RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA · Ricco di Piastrine (PRP) o Plasma Povero di...

Anno 12 - n. 5 - Ottobre 2009

Regione LombardiaDirezione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentaledella Lombardia e dell’Emilia RomagnaOsservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICAa cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

Sommario

Direttore responsabileStefano Cinotti

Direttore scientificoGiorgio Zanardi

RedattoreGiorgio Zanardi

Responsabile comitato redazioneGiorgio Zanardi

Comitato di redazioneM. Astuti, P. Cordioli, M. Domenichini, P. Antoniolli, L. Gemma, C. Genchi, G. Gridavilla, A. Lavazza, A. Palma, V.M. Tranquillo

Hanno collaborato a questo numeroM. Ferrari, S. Renzi,M. Cornali, L. Sesso, S. Carlin, M. Zavanella, G. Ravizzola, L. Alborali, S. Catania, G. Loglio

Segreteria di redazioneM. GueriniL. Marella

Fotocomposizione e stampaAGVA Arti Grafiche VanniniBagnolo Mella (Bs)

EditoreIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia ed Emilia Romagna “Bruno Ubertini”

Tutti coloro che vogliono scriverci, devono indirizzare le lettere al seguente indirizzo:“L’OSSERVATORIO” rubrica “La posta dei lettori”,via Bianchi, 9 - 25124 Brescia - tel. 030 2290259-235;oppure utilizzare la posta elettronica: [email protected]

L’Osservatorio e i numeri del precedente Bollettino Epidemiologicopossono essere consultati anche sul sito web http:\\www.oevr.org

4 Le cellule staminali mesenchimali (CSM) e la loro applicazione terapeutica in ambito veterinario

M. Ferrari, S. Renzi, M. Cornali, L. Sesso, S. Carlin

9 Acinetobacter baumanni: un patogeno emergente che resiste agli antibiotici

M. Zavanella, G. Ravizzola, L. Alborali, S. Catania

11 Controllo della popolazione canina nella comunità montana Valcavallina

G. Loglio

Anno 12 - n. 4 - Agosto 2009

Regione LombardiaDirezione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentaledella Lombardia e dell’Emilia RomagnaOsservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICAa cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

’OSSERVATORIOL

A ricordo del prof. Gianluigi Gualandi

Si laurea a pieni voti a Bologna nel 1946 con una tesi affidatagli dal Prof. Messieri sulla polmonite fibrinosa a grandi focolai, o polmonite influenzale del cavallo.Da quel momento la Sua vita si identifica con la Sua professione a cui lega, senza alcun ripensamento, ogni Sua personale decisione, fino ai Suoi ultimi istanti.Nato a Molinella in provincia di Bologna nel 1922, dopo la laurea continua la formazione professionale presso l’Istituto di Patologia Speciale e Clini-ca Medica Veterinaria di Bologna.Erano quelli gli anni in cui in quella Scuola di Veterinaria si affermava il metodo clinico, riassunto oggi nell’esame obiettivo generale e nei suoi esami correlati.Il Prof. Gualandi, per oltre 60 anni, porterà con sé questa impronta: il me-

todo, l’acquisizione della nozione, la sua applicazione scrupolosa, la verifica oggettiva, l’osservazione e la partecipazione speculativa.Forte e saldo nel metodo, sorretto da doti intellettive non comuni, il Prof. Gualandi inizia la “Sua” carriera all’Istituto Superiore di Sanità poi allo Zooprofilattico di Torino.Fu in questo periodo, nel corso di una diatriba su di un esame sulla fissazione del complemento, che ebbe l’incontro con il Prof. Ubertini, che, con felice intuito, lo convinse a divenire Suo collaboratore.Svolse quindi ruoli di assistente, addetto alla produzione del vaccino aftoso fino al 1955.Nel 1956 è abilitato alla Libera docenza in Microbiologia ed Immunologia Veterinaria, da cui scaturi-sce una qualificata attività didattica presso la Facoltà di Medicina Veterinaria di Milano fino al 1968.Nel 1970 è aiuto, fino al 1977 Vice-Direttore, dal ’77 all’87 Direttore.Sempre assecondato dalla Sua famiglia a sostegno del suo lavoro, il Prof. Gualandi si impegna con ogni risorsa per raggiungere l’eccellenza nella Sua attività.Diviene punto di riferimento, non solo nazionale, nell’ambito della patologia suina da cui sono scatu-riti oltre 30 corsi annuali di formazione presso la Camera di Commercio di Brescia in collaborazione con la Fondazione Iniziative Zooprofilattiche e Zootecniche e da cui nasce una vera e propria Scuola utile a tutti i professionisti del settore.Viene nominato, per i suoi meriti, esperto del Consiglio Superiore di Sanità e, successivamente, Pre-sidente dell’Ordine dei Veterinari della Provincia di Brescia.Riceve numerosi attestati e riconoscimenti e soprattutto aiuta i giovani più promettenti ad affermarsi nell’Istituzione e nella vita, trasmettendo ed inculcando, a sua volta, i valori a Lui più cari: il rispetto per la professione, la costanza nell’aggiornamento, il metodo scientifico.Queste Sue doti vengono esaltate nel periodo in cui regge la Scuola per la Ricerca Scientifica voluta dall’Istituto e dalla Fondazione Iniziative Zooprofilattiche e Zootecniche.Presente dalle prime ore della giornata fino a tardi la sera per trasmettere il sapere ed il modo di ap-prenderlo, disponibile alle richieste di aiuto dei giovani, pronto a scorgerne i talenti e a valorizzarli.Terminato l’impegno con la Scuola, non è terminata la Sua voglia di sapere, di conoscere e di vivere la sua vita all’interno dell’Istituto che riteneva la Sua casa.A 85 anni avanza domanda per frequentare come volontario l’Istituto e continua con slancio la Sua attività di acquisizione scientifica a favore dell’Istituto fino al giorno del suo ricovero.Tutti noi ci inchiniamo davanti al Prof. Gualandi, ci stringiamo attorno alla Sua famiglia e lo assu-miamo ad esempio di vita e di professione.

Prof. Stefano Cinotti

3 Editoriale

Sanità animale 4 ’OSSERVATORIOL

Le cellule staminali mesenchimali (CSM)e la loro applicazione terapeutica

in ambito veterinarioM. Ferrari1, S. Renzi1, M. Cornali2, L. Sesso3, S. Carlin4

PremessaL’impiego di Cellule Staminali Mesenchimali (CSM) ha suscitato notevole interesse negli ultimi anni sia in campo umano che in medicina veterinaria, in virtù delle loro promettenti caratteristiche biologiche, che le rende potenzialmente impiegabili per la cura di nu-merose patologie.Le cellule staminali sono in grado di proliferare e di differenziare in una o più linee cellulari, a seconda dello stadio di sviluppo del tessuto in cui si trovano: quelle di origine embrionale sono pluripotenti , cioè in grado di differenziare verso tutti i tipi cellulari del-l’organismo e, potenzialmente capaci di rigenerare qualunque tipo di organo/tessuto lesionato. Le im-plicazioni etiche legate all’uso delle cellule staminali embrionali umane, hanno fatto si che l’attenzione si concentrasse su una fonte alternativa di cellule stami-nali, rappresentata da quelle isolate da tessuti adulti. Le stesse, non avendo implicazioni etiche, rappresen-tano le cellule ottimali per la medicina rigenerativa dell’apparato muscolo-scheletrico. In particolare, in campo veterinario, la specie equina risulta sovente soggetta a lesioni teno-legamentose che spesso esita-no in un “defi cit” funzionale e prestazionale evidente soprattutto nel cavallo sportivo.L’esperienza ha mostrato come i tendini ed i lega-menti si riparino e si rigenerino lentamente ed in modo ineffi ciente, compromettendo l’elasticità e la resistenza meccanica della struttura. Negli anni sono state proposte numerose terapie volte a riparare le le-sioni senza però garantire il ripristino della funziona-lità meccanica del tendine.Le CSM possono essere isolate da diversi tessuti, tra i quali il midollo osseo, il tessuto adiposo bianco, il cordone ombelicale e la placenta e possono essere utilizzate sia per l’impianto autologo che per quello allogenico. In virtù delle loro proprietà immunomo-dulatorie, esse infatti non stimolano il sistema immu-nitario dell’ospite evitando fenomeni di rigetto.Il Reparto Substrati Cellulari dell’Istituto Zooprofi -lattico di Brescia, visto il crescente interesse del set-tore ippiatrico per l’impiego delle CSM nella terapia rigenerativa, ha attivato un progetto di ricerca per lo studio in vitro ed in vivo delle caratteristiche biolo-giche di tali cellule. A tale proposito, dal 2007, una sezione della banca-cellule del Centro è stata dedi-

