Anno 11 - n. 4 - Agosto 2008

Regione LombardiaDirezione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentaledella Lombardia e dell’Emilia RomagnaOsservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICAa cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

Sommario

Direttore responsabileStefano Cinotti

Direttore scientificoGiorgio Zanardi

RedattoreGiorgio Zanardi

Responsabile comitato redazioneGiorgio Zanardi

Comitato di redazioneM. Astuti, P. Cordioli, M. Domenichini, P. Antoniolli, L. Gemma, C. Genchi, G. Gridavilla, A. Lavazza, A. Palma, V.M. Tranquillo

Hanno collaborato a questo numeroG. Zanardi

Segreteria di redazioneM. GueriniL. Marella

FotocomposizioneEditrice Vannini - Gussago (BS)

EditoreIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia ed Emilia Romagna “Bruno Ubertini”

Tutti coloro che vogliono scriverci, devono indirizzare le lettere al seguente indirizzo:“L’OSSERVATORIO” rubrica “La posta dei lettori”,via Bianchi, 9 - 25124 Brescia - tel. 030 2290259-235;oppure utilizzare la posta elettronica: oevr@oevr.org

L’Osservatorio e i numeri del precedente Bollettino Epidemiologicopossono essere consultati anche sul sito web http:\\www.oevr.org

MONOGRAFIA

4 Rassegna sulla diagnosi ante-mortem di tubercolosi nel bovino Recensione a cura di G. Zanardi tratta dall’articolo di R. De la Rua-Domenech et al. (2006). Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests, y-interferon assay and other

ancillary diagnostic techniques. Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210

Anno 11 - n. 3 - Giugno 2008

Regione LombardiaDirezione Generale Sanità - Servizio Veterinario

Istituto Zooprofilattico Sperimentaledella Lombardia e dell’Emilia RomagnaOsservatorio Epidemiologico Veterinario Regionale - Via Bianchi, 9 - 25124 Brescia

RIVISTA BIMESTRALE D’INFORMAZIONE SCIENTIFICAa cura dell’Osservatorio Epidemiologico Veterinario della Regione Lombardia

3 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

Editoriale

Ho ritenuto interessante ed utile tradurre l’articolo che potete visionare su questo numero, poiché

il Centro di referenza Nazionale della Tubercolosi bovina da M. bovis, che ha sede a Brescia presso

l’IZSLER, è soventemente interpellato nell’esprimere pareri sulla sensibilità e specifi cità delle prove

in vita che possono essere utilizzare per diagnosticare la tubercolosi.

Dal 2007 le regioni Calabria, Campania, Puglia e Sicilia sono impegnate ad applicare il piano

straordinario d’eradicazione previsto dall’Ordinanza del Ministero della Salute del 14 novembre

2006; nel frattempo si sono manifestate tre gravi recrudescenze di tubercolosi bovina nella provincia

autonoma di Trento e nelle regioni autonome di Sardegna e Valle d’Aosta, tutte uffi cialmente indenni

da TB da diversi anni. Le attività mirate al rilievo e all’estinzione dei focolai sono ancora in corso e

la risoluzione del problema sanitario non appare a breve termine.

Pur nelle peculiarità delle singole autonomie, il fattore che accomuna gli episodi è il diradamento

dell’esecuzione delle prove intradermiche con la tubercolina (IDT) a due e anche quattro anni, as-

sociato alla fallacia del sistema di sorveglianza al macello e all’insuffi ciente controllo degli animali

movimentati. La promiscuità al pascolo, tipico in tutte tre le realtà colpite, ha contribuito alla dif-

fusione della malattia. Il problema in queste situazioni apparentemente tranquille da anni è che la

tubercolosi bovina viene rilevata, quando ormai è presente e circola sul territorio da molto tempo;

per le caratteristiche subdole della malattia, defi nire la sua reale diffusione per cercare d’eradicarla

tempestivamente è un’operazione onerosa e che richiede tempo. Inoltre, la gestione dei focolai in

realtà montane e di pascolo con allevamenti di dimensioni medio-piccole è più complessa e richiede

un deciso intervento dell’autorità regionale, anche in termini di sostegno agli allevatori nelle fasi

d’abbattimento dei capi.

