilitis

no association dsDNA abs Granulomatosis?

no association dsDNA + RNPA abs Rheumatoid Arthritis

no association dsDNA absUlcerative Colitis in monitoring

no association dsDna abs Sterility

no association RNPA abs

Hashimoto's Chronic Thyroiditis

no association dsDNA absTest requested for borne

densitometry ; Low VIT D

no association dsDNA + Sm abs SLE

no association dsDNA abs Chronic urticaria for allergy

no association RNPA abs Rheumatoid Arthritis

Collaborazione con Molinette AOU Citta’ della salute e delle scienze di Torino

ANALISI DI 320 CAMPIONI CON INFORMAZIONI CLINICHE).I CAMPIONI SONO STATI SELEZIONATI ED ANALIZZATI PRESSO IL LABORATORIO MOLINETTE CON STRUMENTAZIONE FASE SOLIDA EliaTM CDT SCREEN (Thermofisher) + IFI ED INVIATI AL LABORATORIO AUTOIMMUNITA’ SYNLAB BRESCIA PER ANALISI CON FASE SOLIDA MULTIPLEX LUMINEX BioPlex2200TM ANA screen (Bio-Rad) + IFI Hep-2 Kallstad Bio-Rad.

ANA Multiplex

ANA

ENA

dsDNA

ALGORITMO DIAGNOSTICO

Multiplex Luminex

POS/ DUBBIO

NEG

IFI su segnalazione scheda anamnestica e/o immunoblot specifici in particolare per

Polimiosite Dermatomiosite e epatopatie autoimmuni

PANNELLI specifici Multiplex Luminex: Connettiviti;

LES SS

MCTD PANNELLI Immunodot

IFI

MICROSCOPIO ROBOTIZZATO ZEISS AXIO IMAGER

OBIETTIVI IN DOTAZIONE:

� OBIETTIVO EC "PLAN-NEOFLUAR" 20X/0,50 M27 ,OBIETTIVO 20x planare semi-apocromatico alla fluorite, con apertura numerica di 0.5

� OBIETTIVO EC "PLAN-NEOFLUAR" 40X/0,75 M27 ,OBIETTIVO 40x planare semi-apocromatico alla fluorite, con apertura numerica di 0.75

� ILLUMINAZIONE LED

AUTOIMMUNE LABS VISION

BioPlex: ANA Luminex –- dsDNA – ENA screen- ENA profilo-

Pannelli specifici – ANCA – Fosfolipidi abs (cardiolipina-beta 2

glicoproteina )

LIS

AISAIS

AUTOIMMUNE LAB VISION WORKFLOWvantaggi E PERFORMANCE DI QUALITA’

Gestione esami accesso random-identificazione autoanticorpi-pannelli specifici-ana screen di supporto per lettura ed interpretazione dei vetrini

Middleware specifico: visione di tutti i risultati relativi agli esami

autoimmunità-gestione delle sessioni di preparazione e refertazione vetrini (IFA)-raccoglitore delle immagini dei quadri fluoroscopici specifici-

archivio storico archivio storico

Lettura ed acquisizione immagine automatica-possibilità di leggere vetrini immediata , in diversi momenti della giornata o a distanza di luogo o di

tempo-trasferimento immagine al Middleware-visione di pozzetti particolari dall’immagine senza “bruciare campione”-lettura di vetrini da

uno schermo-archivio immagine paziente per storico

Immunoblot specifici:profili di autoanticorpi più specifici per le patologie autoimmune-identificazione di autoanticorpi contro antigeni rari non

visibili con altre metodiche-metodica alternativa di ricerca di autoanticorpi

VALUTAZIONE E MONITORAGGIO CONTROLLO CONTROLLO QUALITA’MEDIANTE UTILIZZO DI SOFTWARE SPECIFICI VALUTAZIONE DI MEDIA, SD, CV DEI CONTROLLI CALIBRAZIONE STRUMENTAZIONE E DEI CQI

GRAZIE PER L’ATTENZIONE