cata alla conservazione di campioni di CSM equine isolate da midollo osseo e tessuto adiposo.Nel 2008 è nato un gruppo di lavoro composto, ol-tre che dal Reparto Substrati Cellulari, da altre Unità Operative rappresentate rispettivamente dalla Facoltà di Medicina Veterinaria di Parma, dall’Ospedale Riz-zoli di Bologna, dalla Società Privata “Avantea” di Cremona e dalla Facoltà di Medicina Veterinaria di Bologna.Queste strutture, nell’ambito di un progetto speri-mentale, forniscono ai veterinari richiedenti sospen-sioni di CSM per l’impiego in vivo ed hanno elabo-rato dei protocolli operativi, in concerto con i medici veterinari ippiatri, per l’applicazione delle CSM nel-la terapia rigenerativa di lesioni teno-legamentose e cartilaginee nella specie equina.In particolare, il reparto Substrati Cellulari è in grado di rispondere alle seguenti esigenze:• allestire colture di CSM autologhe da campioni di

midollo osseo o tessuto adiposo bianco conferiti dai medici veterinari;

• preparare, a partire da sangue autologo, Plasma Ricco di Piastrine (PRP) o Plasma Povero di Pia-strine (PPP) da impiegarsi come veicolo d’inocu-lo delle CSM;

• isolare ed amplifi care CSM da tessuto adiposo bianco per l’impianto allogenico;

• controllare contaminazioni virologiche, batteriche e fungine di tutte le CSM allestite, conservate e a disposizione dei medici veterinari ippiatri (inda-gini eseguite presso i Reparti di Virologia e Batte-riologia dell’Ente).

5 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

Nella presente trattazione, vengono descritte le pro-cedure operative relative all’isolamento delle CSM da midollo osseo e tessuto adiposo, necessarie per la riparazione di lesioni tendinee nel cavallo ed i ri-sultati preliminari relativi al loro impiego in animali lesionati

Fasi OperativePrelievo del Midollo Osseo – Il midollo osseo, pre-levato in sede sternale mediante ago jamshidi 11G, è stato raccolto in tubi sterili da 10 ml contenenti 6000 UI di eparina.Prelievo del Tessuto Adiposo – Il tessuto adiposo è stato prelevato dalla sede addominale di carcasse equine in sede di regolare macellazione.Isolamento delle Cellule Staminali Mesenchimali (CSM) – All’arrivo in laboratorio il midollo osseo viene trasferito in tubi da centrifuga da 50 ml e sot-toposto a centrifugazione a 1600 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Il “buffy coat” è sottoposto alla separazione degli elementi cellulari mediante centrifugazione a 1300 G per 20 minuti alla tempe-ratura di 20°C in gradiente di densità attraverso stra-tifi cazione su Ficoll Paque Plus. L’anello di elementi cellulari mononucleati viene raccolto in terreno col-turale (NH Expansion Medium, Miltenyi Biotec®) e ricentrifugato per eliminare i residui del reagente di separazione. Il processo viene ripetuto per due volte. Le cellule mononucleate isolate vengono inoculate alla concentrazione di 1x106 cellule/cm2 ed incubate a 37°C in 5% di CO2.In laboratorio i campioni di tessuto adiposo, mante-nuti a 37°C in soluzione salina “A” contenente 3% di antibiotici (penicillina 3000 UI/ml e streptomicina 1500 μg/ml), sono accuratamente lavati con la stes-sa soluzione, sminuzzati mediante un bisturi fi no a ottenere frammenti delle dimensioni di circa 1 mm e disgregati enzimaticamente per 2-3 ore a 37°C in agitazione, in PBS contenente 0,2% di collagenasi tipo IA e 1% di antibiotici.La sospensione cellulare, addizionata con il 10% di

Siero Fetale Bovino (SFB), viene fi ltrata con una garza sterile ed il fi ltrato viene sottoposto a centri-fugazione a 1300 G per 10 minuti a 20°C, al fi ne di isolare la frazione vascolare stromale. Il pellet cel-lulare ottenuto viene risospeso in terreno di coltura rappresentato da una miscela di D-MEM “low glu-cose” contenente il 20% di SFB e l’1% di antibiotici e sottoposto a 3 lavaggi attraverso centrifugazione a 350 G per 10 minuti a 20°C. Al termine del secondo lavaggio il pellet viene fi ltrato con fi ltro di nylon a 70 μm. La sospensione cellulare viene inoculata in terreno colturale ad una concentrazione di 20000 cel-lule/cm² ed incubata a 37°C in 5% di CO2. Dopo 48 ore il surnatante viene rimosso e le cellule aderenti sono ripetutamente lavate con soluzione salina “A” per rimuovere gli elementi cellulari non adesi. Amplifi cazione – Al raggiungimento della sub-con-fl uenza, le cellule isolate dal midollo osseo sono espanse fi no ad un massimo di cinque passaggi se-riali. Il terreno di coltura impiegato è rappresentato da una miscela composta da: 40% di DMEM low glucose, 40% di Ham’s F12, 20% di SFB ed 1% di antibiotici.Anche le CSM isolate dal tessuto adiposo sono state amplifi cate per un numero di passaggi non superiore a cinque.Congelamento – Le CSM sono sottoposte a congela-mento eseguito secondo modalità standard in terreno colturale addizionato con il 10% di DMSO (Dimeti-lsulfossido).Controlli di sterilità – Tutte le colture destinate al-l’impianto sono sottoposte a controlli atti a confer-mare l’assenza di agenti contaminanti rappresentati da micoplasmi, eubatteri e virus.L’eventuale presenza di micoplasmi è valutata attra-verso la colorazione di Hoechst. I test per l’accerta-mento della contaminazione batterica sono eseguiti in condizioni di asepsi per evitare l’interferenza di al-tre possibili contaminazioni. Per le indagini vengono impiegati terreni selettivi solidi: Sabouraud per l’iso-

Figura 1. CSM da midollo osseo: morfologia di

tipo fi broblastico, 200x.

Figura 2. Presenza di cloni cellulari 40x.


lamento di funghi/lieviti, Triptose Soy Broth (TSA), Brain Heart Infusion Broth (BHI) e Nutrient agar per gli eubatteri.La presenza di agenti virali di origine equina (Herpes virus ed Arterivirus) è stata valutata tramite metodo diretto. I campioni cellulari in esame sono seminati su due linee cellulari distinte: derma equino ed RK13. Le colture inoculate sono sottoposte ad osservazione microscopica per la rivelazione di effetto citopatico (ECP).Caratterizzazione – La tipizzazione delle cellule viene eseguita con due test in vitro. a) Il primo di essi consiste nella determinazione delle “Unità Forman-ti Colonia” (UFC), che permette di verifi care l’abi-lità delle cellule isolate a dare origine a colonie. A tal fi ne, 200000 cellule sono inoculate in piastre da 6 pozzetti nel terreno di coltura commerciale NH CFU-F Medium (Miltenyi Biotec®) ed incubate a 37°C in 5% di CO2. Dopo 15-21 giorni le colonie, colorate con Cristal Violetto 2%, sono contate.b) Il secondo metodo è basato sull’accertamento della pluripotenza delle CSM. Per tale indagine le cellule sono sottoposte a differenziamento verso tre diverse

linee cellulari: condrocitaria, adipocitica ed osteoci-tica .Le CSM destinate al differenziamento verso la linea condrocitica sono diluite in 1 ml di NH ChondroDiff Medium (Miltenyi Biotec®) in provette alla concen-trazione fi nale di 2,5x105 cellule/ml. Il tubo, con tap-po semichiuso e mantenuto in posizione verticale, è incubato a 37°C in presenza del 5% di CO2. Il terre-no è rimosso completamente e sostituito con terreno fresco preriscaldato ad intervalli di 72 ore prestando estrema attenzione a non danneggiare il pellet forma-tosi. Le cellule sottoposte al differenziamento verso la li-nea adipocitica sono diluite ad una concentrazione fi nale di 5x104 cellule/ml in NH AdipoDiff Medium (Miltenyi Biotec®). Le CSM sono trasferite in un pozzetto da 35 mm ed incubate a 37°C con 5% di CO2. Il medium è sostituito ad intervalli di 72 ore e dopo 21 giorni si effettuata la colorazione “Oil Red