In ogni caso, il tempestivo ricorso all’esecuzione dell’IDT su tutti i bovini, eventualmente associata

all’uso del γ interferon nei focolai è imprescindibile sulla strada dell’eradicazione. L’ispezione al

macello (al di fuori dei territori colpiti), ancora una volta, ha evidenziato, seppure in ritardo, la

malattia sul territorio e rappresenta il punto di controllo cardine in un territorio uffi cialmente in-

denne.

Da ultimo, si sottolinea che la diagnosi tubercolosi bovina non è mirata al singolo capo ma all’alle-

vamento e come tale, deve essere integrata dalla sua storia anamnestica, che emerge dall’indagine

epidemiologica.

Giorgio Zanardi

Sanità animale 4 ’OSSERVATORIOL

Rassegna sulla diagnosi ante-mortem di tubercolosi nel bovino

recensione a cura di G. Zanardi, tratta dall’articolo di R. de la Rua-Domenech et al. (2006). Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests,

γ-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques. Research in Veterinary Science, vol. 81, issue 2, 190-210

IntroduzioneIl controllo della tubercolosi (TB) bovina da Myco-bacterium bovis è basato sull’accurata rilevazione e rimozione degli animali infetti. Questi ultimi posso-no essere infettanti per lungo tempo prima di mani-festare segni clinici o lesioni tipiche tubercolari. I segni clinici non sono patognomonici ed è per questa ragione che si ricorre a test immunodiagnostici per rilevare gli animali infetti ad uno stadio precoce.La risposta immunitaria cellulo-mediata all’infe-zione intra-cellulare dei macrofagi e di altre cellule monocitiche rappresenta un meccanismo di difesa e la causa dell’infi ammazione cronica (granuloma), caratteristica dell’infezione da M. bovis. Alti livelli di anticorpi circolanti contro M. bovis si riscontrano solo negli stadi avanzati d’infezione o in caso di ele-vate dosi infettanti.Perciò, i test ante-mortem basati sull’immunità cel-lulare individuano animali infetti con M. bovis più precocemente e con maggior sensibilità rispetto ai test basati sul rilievo degli anticorpi.La diagnosi di tubercolosi è fatta con due test appro-vati dall’Unione Europea: il test tubercolinico intra-dermico in vivo e quello in vitro (γ-interferon o γ-IFN su sangue). Il primo rileva la reazione d’ipersen-sibilità di tipo ritardato all’iniezione intradermica di tubercolina, mentre il secondo evidenzia il rilascio di γ-IFN in colture di sangue totale stimolate dalla tu-bercolina usando la tecnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).Il test intradermico o skin test)o intradermotuber-colinizzazione (IDT) e sue varianti è quello usato di routine nei paesi che implementano programmi d’eradicazione della TB. L’IDT è, inoltre, prescritta dall’OIE come test ante-mortem per il commercio in-ternazionale di bovini.Generalmente, il test intradermico lavora bene nel-l’identifi care i bovini infetti, anche se non è perfetto; d’altra parte, esso rimane il miglior strumento dia-gnostico di screening da quando Koch scoprì la tu-bercolina.I programmi basati sul principio del sistematico e regolare controllo con il test intradermico, accompa-gnato dalla macellazione dei reattori, dalla restrizione

alle movimentazioni degli allevamenti infetti e dalla sorveglianza al macello per le infezioni non rilevate, hanno eradicato la TB in molti paesi sviluppati, come l’Australia e la maggior parte dei paesi europei, Sviz-zera, Canada e quasi tutti gli stati degli USA. In altri paesi il completo controllo della malattia con il tra-dizionale approccio del “test e macellazione” è stato vanifi cato dall’esistenza di reservoirs selvatici di M. bovis, dallo stato di free-range di alcuni allevamenti, da inadeguate infrastrutture veterinarie, fondi insuffi -cienti per il funzionamento del programma.A causa delle dinamiche di trasmissione di M. bovis, delle dimensioni microscopiche delle lesioni iniziali e del tempo necessario per un animale nel manife-stare una risposta immune rilevabile, non ci si può attendere che qualunque test singolo ante (o post) mortem per TB, di per sé, rilevi ogni allevamento in-fetto e ogni animale infetto in tali allevamenti.Nel corso degli anni diversi fattori hanno compro-messo la capacità del test tubercolinico di identifi care gli animali infetti (sensibilità) o di aumentare la pro-babilità di risultati falsi positivi (i.e. ridotta specifi -cità). Di conseguenza, sono stati sviluppati una serie di test ancillari, come il γ interferon, a complemento dello skin test con due principali obiettivi strategici:• migliorare la probabilità totale di rilevare bovini

