Saggi biochimici per la valutazione dell’attività di ligandiin linee cellulari

Interfase

Fase G1: sintesi dei componenti cellulari

Fase S: duplicazione del materiale genetico

Fase G2: sintesi dei materiali necessari alla successiva mitosi.

Il ciclo cellulare è composto fondamentalmente da due parti: l’interfase e la mitosi.

Il processo mitotico è costituito da 4 fasi:Profase, Metafase,

Anafase, Telofase

Le cellule normali non hanno la capacità di proliferare

indiscriminatamente a causa di alcuni geni ubiquitari ad azione

repressiva: p53 e Rb.

Il gene p53 viene così chiamato in quanto codifica per una

proteina di 53 kDa associata alla cromatina e alla matrice

nucleare di cellule normali e tumorali.

La sua entrata nel nucleo è mediata da proteine chaperon in

particolare la Hsp70 (heat shock protein).

A questo punto si aprono due possibilità: se la riparazione è

produttiva il ciclo cellulare può riprendere e la cellula

sopravvive; nel caso in cui il danno sia irreparabile, p53

promuove l’apoptosi della cellula.

Il gene p53 viene considerato un tumor suppressor gene in

quanto la sua attività è in grado di arrestare la progressione del

ciclo cellulare nella fase G1, favorendo la riparazione del DNA

danneggiato.

Riparazione

La proteina p53 è una DNA-binding protein in grado di

riconoscere un motivo simmetrico di 10 bp e di attivare la

trascrizione dei geni.

L’innesco dell’apoptosi può avvenire mediante attivazione

ligando Fas-L con il suo recettore Fas. Il recettore Fas è una

proteina presente sulla membrana plasmatica appartenente alla

famiglia dei recettori del TNF-NGF. Quando lega il suo ligando

induce apoptosi:

Fas

Se la riparazione non ha successo s’innesca il meccanismo di apoptosi

Nell’uomo i processi apoptotici sono coinvolti in:

- sviluppo embrionale

- sviluppo del sistema nervoso centrale

- atrofia tissutale endocrino-dipendente

- turn-over cellulare

In numerosi processi patologici, quali infezioni virali (AIDS),

tumori, e malattie autoimmuni, una deregolazione

dell’apoptosi può essere la base o una delle cause della

patogenesi della malattia.

Induzione dell’apoptosi

- radiazioni ionizzanti

- legame del recettore Fas con il suo ligando Fas-L

(vedi percorso 1 e percorso 2)

- rimozione dal mezzo di coltura dei fattori di crescita

- riduzione della disponibilità di ATP

- aumento di Ca++ citoplasmatico

percorso 1

su queste proteine si aggancia la caspasi 8 che attiva a

cascata le altre caspasi fino alla caspasi 3 la quale produce

idrolisi dei substrati citosolici e nucleari.

dopo il legame si ha oligomerizzazione del recettore Fas

che provoca il reclutamento di proteine citosoliche

FADD/MORT ad attività adattatrice;

Dall’idrolisi della sfingomielina si generano i ceramidi i quali

inducono apoptosi nelle cellule emopoietiche mediante il

ganglioside GD3.

L’apoptosi da GD3 sembra agire a valle delle caspasi in

quanto non può essere bloccata da inibitori specifici delle

caspasi.

percorso 2

L’interazione recettoriale porta all’attivazione di una

fosfolipasi C specifica per la fosfatidilcolina e di una

sfingomielinasi acida.

percorso 3 (mitocondriale)

La caspasi 8 ha come substrato il bid (BH3 interacting domain

death agonist). Il prodotto di idrolisi del bid indicato come t-bid

entra nei mitocondri e genera oligomerizzazione dei fattori pro-

apoptotici Bax e Bak che portano alla fuoriuscita dal

mitocondrio del citocromo c che è il cofattore dell’APAF-1

(Apoptotic Protease Activating Factor 1) che attiva la caspasi

9 che poi porta all’attivazione della caspasi 3 e al taglio dei

substrati cellulari.

Fattori pro-apoptotici: bax, bad, bak

Fattori antiapoptotici: bcl-2, bcl-xL

L’apoptosi può essere indotta da ligandi che

interagendo su recettori specifici portano all’innesco

in seguito ad aumento di Ca++ citoplasmatico.

La caratterizzazione di questi recettori, la loro

funzione regolatrice all’interno della cellula

costituisce un metodo di valutazione dell’attività di

ligandi verso questi recettori.

Lattato PiruvatoLDH

NAD NADH

ResazzurinaResorufinaDiaforasi

560 nm

590 nm

Dosaggio LDH

Studio Citotossicità

Monitoraggio dell’apoptosi

Dosaggio delle CaspasiCysteinyl Aspartate Specific Proteinases

Colorimetrico Fluorimetrico

Le caspasi sono delle cisteino-proteasi in grado di tagliare i

substrati dopo un residuo di aspartato.

Attualmente sono note 10 tipi di caspasi e la più studiata è la

caspasi 3.

La caspasi 3 è normalmente presente in forma inattiva, come

pro-caspasi la quale proteoliticamente viene attivata.

La caspasi 3 è in grado di tagliare il poli-ADP-ribosio-

polimerasi (PARP) un enzima coinvolto nella riparazione del

DNA.

Dalla mappatura del sito di taglio del PARP è stato identificato

un tetrapeptide DEVD come sito dell’attività caspasica.

La coniugazione del DEVD con un residuo colorimentrico o

fluorimentrico costituisce il substrato per il dosaggio della

caspasi presente.

Induzione di apoptosi

Attivazione della caspasi1

caspasi3

DEVD-AFC

pNA = p-nitroanilide ; AFC = 7-ammino-4-trifluorometilcumarina

DEVD-pNA

DEVD

-pNA -AFC

DEVD

rivelazione fluorimetricarivelazione colorimetrica

Dosaggio della Annexina V

L’annexina V è una proteina con forte attività anticoagulante

che ha elevata affinità calcio-dipendente per amminofosfolipidi.

La fosfatidilserina è localizzata dalla parte interna della

membrana cellulare, mentre mediante trasporto attivo durante

l’apoptosi viene a trovarsi sul lato esterno della membrana

cellulare.

L’annexina V in presenza di Ca++ ha elevata affinità per la

fosfatidilserina.

Legando all’annexina V un residuo fluorescente come il

fluorescein isotiocianato (FITC) è possibile misurare la quantità

di fosfatidilserina presente sul lato esterno della membrana

cellulare.

citoplasma

FICTAnnexina V

Ca++Ca++

fosfatidilserina

esterno

interno

Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio

MTT(giallo)

mitocondrio

Formazano

Colore (azzurro)

MTT