O”, che permette di rilevare la presenza di cellule adipocitiche.L’NH OsteoDiff Medium (Miltenyi Biotec®) è im-piegato per differenziare le CSM in osteociti. Le cellule sono ri-sospese alla concentrazione fi nale di 3x104 cellule/ml in un pozzetto da 35 mm ed incu-bate a 37°C con il 5% di CO2. Il terreno colturale è sostituito con terreno fresco ad intervalli di 72 ore e dopo 10 giorni di incubazione le colture sono colora-te secondo il metodo “Von Kossa”.Esame ecografi co – Una prima valutazione ecogra-fi ca viene effettuata pochi giorni dopo il trauma al fi ne di ottenere una stima certa delle dimensioni della lesione. Per uno studio più approfondito si eseguono sezioni trasversali e sezioni longitudinali del tendine, che vengono confrontate con il controlaterale dello stesso arto per poter verifi care l’effettivo aumento di volume del tendine lesionato.

Figura 3. UFC ottenute mediante diluizione del-

le CSM.

Figura 4. CSM differenziate in adipociti, Oil Red

O 100x

Figura 5. CSM differenziate in adipociti, Oil Red

O 200x


Preparazione del Plasma Ricco di Piastrine (PRP) – Il PRP è ottenuto da 250 ml di sangue intero auto-logo prelevato dalla giugulare del cavallo da tratta-re. Il sangue viene raccolto in sacche da trasfusione contenenti anticoagulante CPDA-1 (citrate-phospha-te-dextrose-adenine) e trasferito in provette da centri-fuga da 50 ml. Il campione viene centrifugato a 1600 G per 20 minuti a 18°C. Il “buffy coat” è ri-sospeso nel plasma, le piastrine sono contate utilizzando un emocitometro automatico e ri-sospese nel plasma alla concentrazione fi nale di 1x109 piastrine/ml.Risospensione delle CSM – Le CSM allestite ven-gono ri-sospese nel PRP alla concentrazione fi nale di 5x106 cellule/ml, la sospensione così ottenuta viene aspirata in una siringa e conservata a +4°C fi no al-l’impianto nella sede di lesione. L’intervello fra la preparazione delle CSM ed il loro impianto non deve superare le 24 ore.Impianto delle CSM – Le CSM ri-sospese nel PRP sono inoculate nella cavità tendinea sotto guida ultra-sonica dopo circa 20 giorni dall’incidente. I cavalli trattati sono quindi sottoposti ad un periodo riabili-

tativo di 12 mesi e a controllo ecografi co eseguito, possibilmente, mensilmente.

RisultatiIsolamento delle Cellule Staminali Mesenchimali (CSM) - Le CSM già dopo 48 ore dall’inoculo aderi-scono alla superfi cie del recipiente ed assumono una morfologia di tipo fi broblastico (Fig. 1).Le stesse inoltre raggiungono la sub-confl uenza me-diamente in 7-10 giorni. Vengono eseguiti passaggi seriali in numero non superiore a cinque, al fi ne di ottenere una concentrazione di cellule pari o supe-riore a 107.Caratterizzazione – a) Il test delle “Unità Formanti Colonia” (UFC) ha dimostrato come queste cellule siano in grado di dare origine a dei cloni cellulari: infatti, ogni 10000 cellule seminate si ottiene una co-lonia cellulare (Fig. 2-3).b) La pluri-potenzialità delle CSM isolate è stata confermata dalla capacità di tali elementi ad evolvere

Figura 6. CSM differenziati in osteociti, Von

Kossa 100x

Figura 7. CSM differenziati in osteociti, Von

Kossa 200x

verso le tre linee tissutali esaminate. Il differenzia-mento in adipociti è evidenziato dalla formazione di granuli lipidici di colore rosso nel citoplasma cellu-lare (Fig. 4-5). L’evoluzione verso il tessuto osseo è confermata dalla presenza sul substrato cellulare di aggregati di calcio di colore nero (Fig. 6-7), mentre la capacità a differenziare in condrociti è testimoniata dalla formazione di agglomerati di tipo cartilagineo (Fig. 8).Esame ecografi co – Ecografi camente la lesione ap-pare come un’area ipo-ecogena in sezione trasversa-le, determinata dalla perdita di densità del collagene; mentre in sezione longitudinale si riconosce un pes-simo allineamento delle fi bre che non sono più paral-lele tra loro (Fig. 9).Già dal quarantesimo giorno dopo l’impianto delle CSM si osserva come l’ecogenicità del tessuto tendi-neo sia sempre più omogenea in sezione trasversale e come in sezione longitudinale si verifi chi un miglio-ramento nell’allineamento delle fi bre (Fig. 10-11).

Figura 8. CSM differenziate in condrociti, evi-

denziati dalla presenza del nodulo.


Osservazioni conclusiveI risultati, seppure preliminari, hanno evidenziato come le CSM isolate da midollo osseo e tessuto adi-poso siano in grado di replicare in vitro, consentendo di ottenere una concentrazione cellulare ideale per l’impianto in vivo.Tali elementi sono contraddistinti da caratteristiche biologiche tipiche delle CSM, quali la pluripotenza. Inoltre, la possibilità di operare, durante tutte le fasi, in condizioni adeguate garantisce una riduzione delle contaminazioni da agenti estranei. Infi ne, le analisi ecografi che fi no ad ora eseguite, hanno confermato la capacità di tali cellule di riparare il tessuto tendineo lesionato già dopo circa 2 mesi dall’impianto.Un esame più accurato del tessuto riparato potrà mostrare come le CSM siano in grado di garantire qualitativamente una migliore e reale riparazione del tendine rispetto ai sistemi terapeutici tradizionali. E’ infatti noto come tale tessuto, seppur sembrando completamente riparato, sia soggetto a recidive, a se-guito del ripristino prematuro dell’attività sportiva. Pertanto, soltanto un “follow up” prolungato, conse-guente all’impianto di CSM, consentirà di accertare la reale capacità terapeutica delle CSM.Un ulteriore aspetto da sottolineare è quello relati-vo all’impiego allogenico delle CSM: tale approccio consente di fare ricorso a stocks di cellule già am-plifi cate, controllate e prontamente disponibili, ri-ducendo così l’intervallo di tempo intercorrente fra il momento in cui si verifi ca la lesione e l’impianto cellulare. In tale modo, sarebbe inoltre possibile li-mitare gli inconvenienti correlati alla preparazione e all’amplifi cazione delle sospensioni cellulari (ridotta capacità proliferativa, contaminazioni accidentali).

Prospettive futureSulla base degli studi fi no ad ora condotti e dei cavalli trattati, in futuro sarà indispensabile ampliare la col-lezione di cellule utilizzabili per la terapia rigenerati-va ed individuare nuove fonti tissutali da cui isolare le CSM da impiegarsi in alternativa a quelle isolate da tessuto adiposo bianco e midollo osseo. Infi ne, vi-sto il crescente interesse della clinica veterinaria per le specie da affezione, sarà fondamentale destinare le CSM anche all’impiego nella pratica clinica e chirur-gica dei piccoli animali.