tubercolotici (sensibilità) in regioni o allevamenti con elevata incidenza di TB, rimuovendo i bovini positivi ad entrambi i test (test in parallelo);

• aumentare la specifi cità totale del test negli ultimi stadi della campagna d’eradicazione, in aree a bas-sa incidenza di TB, o in regioni con alta incidenza di bovini con reazioni aspecifi che al test tubercoli-nico, rimuovendo solo i bovini che risultano positi-vi ad entrambi i test (test in serie).

Altri test ancillari in vitro, come il test ELISA per anticorpi, il test di proliferazione linfocitaria, la pola-rizzazione fl uorescente e il “naso elettronico”, sono stati sviluppati per i bovini, ma la loro applicazione rimane confi nata a livello sperimentale o in situazio-ni molto specifi che.Lo skin test rimane la pietra miliare nella diagnosi di routine di TB nei bovini, in altri animali domestici e nell’uomo.

5 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

Il test intradermico tubercolinico (skin test)

Sviluppo e principi immunologici dello skin testIl test intradermico è uno standard internazionale per la diagnosi ante mortem della tubercolosi bovina a livel-lo di allevamento e di animale. Esso è basato sull’evo-cazione di una risposta immunitaria d’ipersensibilità ritardata ad un’inoculazione intradermica di tuberco-lina, un estratto grezzo proteico dal sur-natante di col-ture di micobatteri. Dai tempi dell’estratto al glicerolo di colture liquide pure di bacilli tubercolari di Robert Koch nel 1890, si è giunti all’uso mondiale della tu-bercolina derivata da proteina purifi cata (PPD).Quando la tubercolina bovina è inoculato nel derma di un animale non sensibilizzato agli antigeni tuber-colari, non vi è alcuna signifi cativa risposta infi am-matoria a livello locale. Al contrario, se l’animale è sensibilizzato Da una pregressa infezione con M. bovis o dall’esposizione ad antigeni cross-reagenti, si sviluppa una risposta infi ammatoria ed un edema nel sito d’inoculazione, che raggiunge la più grande intensità dopo 48-72 ore dopo l’iniezione e in seguito regredisce rapidamente. Questa ipersensibilità ritar-data è mediata dalle cellule T sensibilizzate, che si attivano alcune settimane dopo l’infezione.Vi sono due tipi di test intradermico, singolo (SIT = single intradermal test) e comparativo (SICCT = sin-gle intradermal comparative cervical tuberculin), con iniezione simultanea di tubercoline aviare e bovina. Quest’ultimo test consente una miglior discrimina-zione del SIT tra animali infetti con M. bovis e quelli sensibilizzati perché esposti a M. avium complex o a micobatteri ambientali non patogeni.La scelta del tipo di test intradermico dipende dalla prevalenza di TB e dalla prevalenza d’esposizione ad altri micobatteri ambientali.Il SIT caudale è il test di routine per lo screening di TB negli USA, nel Canada, in Nuova Zelanda ed è stato usato con successo per eradicare la malattia in Austra-lia, mentre in Europa è utilizzato quello cervicale. In tutti i paesi il SICCT è usato come test seriale ancillare per i reattori o per i reattori in conclusivi al SIT, anche se gradualmente il γ interferon lo sta sostituendo.Al contrario, nel Regno Unito e in Irlanda viene adot-tato il SICCT come test di screening, utilizzando la tubercolina bovina di Weybridge.

