Ruolo di TDP43 nella Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale AmiotroficaSclerosi Laterale Amiotrofica

Tesi di Laurea di:Serena Diana Ghezzi

Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI

Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano

Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico

tipo di SLA

gene classe

geni mendeliani

SLA1 SOD1 enzima detossificante

SLA2 ALS2 signali GEF

SLA4 SETX metabolismo del DNA e dell’ RNA

SLA5 SPG11 recettore o trasportatore di membrana

SLA6 FUS legame al RNA, silenziamento e riparo del DNA

SLA8 VAPB traffico vesciculare

SLA9 ANG neovascolarizzazione

SLA10 TARDBP legame all’RNA ed exon skipping

SLA DCTN1 trasporto assonale

SLA-FTDP

MAPT assemblamento dei microtubuli e loro stabilità

loci mendelianiSLA3 Ignoto Ignota

SLA7 Ignoto Ignota

SLA-X Ignoto Ignota

SLA-FTD1 Ignoto Ignota

SLA-FTD2 Ignoto Ignota

Sclerosi Laterale AmiotroficaSclerosi Laterale Amiotrofica

INTRODUZIONE

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento dell’esordio dei sintomi è in media di 3-5 anni con un decorso più rapido nelle forme ad esordio bulbare.

La diagnosi è essenzialmente clinica, non esiste infatti un test diagnostico specifico.

5-10% familiari (SLAf)90-95% sporadici (SLAs)

Dati familiari ed epidemiologici indicano che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi.

L’exitus avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura respiratoria

INTRODUZIONE

TARDBPTARDBP

La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1

Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 è iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma innescando la degenerazione motoneuronale

1p36

1. regolazione della trascrizione2. regolazione dello splicing3. stabilità dell’mRNA

INTRODUZIONE

TARDBP (TDP43)TARDBP (TDP43)

ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6

RRM1 RRM2 GRRNLS 414 aa, 43 KDa

sito di interazione hnRNP

siti di interazione con l’mRNA

segnale di localizzazione nucleare

Sito di clivaggio (aa86-89) Sito di clivaggio (aa216-219)

Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare geneticamentecaratterizzare geneticamente l’ampia coorte di pazienti SLA afferenti all’Ambulatorio Malattie del Motoneurone – Dipartimento di Scienze Neurologiche – Policlinico di Milano.

SCOPO

OBIETTIVIOBIETTIVI

Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione A382T risultata essere la variante più comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellularemodello cellulare che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale mutazione.

SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO

La frequenza mutazionale è risultata pertanto essere del 2.3% calcolata sull’intera coorte di pazienti (1.6% nelle forme

sporadiche e 7.7% in quelle familiari).

Pazienti SLA

Soggetti SANI

numero di soggetti 213 181

casi familiari 26

genere (M/F) 122/91 102/79

età di insorgenza (anni) 58.3 ± 12.8

età al prelievo (anni) 60.8 ± 12.5 67.4 ± 8.8

insorgenza bulbare 21.4%

durata della malattia (mesi)

31.6 ± 29.4

SOD1, VAPB e ANG positivi nessuno4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3

sporadici)

RISULTATI

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9

IV:1 IV:2 IV:3

p.Ala382Thr

RISULTATI

SLAf

SLAs

G294V G295S G348C A382T

c.881G>T p.Gly294Val c.883G>A p.Gly295Ser c.1144G>A p.Ala382Thr

I:1 I:2

II:1 II:2 II:3 II:4

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8

IV:1 IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10

V:1 V:2 V:3 V:4 V:5 V:6 V:7 V:8 V:9

VI:1 VI:2 VI:3 VI:4 VI:5 VI:6 VI:7 VI:8

p.Gly348Cys

SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO

c.881G>T p.Gly294Val c.883G>A p.Gly295Ser

SCREENING GENETICOSCREENING GENETICO

p.Ala382Thrp.Gly348Cys

ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6

RRM1 RRM2 GRRNLS

c.1144G>A p.Ala382Thr

RISULTATI

c.1144G>A p.Ala382Thr

Costruzione del modello cellulareCostruzione del modello cellulare

ficol mRNA cDNA

A B

AB

820bp965bp 820bp521bp

NdeINdeI

RISULTATI

Validazione del modello cellulareValidazione del modello cellulare

hHEK

hSK-N-SH

mES

actina

hHEK hSK-N-SH

mES

45 KDa 45 KDa

45 KDa

NT WT A382T NT WT A382T

NT WT A382T

Western-Western-BlotBlot

TDP43 DAPI MERGE

NT

WT

A382T

ImmunocitochimicaImmunocitochimica

RISULTATI

Validazione del modello cellulareValidazione del modello cellulare

GAPDH

TDP43

RISULTATI

Costruzione del modello con GFPCostruzione del modello con GFPhHEK

DAPI TDP43

MERGE

wt

A382T

TDP43WTGFP

TDP43A382TGFP

RISULTATI

CONCLUSIONICONCLUSIONI

E’ interessante notare come, per quanto riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1SOD1, nel nostro come in altri studi.

La frequenza mutazionale frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra coorte di paziente è risultata pari al:1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%).

Il quadro clinicoquadro clinico della SLA10 è analogo a quello della malattia classica, con qualche variabilità interfamiliare per quanto riguarda età e sito di esordio

GENETICAGENETICA

DISCUSSIONE

Paziente

genere paese d’origine

ereditarietà

TDP43

insorgenza durata (mesi)età sede

A, V:3 M Belgio AD G348C 50 spinale 36 a

A, V:1 M Belgio AD G348C 53 spinale -A, III:3 F Belgio AD b 67 spinale 36-48A, III:4 M Belgio AD b 39 spinale 36A, III:5 M Belgio AD b 36 spinale - a

A, III:6 F Belgio AD b 54 spinale 36A, IV:1 M Belgio AD b 66 spinale 48A, IV:3 M Belgio AD b 58 spinale 48A, IV:6 F Belgio AD b 53 spinale 60B, III:2 M Italia AD A382T 50 spinale con crampi agli arti inferiori 60 a

B, II:5 M Italia AD b 50 spinale con debolezza all’arto superiore sinistro

36

C M Italia sporadica A382T 54 spinale con paresi alla mano sinistra -D F Italia sporadica G294V 73 spinale con debolezza progressiva agli

arti inferiori36

E M Italia sporadica G295S 64 spinale con debolezza e atrofia agli arti superiori

36a

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellularidue modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.

ANALISI FUNZIONALEANALISI FUNZIONALE

DISCUSSIONE

actina

hHEK

45 KDaNT WT A382T

hSK-N-SH

45 KDa NT WT A382T

mES

45 KDa NT WT A382T

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellularidue modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata.

ANALISI FUNZIONALEANALISI FUNZIONALE

DISCUSSIONE

mRNA non tradotto proteina degradata

2 31 2 31

2 31

45 KDa 45 KDa

45 KDa

HEK non trasfettate

HEK TDP43WT HEK TDP43A382T

PROSPETTIVEPROSPETTIVE

1. Proseguire la caratterizzazione genetica

2. Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione

proteica

3. Verificare l’eventuale regolazione dei livelli di trascritto

4. Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli

esprimenti la proteina legata alla GFP

5. Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un

modello neuronale (es. SK-N-SH)

6. Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari

fin qui descritti

DISCUSSIONE

RINGRAZIAMENTIRINGRAZIAMENTI