1. Centro Substrati Cellulari - IZSLER Brescia 2. Clinica Veterinaria Ippodromo di Merano3. Facoltà di Medicina Veterinaria, Università degli studi di Milano4. Facoltà di Medicina Veterinaria, Università degli studi di Padova.

Figura 9. Immagine ecografi ca della lesione

tendinea prima dell’impianto delle CSM.


dopo 40 giorni dall’inoculo delle CSM.


dopo 60 giorni dall’impianto delle CSM.


Acinetobacter baumanni: un patogeno emergente che resiste agli antibiotici

M. Zavanella1, G. Ravizzola2, L. Alborali3, S. Catania4

Condizioni di stress nell’uomo e negli animali posso-no modifi care lo stato d’equilibrio verso microrgani-smi saprofi ti originariamente innocui, facilitando la comparsa di ceppi virulenti. Inoltre le stesse popolazioni batteriche, sottoposte a pressione antibiotica per scopi terapeutici, sono in-dotte a selezionare cloni resistenti.Entrambe le situazioni si presentano con maggior frequenza in alcune specie, tra cui Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecium e Staphylococcus intermedius, che si comportano da opportunisti e in grado di evolvere a multi-resistenti. Per questa ragio-ne sono stati chiamati “precursori dell’era post-an-tibiotica”. A. baumannii, assieme ad A. calcoaceticus, forma un unico gruppo o complex. Appartiene ad un genere che comprende 17 specie, tra le quali lwoffi ed haemolyti-cus hanno rilevanza clinica . Essendo ubiquitario, colonizza acqua, suolo, anima-li, vegetali. Negli alimenti, assieme ad altri batteri proteolitici (Alcaligenes, Aeromonas, Pseudomonas, ecc.), partecipa ai processi di degradazione superfi -ciale della carne e del pesce. Alcune sue proprietà potrebbero essere sfruttate per scopi tecnologici, in quanto: - fi ssa il nickel nell’acqua, neutralizza alcuni erbici-

di, degrada petrolio e benzina sul terreno per assi-milazione diretta del carbonio ;

- produce sostanze attive per la lotta biologica contro alcune malattie fungine delle piante, (Phytophthora capsici, Fusarium graminearun, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani) e contro un nematode, Meloi-dogyne incognita, che infesta i pomodori.

Dal punto di vista sanitario presenta invece parecchi aspetti negativi assolutamente singolari: - si trasforma da auxotrofo in prototrofo, traendo il

carbonio dall’alcool etilico (che tollera fi no al 10%) e l’azoto dai nitrati inorganici;

- resiste ai sali biliari, al cloro fi no a 14 ppm, alla pastorizzazione a vapore fl uente;

- si attacca mediante pili a svariate superfi ci abioti-che. Elabora poi una sostanza proteica adesiva e protettiva dietro segnalazione di sensori situati sul-la membrana, che riconoscono il tipo di materiale sottostante;

- sopravvive per 3 – 4 settimane su vetro, plastica, acciaio inox e più giorni su camici, stetoscopi, guanti, mani di chi lavora in ambiente sanitario ;

- diventa resistente ai farmaci attraverso più mecca-nismi: un’ isola cromosomiale di 45 geni (quantità record fra i batteri) che codifi cano l’antibiotico-re-sistenza, importati al 95% da Pseudomonas, Sal-

monella, Escherichia coli; alterazione delle protei-ne penicillin-binding; beta-lattamasi a largo spettro tipo VEB-1 e metallo-beta-lattamasi (oxacillinasi); formazione di biofi lm impermeabili; perdita di po-rine .

La resistenza agli antibiotici viene attribuita in larga misura alla pressione da cefalosporine, carbapenemi, fl uorochinoloni e glicopeptidi molto usati in sede ospedaliera.In patologia umana, i primi focolai epidemici da A. baumannii risalgono al 1991 negli USA, prevalen-temente nelle unità di terapia intensiva, medicina generale ed urologia. Altri episodi si sono susseguiti in ospedali di vari paesi, spesso in concomitanza ad un tasso d’occupazione dei letti superiore al normale, che accentuava il contatto interumano. In tutti i casi si assisteva ad un aggravamento delle condizioni generali dei pazienti ed allo sviluppo di polmoniti, meningiti, infezioni acute delle vie urina-rie o dei tessuti molli. Alla base dell’infezione esistevano ferite traumati-che o chirurgiche, ustioni, tracheostomie, trapianti di rene, applicazioni di protesi ortopediche, cateteri venosi o periferici, tubi naso-gastrici, apparecchi per la ventilazione meccanica. Il microrganismo veniva trovato su letti, servizi igienici ed arredi ospedalieri. Dai pazienti ricoverati si isolavano in prevalenza ceppi resistenti a carbapenemi, cefalosporine, amino-glicosidi, fl uorochinoloni. Qualche effi cacia veniva riconosciuta in vitro a polimixina B ed in vivo all’as-sociazione amikacina+imipenem. A. baumannii ha provocato setticemie in Vietnam, Kuwait, Afganistan ed Iraq, infettando le ferite di soldati inglesi ed americani. Il periodo d’incubazio-ne durava 3-4 giorni e la malattia, specialmente dopo contagio interumano, progrediva con decorso grave, anche fatale, non essendo controllabile con i farmaci comunemente prescritti. Probabilmente il microrga-nismo, divenuto resistente in seguito alle dosi mas-sicce di antibiotici usate dai medici operanti in preca-rie condizioni di sterilità nelle zone di guerra, veniva diffuso anche attraverso la polvere. In veterinaria sono descritte infezioni nei bovini, sui-ni, ovini, volatili, cani e gatti, principalmente a carico dell’apparato respiratorio. Un caso di fascite necrotizzante con shock settico causato da A. baumannii è segnalato nel gatto. Nei cavalli sono riportati numerosi casi di cheratiti con-giuntivali e di lesioni alle vie respiratorie non risolti dai consueti trattamenti con amoxicillina associata ad acido clavulanico, ceftiofur, tetracicline, sulfamidici, gentamicina, fl umequina, enrofl oxacina .


Nelle carpe A. baumannii, associato ad altri batteri, interviene in una malattia virale ad elevata mortalità (Koi Herpes Virus Disease, KHV) oppure determina lesioni papillomatose nella coda. In Cina per la prima volta questo microrganismo è stato isolato da pesce gatto che mostrava esoftalmo, fegato pallido, stomaco vuoto. Il ceppo era multire-sistente .Non è da escludere la patogenicità anche per altre spe-cie animali (primati, visoni, uccelli selvatici e da gab-bia, pesci ornamentali) nei quali sono state descritte in passato infezioni batteriche da Gram-negativi di incerta collocazione con caratteristiche riferibili oggi al gruppo A. baumanni-calcoaceticus.Ad esempio, la fl ora batterica predominante svilup-pata in coltura dalle feci di 1.100 canarini era costi-tuita al 2,5% da Acinetobacter spp., identifi cati occa-sionalmente come baumannii.Berlau e Coll. ritengono che l’habitat naturale del gruppo baumannii-calcoaceticus si trovi nei vegetali, ad esempio le insalate, che consumate crude potreb-bero avere un ruolo nella trasmissione di infezioni ospedaliere tra i pazienti più sensibili. A. baumannii colonizza certamente cotone e riso, senza danni vi-sibili alle piante, mentre sulle foglie della canna da zucchero la sua presenza è stata messa in relazione in India con la Red Stripe Disease (RSD), una malattia che reca gravi danni alle coltivazioni. Diagnosi di laboratorioAl microscopio ha l’aspetto di un cocco-bacillo Gram-negativo (a volte può sembrare Gram-positivo), spes-so disposto in coppie, non sporigeno, immobile. Nel-l’esame colturale A. baumannii dopo 24 ore a +37° C forma su Agar sangue colonie non emolitiche, roton-de, a margine netto, del diametro di 1-2 mm, conves-se, incolori, opache. Aerobio, cresce anche a +44°C (diversamente dalle altre specie di Acinetobacter) ed è catalasi-positivo, ossidasi-negativo, a differenza di Neisseria e Burkholderia cepacia, con le quali spes-so in passato veniva confuso. Su MacConkey Agar sviluppa colonie rotonde, a margine netto, convesse, lucide, del diametro di 1 – 2 mm, incolori, con bordo traslucido e centro opaco tendente al rosa.Esistono anche substrati selettivi poco noti, ad esem-pio i terreni di Mandel, Holton e Leeds, che conten-gono ampicillina, vancomicina, cefalosporine oppure Acinetobacter Agar, nella cui formula entrano etano-lo, nitrato d’ammonio, sali biliari, tetraciclina, cicloe-ximide.