Accuratezza diagnostica della prova intradermicaL’accuratezza diagnostica di un test è defi nita in ter-mini di sensibilità e specifi cità, rispettivamente cal-colate come proporzione di animali infetti e non in-fetti, correttamente diagnosticati.Questi due parametri possono essere infl uenzati dallo stadio e dalla gravità della malattia, dalla prevalenza degli organismi che cross-reagiscono e da altri fattori legati all’ospite.

La percentuale di risultati positivi o negativi al test che è corretta (valori predittivi) è fortemente infl uen-zata dalla prevalenza d’infezione da M. bovis.

SensibilitàLa sensibilità (Se) è la proporzione di animali am-malati (infetti) rilevati come positivi dal test diagno-stico. Il contrario della sensibilità è la proporzione di falsi negativi (1 – Se).Nella tabella 1 sono elencati i motivi per i quali pos-sono verifi carsi reazioni false negative alla prova in-tradermica. I bovini infettatisi recentemente di solito non reagiscono all’inoculazione intradermica della tubercolina. L’ipersensibilità nel bovino si sviluppa tra 1 e 9 settimane dopo l’infezione con M. bovis, ma per la maggior parte degli animali la risposta piena si sviluppa più probabilmente tra le 3 e le 6 settimane post-infezione.La durata della fase pre-allergica è stata determinata re-centemente con un’infezione sperimentale di 104 UFC di M. bovis per via endonasale in 20 vitelli, che hanno dimostrato reattività al SICCT tre settimane dopo il challenge, confermata dopo 4, 6, 7, 8, 9 settimane.In altri esperimenti condotti nel Regno Unito non è stata trovata alcuna correlazione tra dose infettante di M. bovis e il periodo impiegato a sviluppare una reazione all’inoculazione intradermica di tuberco-lina. Comunque, c’è un’associazione positiva tra le dimensioni della risposta alla prova intradermica e la probabilità e l’estensione della patologia tubercolare al macello.Uno stato di energia si può sviluppare con tuberco-losi avanzata o generalizzata e temporaneamente in soggetti stressati. Bovine tubercolotiche che hanno fi gliato nelle 4-6 settimane precedenti talvolta non reagiscono al test tubercolinico.Somministrazione topica o sistemica di glicocorti-coidi può portare a una signifi cativa riduzione delle dimensioni della reazione in animali infetti. Co-in-fezioni con virus immuno-depressivi come il BVD possono avere un effetto d’eclisse transitoria sul test.Altre cause di false negatività possono essere imputa-te a malnutrizione, che deprime il sistema innunitario, e ala desensibilizzazione con una seconda iniezione ravvicinata (al di sotto di 42 giorni) di tubercolina. Come per tutti i test, gli errori degli operatori (e.g. inoculazione non intradermica, lettura troppo preco-ce o ritardata della reazione) o il malfunzionamento dell’attrezzatura (e.g. dose inoculata insuffi ciente) possono condurre a false negatività. Infi ne, una pre-cedente esposizione al M. avium intracellulare com-plex può mascherare temporaneamente la reazione intradermica e il γ IFN test. Possibili soluzioni alle implicazioni sul campo nella sorveglianza della TB in regioni dove l’infezione da M. avium è comune

Sanità animale 6 ’OSSERVATORIOL

sono quella di ignorare reazioni alla tubercolina avia-re o usare il SIT con una diminuzione, però, della specifi cità del test. L’uso nel γ IFN d’antigeni espres-si solo da membri del MTB complex aumenterebbe la probabilità di identifi care gli infetti con M. bovis, precedentemente esposti a M. avium.Per ottenere un’accurata stima della sensibilità tutti gli animali testati, sia positivi che negativi al test, dovreb-bero essere macellati e sottoposti ad ulteriori test.Stime di sensibilità per il SIT caudale e cervicale e il SICCT riportate in diversi paesi sono riassunte nelle tabelle 1 e 2.Queste stime variano da 63,2% a 100% per il SIT caudale e cervicale con un valore mediano di sensibi-lità di 83,9%. Il SIT cervicale appare più sensibile e meno specifi co di quello caudale (tabella 1).

Gli studi eseguiti per valutare la sensibilità del SICCT hanno impiegato numeri contenuti di animali selezio-nati da popolazioni con alta prevalenza di reattori. I risultati (tab. 3) suggeriscono che la Se di SICCT si ponga tra 52,0% e 100% con valori mediani di 80,0% (interpretazione standard) e 93,5% (interpretazione restrittiva).

Specifi citàLa specifi cità (Sp) è la proporzione di animali sani (non ammalati, non infetti), che sono correttamente identifi cati come negativi dal test diagnostico. Come per tutti i test, anche per la prova intradermica non esiste una Se e Sp del 100% e tra loro vi è un rap-porto inversamente proporzionale. La SIT ha una Sp che varia dal 75,5% al 99,0% (mediana del 96,8%) (tabella 2).

Tabella 1. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità me specifi cità del SIT nei bovini, in ordine cronologico di pubblicazione.

Tipo di test

tubercoli-nico

Quantità di PPD bovina

N° animali testati (o sot-toposti a ne-

croscopia)

Proporzione apparente di

malati

Sensibili-tà %

Specificità %

Referenze (paese)

SIT caudale 0,2-0,4 mg 3.955 (2.967) 3,4 72,0 98,8 Francis et al. (1978)

(Australia)

0,3 mg 6.264 (6.264) 1,39 63,2 99,0 Wood et al. (1991) (Australia)

0,2-0,3 mg 1.362 (1.362) 1,6 68,2 96,8 Wood et al. (1992) (Australia)

0,1 mg 656 (656) 31,1 80,4-84,4

Nonvalutato

Whipple et al. (1995) (USA)

0,1 mg 494 (494) da 7 allevamenti

1,1-5,5 (all. a bassa P)

23,1-32,6 (all. a moderata P)

83,3

96,8

Nonvalutato

Norby et al. (2004) (USA)

SIT cervicale 0,1 mg 10.305 0,56 100 88,6 Lesslie et al. (1975)

(GB)

anche PPD umana 2.949 (2.949) 51,8 91,2 75,5

Media da 5 fonti da vari paesi (citati in

Francis et al., 1978)Dettaglio

non disponibile

1.036 (140) 10,7 91,0 Non valutato

Domingo et al. (1995) Spagna

Dettaglio non

disponibile232 (218) 57,8 80,2 Non

valutato

Gonzales Llama-zareset al. (1999)

(Spagna)

0,1 mg 22 (22)*10 (10)**

1000,0 86,4 90,0 Pollock et al. (1999)

(2003) (Nord Irlanda)

Dettaglio non

disponibile

800 (35) da 20 all. U.I. 0,0 Non

valutato 96,8 Cagiola et al. (2004) (Italia)

Legenda:* per stimare la sensibilità** per stimare la specifi cità

7 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

Tabella 2. Riassunto dei risultati di trial di campo condotti per stimare la sensibilità e specifi cità del SICCT nei bo-vini, in ordine cronologico di pubblicazione.

PPDbovina

PPD aviare

N° animali testati (o

sottoposti a necroscopia)

Proporzione apparente di

malati

Interpretazione del test

Sensibilità %

Specificità %

Referenze (paese)

Usati in serie per ri-testare i

sospetti entro 7 giorni dal SIT

StandardSevera

74,488,5

Roswurm and Konya (1973)

citato da Norby et al.

(2004)

0,2 mg 0,05 mg1.110 (0) in 25 all. UI

0,0Dettagli nondisponibili

non valutata

100Lesslie et al.

(1975)

0,1 mg 0,05 mg 1.035 (88) 0,56StandardSevera

91,4100

99,9Lesslie et al.

(1975)

0,1 mg 0,05 mg671 (316)*500 (107)**

15,0 Standard 95,5 97,8O’Reilly and MacClancy

(1975)

Vari, inclusa

PPD umana

vari1.425 (1.425)

36,9 Severa 68,6 88,8Citato da

Francis et al. (1978)

0,1 mg 0,05 mg 270 (68) 25,2StandardSevera

75,094,1

O’Reilly (1986)

0,1 mg 0,05 mg2.799 (192)*1.396 (0)**

6,4StandardSevera

55,1 100Neill et al.