L’identifi cazione può essere fatta con test biochimici per Gram-negativi non-fermentanti oppure per enterici. Alcuni laboratori clinici dotati di notevole esperienza differenziano le colonie sospette dalle seguenti rea-zioni:

glucosio+/emolisi- = A. baumanni glucosio-/emolisi- = A. lwoffi i emolisi+ = A. haemolyticus

La produzione di beta-lattamasi può essere rilevata in laboratorio dal sinergismo fra un inibitore di beta-lattamasi e cefalosporine.

Osservazioni sul territorioDa quanto osservato nella realtà ospedaliera locale, nel periodo di tre anni (2004-2007) sono stati isola-ti dall’uomo 115 ceppi di A. baumannii, distribuiti come visibile in tabella 1.

Tabella 1. Distribuzione dei 115 ceppi isolati dall’uomo in realtà ospedaliere nel triennio 2004-2007

Sede d’isolamento dall’uomo

Acinetobacter baumannii

N° ceppi isolati %

Tampone da ferite traumatiche o chirurgiche

51 44

Espettorato o broncoaspirato 39 34

Urina di cateterizzati 16 14

Emocoltura 9 8

I ceppi mostravano in vitro le seguenti resistenze ver-so gli antibiotici comunemente usati per questo gene-re d’infezioni: 11 ceppi resistevano ad una famiglia di antibiotici, 9 a due, 14 a tre, 11 a quattro.Non è stata fatta una distinzione dei ceppi multi-re-sistenti perchè non esiste un criterio generale per de-fi nirli tali. Da ricerche mirate avviate in diagnostica veterinaria, A. baumanni è stato ripetutamente isolato al momento dell’autopsia da visceri di animali da com-pagnia (specialmente uccelli ornamentali), mentre non è stato trovato nei suini in circa 40 casi di polmonite.

1. Fondazione Iniziative Zooprofi lattiche e Zootec-niche – Brescia

2. Laboratorio di Microbiologia e Virologia – Spe-dali Civili – Brescia

3. Istituto Zooprofi lattico Sperimentale Lombardia ed Emilia-Romagna – Brescia

4. Istituto Zooprofi lattico Sperimentale delle Venezie – Legnaro – Padova

Tabella 2. Resistenze mostrate dai ceppi in vitro nei confronti degli antibiotici comunemente usati

Famiglia Penicilline Cefalosporine Aminoglicosidi Chinoloni Carbapenemi

AntibioticiPiperacillina/tazobactam

CeftazidimeCefepime

Amikacina GentamicinaTobramicina

CiprofloxacinaLevofloxacina

Imipenem

N° ceppi resistenti

10 24 38 33 10

%resistenza

8,7 20,9 33,0 28,7 8,7


Controllo della popolazione canina nella comunità montana Valcavallina

G. Loglio1

PremessaIl randagismo è un problema che si può riscontrare in tutte le regioni d’italia, anche se si manifesta con modalità molto diverse da zona a zona. In alcuni ter-ritori gli interventi delle Amministrazioni Comunali, delle Amministrazioni Provinciali e dei Servizi Vete-rinari hanno permesso di rendere il fenomeno quasi inesistente. In altre zone la negligenza, la mancata conoscenza e valutazione del problema mantengono e rendono il randagismo una piaga sociale. I recenti casi di aggressioni, avvenute in Sicilia per opera di branchi di cani randagi, con esiti anche mortali, ne sono una testimonianza. In Italia si stima che vi siano circa sette milioni di cani e che il 22,3% delle famiglie italiane ne possieda uno. A livello nazionale la norma di riferimento per l’ana-grafe canina è la legge n° 281 del 14 agosto 1991 “Legge quadro in materia di animali d’affezione e prevenzione del randagismo”. Essa prevede che tutti i cani siano iscritti all’anagrafe canina e che ogni sin-golo animale sia identificato mediante l’applicazione di un tatuaggio indelebile. Recentemente, a seguito di numerose e gravi aggres-sioni operate dai cani, il Sottosegretario del Ministe-ro del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali ha emanato due norme:– “Ordinanza contingibile e urgente concernente

misure per l’identificazione e la registrazione della popolazione canina” (G. U. n. 194 del 20 agosto 2008);

– “Ordinanza contingibile e urgente concernente la tutela dell’incolumità pubblica dall’aggressione dei cani” (G. U. n. 68 del 23 marzo 2009).

Queste ordinanze, essendo contingibili e urgenti, vanno ad integrare, in via eccezionale e per un tempo limitato (24 mesi), la legge esistente. Dopo questo periodo, se non tramutate in strumenti normativi or-dinari, sono destinate a decadere.La Regione Lombardia, anticipando di quattro anni le ordinanze, aveva previsto con proprio decreto che, dal 1° gennaio 2004, i cani non fossero più identifica-ti mediante tatuaggio (metodo ritenuto poco pratico ed efficace perché facilmente alterabile e poco leg-gibile), ma tramite l’applicazione di un microchip, sistema elettronico d’identificazione che utilizza un piccolo transponder inoculato nel sottocute del lato sinistro del collo del cane.In Lombardia la norma vigente in materia di anagra-fe canina fa riferimento a:

– “lotta al randagismo e tutela degli animali d’affe-zione” (L.R. n. 16 del 20 luglio 2006);

– “regolamento di attuazione della legge regionale n. 16 del 20 luglio 2006 (R.R. n. 2 del 5 maggio 2008 in riferimento a “Lotta al randagismo e tute-la degli animali d’affezione”);

– misure per l’identificazione e la registrazione del-la popolazione canina (O.M. 6 agosto 2008);

– “chiarimenti in merito all’O. M. 6 Agosto 2008, concernente misure per l’identificazione e la re-gistrazione della popolazione canina” (circolare DGSA n. 20485 del 16 ottobre 2008 del Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali).

L’iscrizione di tutti i cani all’anagrafe canina, attra-verso l’applicazione del microchip, dovrebbe per-mettere di:– rendere consapevoli e responsabilizzare i pro-

prietari riguardo al comportamento dei loro cani quando sono mal custoditi, causano incidenti, morsicano, defecano sui marciapiedi o nei parchi pubblici, etc.;

– garantire maggior sicurezza ai cittadini;– evitare il fenomeno dell’abbandono:– contenere i costi a carico delle amministrazioni

comunali per il mantenimento dei cani, nei canili rifugio, catturati dall’accalappiacani e non identi-ficati;

– ridurre drasticamente il numero di cani detenuti nei canili;

– favorire la restituzione dei cani persi ai legittimi proprietari;

– contrastare il commercio abusivo dei cani;– garantire il benessere animale.Purtroppo molti cittadini che acquistano o prendono in custodia un cane, non sempre sono consapevoli del fatto che si devono assumere anche specifici do-veri civili, oltre che morali.

Situazione in provincia di BergamoIn provincia di Bergamo sono catturati dall’acca-lappiacani circa 1.500 cani l’anno. Di questi, oltre il 45% non sono identificati e iscritti all’anagrafe canina e pertanto devono essere mantenuti nei canili rifugio, con un costo annuo di circa 540.000 euro a carico dei comuni. Il fenomeno del randagismo non è inteso come pre-senza di cani privi del padrone, che vivono liberi sul territorio nutrendosi di scarti alimentari o di altri


animali. E’ invece diffuso il fenomeno dei cani “va-ganti” che, non essendo custoditi correttamente, sono liberi di scorrazzare per periodi più o meno lunghi e possono comunque determinare: – danni diretti a persone e animali, attraverso morsi-

cature a danno dei cittadini o di altri cani condotti regolarmente al guinzaglio o ad altri animali;

– danni indiretti, come incidenti stradali;– inconvenienti igienico- sanitari, quali la fecaliz-

zazione urbana, la rottura di sacchi delle immon-dizie alla ricerca di cibo, etc.Spesso le Amministrazioni Comunali sono re-sponsabili di questa situazione poiché raramente ricorrono all’intervento dell’accalappiacani per evitare di influire negativamente sui bilanci comunali. In-fatti, se un cane non è correttamente identificato diventa molto difficile risalire al legittimo pro-prietario e il costo del suo mantenimento presso il canile rifugio ricade interamente sul Comune dove è stato accalappiato.

Situazione nei comuni della Comunità Montana Valcavallina.Nei 16 comuni appartenenti alla Comunità Montana Valcavallina è stata accertata la presenza di numero-si cani non ancora iscritti all’anagrafe canina. Una situazione identica a quella di molti comuni della provincia di Bergamo causata dalla negligenza dei proprietari, da un’informazione non sempre efficace circa la normativa vigente, dalle scarse verifiche da parte delle amministrazioni comunali. In questi 16 comuni l’identificazione dei cani, me-diante tatuaggio, è iniziata nel 1993. I cittadini erano invitati, mediante manifesti, a recarsi presso gli uffici comunali per richiederne l’iscrizione dei loro cani all’anagrafe canina. Il veterinario dell’USSL, non disponendo di un ambulatorio, durante l’anno organizzava sedute itineranti per tatuare i cani in lo-cali messi a disposizione delle varie Amministrazioni Comunali. Negli anni questo compito d’istituto non è più stato attuato, lasciando questa incombenza quasi esclusivamente agli ambulatori veterinari privati. Con il passare degli anni è maturata nei cittadini l’idea che, quanto previsto dalla legge, fosse una pratica fa-coltativa alla quale doveva far ricorso solo chi ne era veramente costretto (e.g. per recarsi all’estero, per par-tecipare a mostre canine, per praticare la caccia, etc.). Tale convinzione era avvalorata anche dal fatto che le verifiche svolte dai veterinari dell’ASL di solito si limitano agli animali morsicatori o ai cani accalap-piati, dai rari controlli effettuati dalla polizia locale, dai guardiacaccia e del Corpo Forestale, ai quali in genere, dopo il 2004, non sono stati forniti lettori per microchip e dal fatto che i veterinari liberi profes-sionisti possono solo proporre ai clienti l’iscrizione all’anagrafe canina, ma non la possono imporre (art.

1, comma 7 dell’ordinanza contingibile ed urgente del 6 agosto 2008).

Scopi del progettoIn un territorio è possibile gestire e controllare la po-polazione canina solo se si dispone di un efficiente e aggiornato sistema anagrafico. Tutte le iniziative in-traprese dai Servizi Veterinari delle AASSLL, in colla-borazione con veterinari liberi professionisti, le ammi-nistrazioni comunali e le associazioni animaliste sono destinate a conseguire risultati mediocri se il problema non è affrontato nella sua complessità con impegno e determinazione da parte di tutti i soggetti coinvolti. Partendo dal dato provinciale per il quale circa il 45% dei cani catturati dall’accalappiacani non erano correttamente identificati e condividendo gli obietti-vi contenuti nel D.L. n° 281 del 14 agosto 1991, si è cercato di applicare quanto previsto dalla normativa nei 16 comuni appartenenti alla Comunità Monta-na Valcavallina, al fine di ottimizzare la gestione ottimale della popolazione canina all’interno di un territorio omogeneo.

Per sensibilizzare le Amministrazioni Comunali e la cittadinanza, all’inizio del 2008 è stato organizzato il convegno “I Comuni, i cittadini e la gestione della popolazione canina”.Dopo alcuni mesi sono stati convocati tutti i Sindaci dei 16 comuni appartenenti alla Comunità Montana Valcavallina per proporre la realizzazione del proget-to, ma soprattutto per far capire che gli interventi per il controllo della popolazione canina, per essere effi-caci, dovevano essere attuati contemporaneamente e con lo stesso criterio in tutti i loro comuni.

Descrizione del progettoIl progetto denominato “Il controllo della popola-zione canina nei comuni della comunità montana Valcavallina ” ha visto coinvolti:– i 16 comuni appartenenti alla Comunità Montana

Valcavallina; – la polizia locale, i guardiacaccia e il corpo fore-

stale;– il Servizio Veterinario dell’ASL di Bergamo;– l’Ordine dei Veterinari della Provincia di Bergamo;– cinque ambulatori veterinari;– le Associazioni animaliste operanti sul territorio.

Il progetto è stato diviso in tre fasi.

Prima fase: preparazione ed informazione degli Enti e dei cittadini.Questa fase è stata caratterizzata da:– riunioni preliminari con le 16 Amministrazioni

Comunali, con il coinvolgimento di sindaci, as-sessori, polizia locale, operatori ecologici;


– coinvolgimento operativo del Servizio Veterinario dell’ASL per svolgere interventi d’identificazione dei cani presso i vari comuni;

– accordo con gli ambulatori veterinari del terri-torio su un tariffario massimo da applicare per l’applicazione di chip al cane di proprietà di un cittadino residente in uno dei 16 comuni della C.M. Valcavallina. Per la stipula di questo ac-cordo è intervenuto il Presidente dell’Ordine dei Veterinari della Provincia di Bergamo.

Seconda fase: attuazione del progetto.Per agevolare e velocizzare il progetto è stato indi-spensabile fornire a tutte le Amministrazioni Comu-nali una modulistica identica in modo che tutte le fasi si susseguissero in successione senza possibilità di errore.A questo fine, ogni Sindaco ha trasmesso al Presi-dente della Comunità Montana la lettera di adesione al progetto e la delega per l’acquisto di un lettore per microchip, strumento indispensabile per eseguire le verifiche. Le Amministrazioni Comunali, con avvisi pubblici o lettere personalizzate, hanno informato i cittadini su quanto previsto dalla legge, invitando i proprietari di cani non ancora iscritti all’anagrafe canina, a recarsi preso gli uffici comunali per denunciarne il possesso e richiederne l’iscrizione. Nell’avviso era indicato il costo applicato dal Servizio Veterinario dell’ASL per l’applicazione del chip a ogni cane e l’elenco degli ambulatori veterinari dove era possibile recarsi, per lo stesso servizio, al costo agevolato di 20,00 euro.Inoltre, presso gli uffici comunali è stato messo a di-sposizione dei cittadini un modulo pre-stampato per richiedere l’iscrizione all’anagrafe canina. Ultimata la raccolta delle richieste, il Comune ha contattato il responsabile Distretto Veterinario di Tre-score Balneario per concordare la data di esecuzione delle operazioni d’identificazione dei cani, indivi-duando un locale idoneo e il personale che avrebbe collaborato con il veterinario dell’ASL. Ai cittadini,

che si erano prenotati, l’Amministrazione Comunale ha inviato una comunicazione con indicato il giorno, l’ora e il luogo nel quale dovevano presentarsi con i loro cani per l’iscrizione all’anagrafe canina.

Terza fase: verifica.La Comunità Montana, in base alla delega, dopo aver verificato la congruità dei preventivi dei lettori, ha provveduto al loro acquisto e distribuzione a tutti i Comuni.Ultimate le operazioni d’identificazione di tutti i ca-ni, la polizia locale doveva svolgere verifiche sul ter-ritorio sanzionando i trasgressori. I comuni che non dispongono della polizia locale sono stati informati che la legge prevede che possono avvalersi, median-te convenzione, della collaborazione delle guardie volontarie delle associazioni con qualifica di guardia giurata o degli operatori volontari appartenenti alle associazioni (art. 20 della legge 16/2006).

Realizzazione del progettoPrima faseQuesta fase ha comportato l’organizzazione d’incon-tri per definire gli obiettivi del progetto e i tempi di attuazione.L’aspetto più impegnativo è stato quello di sensibiliz-zare i sindaci circa l’importanza di attuare il progetto, facendo leva sull’aspetto economico. Infatti, la legge prevede che ogni cane catturato dall’accalappiacani e non identificato deve essere mantenuto in un canile rifugio a carico del Comune sul cui territorio è stato trovato o catturato (costo annuo di circa 800,00 euro). I quattro ambulatori veterinari, presenti nel territorio della Comunità Montana Valcavallina, hanno aderito con entusiasmo all’iniziativa.

Seconda faseAnche questa fase si è svolta senza particolari diffi-coltà, soprattutto per la disponibilità di modulistica appositamente predisposta. Tutti i Sindaci hanno fatto pervenire alla Comunità Montana Valcavallina

Tabella 1. Elenco dei lettori acquistati dai comuni

Lettori Quantità Ente / ComuneAEG ID ARE H5 4 Casazza, Trescore, Endine Gaiano, Comunità Montana Valcavallina

PETSCAN RT 100 1 Bianzano

PETSCAN RT 100 1 Ranzanico e Spinone

PETSCAN RT 100 1 Gaverina

PETSCAN RT 100 1 Monasterolo del C.

PETSCAN RT 100 1 Grone

PETSCAN RT 100 1 Berzo San Fermo

PETSCAN RT 100 1 Borgo di T., Vigano San Martino, Luzzana

PETSCAN RT 100 1 Entratico

PETSCAN RT 100 1 Zandobbio

PETSCAN RT 100 1 Cenate Sopra


la comunicazione di adesione al progetto e la delega per l’acquisto dei lettori. Dopo l’affissione degli av-visi pubblici o dopo aver ricevuto la comunicazione per posta, i cittadini proprietari di cani non ancora identificati, si sono recati presso gli uffici comu-nali dove hanno compilato i moduli per richiedere l’iscrizione all’anagrafe canina. Scaduto il periodo per la presentazione delle domande gli uffici di ogni comune hanno comunicato al Servizio Veterinario dell’ASL l’elenco dei cani per i quali era stata pre-sentata richiesta d’identificazione. In questo modo il veterinario dell’ASL ha potuto programmare un nu-mero congruo di sedute. Per evitare assembramenti sono state inviate lettere di convocazione con orari scaglionati: quindici minuti per ogni cane da identi-ficare attraverso l’applicazione del chip.

Terza faseLa Comunità Montana ha provveduto ha richiedere i preventivi a tre ditte per l’acquisto dei lettori per microchip. Sono stati scelti e acquistati due tipi di lettori: AEG ID ARE H5 (professionale) e PETSCAN RT 100.Nei territori dei comuni dove opera lo stesso servizio di polizia locale è stato acquistato un solo lettore (Ranzanico e Spinone; Borgo di T., Vigano San Mar-tino, Luzzana).I lettori di tipo professionale (AEG ID ARE H5) sono stati acquistati dai tre comuni più popolosi (Ca-sazza, Trescore Balneario ed Endine Gaiano) e dalla Comunità Montana Valcavallina. Quest’ultimo, dota-to di prolunga, sarà utilizzato anche dal Corpo della Forestale, che svolge servizio di controllo e vigilanza sul territorio. Ultimate le operazioni d’identificazio-

ne dei cani in tutti i comuni della Comunità Montana Valcavallina, sono state convocate le polizie locali operanti in zona alle quali sono stati consegnati i lettori, spiegandone la modalità di utilizzo. E’ stata raccomandata l’importanza di iniziare i controlli sul territorio per individuare eventuali trasgressori.

A conclusione del progetto sono stati rilevati ed esa-minati i dati al fine di: – accertare il numero di cani identificati dal Servi-

zio Veterinario ASL in ogni comune;– conoscere il numero di cani identificati dagli am-

bulatori privati;– rilevare se le polizie locali e le guardie forestali

avessero attivato verifiche sul territorio;– conoscere il numero di sanzionati comminate;– evidenziare le criticità rilevate nella fase di attua-

zione del progetto.

Le operazioni di applicazione dei chip dei cani da parte del Servizio Veterinario dell’ASL sono iniziate a novembre del 2008 e si sono concluse ad aprile del 2009. Si deve precisare che, nonostante la raccolta delle richieste presso gli uffici comunali si fossero concluse da qualche tempo, nei primi quattro mesi le operazioni d’identificazione e applicazione dei chip dei cani hanno proceduto lentamente, poiché il DPV ha dovuto far fronte ad altre situazioni di emergenza. Per ovviare a questa contingenza, sono stati incaricati di collaborare al progetto sei Veterinari di Area A del Distretto di Trescore Balneario. Questi hanno dato grande impulso all’attività programmata, completan-do in soli due mesi (marzo e aprile) e in forma itine-rante l’applicazione dei chip su tutti i cani prenotati.

Tabella 2. Attività svolta dai comuni della Valcavallina.

COMUNEn. abitanti

(censimento anno 2001)

Polizia Locale

n. cani da identificare

con chip

N° cani identificati con chip

Cani prenotati ma non identificati con chip da

veterinario ASLBIANZANO 521 NO 29 20 9

LUZZANA 719 SI 17 17 0

GRONE 730 SI 27 27 0

SPINONE AL LAGO 825 SI 28 23 5

GAVERINA 906 SI 0 0 0

BORGO DI TERZO 933 SI 34 34 0

MONASTEROLO DEL C. 938 NO 7 7 0

VIGAN SAN MARTINO 989 SI 12 11 1

RANZANICO 1.088 SI 29 25 4

BERZO SAN FERMO 1.142 NO 69 62 7

ENTRATICO 1.452 SI 46 40 6

CENATE SOPRA 2.082 SI 95 86 9

ZANDOBBIO 2.281 SI 47 47 0

ENDINE GAIANO 3.100 SI 102 80 22

CASAZZA 3.478 SI 49 45 4

TRESCORE BALNEARIO 8.303 SI 36 25 11

TOTALE 626 549 77


Nello stesso periodo, nei quattro ambulatori dislocati in Valcavallina, sono stati identificati 260 cani cui è stato applicato il chip. Numerosi cittadini si sono re-cati presso ambulatori privati nonostante la differenza dei costi applicati rispetto al servizio pubblico attivato (12,46 euro vs 20,00 euro), sia per comodità sia perché le prenotazioni presso gli uffici comunali erano ormai esaurite. Dei 77 cani per i quali era stata presentata richiesta d’iscrizione all’anagrafe canina presso gli uffici comunali, 46 sono stati identificati presso gli ambulatori veterinari, i restanti 31 non risultano a tut-t’oggi ancora iscritti all’anagrafe canina.

La realizzazione del progetto nei comuni della Co-munità Montana Valle Cavallina non ha comportato particolari difficoltà e tutte le fasi si sono succedute con regolarità. La disponibilità di tempo richiesta ai dipendenti comunali è stata abbastanza contenuta e si è limitata all’affissione degli avvisi nelle bacheche comunali e/o al loro invio alle singole famiglie (soluzione ideale anche se più impegnativa e costosa), alla ricezione e raccolta delle richieste d’identificazione, all’invio degli inviti di convocazione, ad aiutare il veterinario nel contenimento dei cani (compito di solito svolto da un operatore ecologico), a seguire le pratiche di acquisto del lettore per i microchip.La criticità evidenziata nella realizzazione del pro-getto è stata la contestuale adesione e applicazione allo stesso di tutti i comuni. Infatti, un Comune, pur avendo aderito al progetto, si è limitato all’acquisto del lettore per microchip da mettere a disposizione della polizia locale, ma non si è preoccupato di informare la cittadinanza. Pertanto, a nessun cane di questo Comune è stato applicato il chip. Si è trattato di un comportamento scorretto nei confronti dei cittadini, sui quali sono ricadute eventuali responsabilità, e nei confronti dei comuni vicini, nei quali i cani vaganti possono sconfinare, essere catturati e mantenuti con conseguenti oneri economici.Per risolvere il problema riscontrato sarebbe suffi-ciente far applicare le seguenti norme:– ogni cane non identificato è di proprietà del Co-

mune sino a quando non è rintracciato il legittimo proprietario;

– come ogni proprietario deve rispondere dei danni

causati dal proprio cane, allo stesso modo ogni comune deve rispondere dei danni causati dai ca-ni non identificati presenti sul proprio territorio;

– ogni sindaco deve rispondere anche penalmente dei danni causati dai cani vaganti, se non dimostra di essersi attivato per informare correttamente la cittadinanza su quanto prevede la legge.

Modalità di informazione e comunicazioneNella realizzazione del progetto si è evidenziata l’importanza di adottare un sistema corretto d’infor-mazione.I migliori risultati si sono ottenuti inviando l’avviso a ogni singola famiglia, poiché i manifesti affissi nelle bacheche comunali spesso non sono letti, infatti, la minor adesione si è riscontrata nei comuni che si sono limitati alle affissioni pubbliche. Ad esempio, nel comune di Casazza in seguito ad avviso per af-fissione d’iscrizione dei cani all’anagrafe sono state raccolte richieste solo per sette cani. Approfittando della distribuzione del notiziario comunale si decise di inviare a tutte le famiglie un secondo avviso che prorogava la richiesta di registrazione di altri due mesi e per agevolare i cittadini venne allegato anche il modulo per richiedere l’applicazione del chip sul proprio cane. In pochi giorni sono pervenute agli uffici comunali 42 nuove richieste. Il numero di cani identificati presso gli ambulatori privati è in relazio-ne non solo alle modalità d’informazione (avviso pubblico e/o lettera a ogni famiglia), ma anche agli interventi di sensibilizzazione messi in atto dell’Am-ministrazione Comunale. Ad esempio, agli uffici del Comune di Endine Gaiano sono pervenute richieste per identificare 102 cani. Il veterinario dell’ASL ha applicato 80 chip, mentre i due ambulatori veterinari in zona hanno applicato il microchip a oltre 150 cani.Ciò è stato favorito dall’opera di sensibilizzazione da parte dell’unico addetto della polizia svolta presso le famiglie, con l’avviso che sarebbero state eseguite verifiche successive.

Il punto critico del progetto sono state le verifiche attuate dalla polizia locale e le sanzioni comminate. A questo proposito, il Servizio Veterinario dell’ASL si è limitato a verificare l’iscrizione in anagrafe dei cani morsicatori e di quelli accalappiati. In due co-

Tabella 3. Flusso di applicazione del chip nella popolazione canina della Valcavallina.

Cani su cui applicare il

chip

Cani con chip applicato

Cani prenotati presso gli uffici

comunali

Chip applicato da veterinari

dell’ASL

Chip applicato in 4 ambulatori

privati

Cani prenotati presso gli uffici comunali non ancora dotati di chip

840 809 626 549 260 31

100% 96,3% 74,52% 65,35% 30,95% 3,69%


muni (Bianzano e Berzo San Fermo) non è stata fatta alcuna verifica, poiché non esiste polizia locale. In base all’art. 20 della legge 16/2006, i due comuni avrebbero potuto avvalersi della collaborazione in convenzione di guardie volontarie delle associazioni con qualifica di guardia giurata o degli operatori volontari appartenenti alle associazioni. A questo riguardo, la provincia di Bergamo, nonostante le ri-chieste presentate dalle Associazioni, non ha ancora attivato corsi specifici a frequenza obbligatoria per conseguire la qualifica. Inoltre, la Provincia deman-da alla Regione Lombardia ogni responsabilità in merito. D’altra parte, anche la polizia locale degli altri 14 comuni ha eseguito un numero limitato di verifiche (solo su 14 cani). In sintesi, è da rilevare che da quando è stata abolita la tassa sulla proprietà del cane, i Comuni hanno cessato di far eseguire verifiche.

Conclusioni Il progetto, per la semplicità di attuazione e per i costi irrisori a carico delle Amministrazioni Comunali, ga-rantisce in poco tempo l’identificazione e l’iscrizione in anagrafe di tutti i cani presenti su vasti territori. Condizione indispensabile è che tutti i comuni aderi-scano e che siano eseguite le dovute verifiche per co-stringere i proprietari dei cani al rispetto della legge. Purtroppo il problema dei cani “randagi e vaganti” non è sempre sentito come rilevante da parte delle Amministrazioni Comunali. La legge 281/91 non attribuisce al sindaco una responsabilità diretta per i

danni causati dai cani vaganti o randagi non iscritti all’anagrafe canina facendoli invece ricadere inevita-bilmente ed esclusivamente su chi li ha subiti.La legge prevede che le Amministrazioni Comunali eseguano controlli per verificare il rispetto del-l’obbligo dell’iscrizione all’anagrafe sanzionando i trasgressori. Il poter richiedere al Comune il risarci-mento dei danni causati dai cani vaganti e randagi fa-rebbe perdere all’autorità competente quell’immunità di cui ha sempre goduto. L’emanazione dell’ordinan-za contingibile e urgente del 6 agosto 2008 dispone che il sindaco è responsabile dell’identificazione e registrazione in anagrafe di tutti i cani rinvenuti o catturati nel territorio comunale e non correttamente identificati, animali che devono essere mantenuti a spese del Comune in canili rifugio. Nello stesso tem-po per individuare i cani non ancora iscritti all’ana-grafe canina, oltre alle verifiche sul territorio da parte della polizia locale e dei veterinari dell’ASL, sarebbe molto utile obbligare i Veterinari liberi professionisti a riportare in fattura il numero d’identificazione (ta-tuaggio o microchip) di ogni cane al momento della vaccinazione o della visita, ma anche questa proposta si scontra con interessi di categoria.Il progetto, attuato nella Comunità Montana Valca-vallina, avrebbe dovuto prevedere anche l’esecuzio-ne d’interventi di sterilizzazione da eseguirsi presso gli ambulatori veterinari privati. I sindaci, quasi tutti alla fine del loro mandato amministrativo, hanno pre-ferito non attuare questa fase del progetto nonostante rivesta un ruolo strategico. Inoltre, per evitare gravidanze indesiderate nelle cani femmina di cittadini appartenenti alle fasce deboli (pensionati, indigenti, invalidi, etc.) i Comuni avreb-bero dovuto mettere annualmente a bilancio una quota di 50,00 euro ogni 500 abitanti per contribuire al costo degli interventi di sterilizzazione. Il citta-dino, residente in uno dei comuni della Comunità Montana Valcavallina, intenzionato a far sterilizzare una cagna, avrebbe dovuto presentare richiesta di contributo al comune di residenza allegando l’atte-stazione ISEE con un indicatore pari o inferiore a 7.500,00 euro. Una volta effettuata la sterilizzazione, il cittadino, presentata la fattura quietanzata rilascia-ta dall’ambulatorio veterinario convenzionato (che a sua volta avrebbe praticato uno sconto del 15%), avrebbe ricevuto dal Comune 50,00 euro. Una volta esaurita la somma a disposizione per l’anno in corso, il Comune avrebbe sospeso i contributi e li avrebbe erogati nuovamente l’anno successivo.

1.Veterinario ASL di BergamoLa modulistica utilizzata nel progetto è a disposizio-ne presso l’Autore dell’articolo

Tabella 4. Numero dei controlli effettuati con lettore di chip, suddiviso per comune della Val-cavallina.

Comunen. controlli

effettuati da polizia locale

n. sanzioni

LUZZANA 0 0

GRONE 0 0

SPINONE AL LAGO 1 0

GAVERINA 0 0

BORGO DI TERZO 0 0

MONASTEROLO DEL C. 0 0

VIGAN SAN MARTINO 0 0

RANZANICO 1 0

ENTRATICO 0 0

CENATE SOPRA 5 0

ZANDOBBIO 1 0

ENDINE GAIANO 0 0

CASAZZA 2 0

TRESCORE BALNEARIO 4 0

TOTALE 14 0

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICA · Ricco di Piastrine (PRP) o Plasma Povero di...

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