(1994) (Nord Irlanda)

0,1 mg 0,05 mg 18 (18) 83,3StandardSevera

93,3100

non valutata

Doherty et al. (1995) (Irlanda)

0,1 mg 0,05 mg 258 (258) 14,0 Standard 90,9non

valutataCostello et al. (1997) (Irlanda)

2.000 UI 2.500 UI 30 zebu (30) 73,3 Standard 90,9 100Ameni et al.

(2000) (Etiopia)

5.000 UI 2.500 UI

84 (84) bovini

negativi al clturale,

reattori al SIT caudale

0,0 StandardNon

valutata94,0

Buddle et al. (2001) (Nuova

Zelanda)

2.000 UI 2.500 UI

100 (100) zebu

(gruppo a moderata P)

22 (22) (gruppo ad

alta P)

21,0

43,5

Giudizio soggettivo

(palpazione del punto di inoculo e osservazione

segni clinici)

52,0

80,0

99,0

100

Quirin et al. (2001)

(Madagascar)

0,1 mg 0,1 mg494 (494) in

7 all.

1,1-1,5 (all. a bassa P)23,1-32,6

(all. a moderata P)

Usato come test in serie

per ri-testare i sospetti al SIT caudale

entro 7 giorni (interpretazione

75,0

93,5

Non valutata

Non valutata

Norby et al. (2004) (USA)

Legenda:* per stimare la sensibilità** per stimare la specifi cità

Sanità animale 8 ’OSSERVATORIOL

Studi eseguiti su popolazioni bovine libere da TB la Sp del SICCT variava dal 78,8% al 100% (mediana del 99,5%) (tabella 3). La Sp del SICCT raggiungeva il 99,9% in zone dove la prevalenza di TB tendeva allo zero (sulla base dell’esame post-mortem).L’imperfetta Sp conduce a falsi positivi, conosciuti anche come “reattori non specifi ci” (RNS). Le cau-se sono complesse e molti batteri sono implicati, che condividono antigeni proteici con la tubercolina PPD (tabella 4).Nel test intradermico comparativo gli animali infetti con micobatteri diversi da quelli appartenenti al MTB complex in genere sviluppano reazioni alla tuberco-lina aviare molto più evidenti di quelle causate dalla tubercolina bovina. Su questo fenomeno si basa la so-luzione di molti problemi di aspecifcità legate al SIT. Ad ogni modo, è possibile che la tubercolina aviare sia uguale o ecceda quella bovina in una piccola pro-porzione di bovini naturalmente infetti con M. bovis, i quali presentano lesioni al macello. La soluzione a lungo termine per discriminare la sensibilizzazione

non specifi ca sarebbe l’utilizzo nel test d’antigeni pu-rifi cati specifi ci per M. bovis.

Signifi cato epidemiologico dei reattori con lesioni non visibili (NVL = non-visible lesions reactors).Nel Regno Unito e in Irlanda circa il 50-80% dei bo-vini reattori allo skin test non mostra segni di malattia al macello (NVL e mancato isolamento di M. bovis in coltura). Sembrerebbe, perciò, che la Sp del test sia molto più bassa delle valutazioni fatte sul cam-po. Questo, naturalmente, indebolisce la fi ducia dei veterinari di campo e degli allevatori nella prova in-tradermica e in altri metodi diagnostici ante-mortem (γ IFN). Questa percezione, tuttavia, origina da due fraintendimenti. Il primo è l’assunzione erronea che l’esame post-mortem e la coltura batteriologica sono “gold standards” contro i quali si dovrebbe stabilire l’accuratezza dei test immunodiagnostici per TB. Diversi autori hanno già sottolineato che l’esame post-mortem (particolarmente quello condotto in grandi macelli) e i test batteriologici standard per

Tabella 3. Potenziali cause di risultati falsi negativi ai test tubercolinici nel bovino (adattato da Snider, 1982)

Fattori legati all’animale• De-sensibilizzazione alla tubercolina bovina (test eseguito a distanza troppo ravvicinata dalla precedente

prova intradermica) • Periodo non reattivo (pre-allergico) (esecuzione del test troppo precoce dal momento dell’infezione)*• Infezione con M. bovis iperacuta o generalizzata (anergia)*• Co-infezione con (o pre-esposizione a micobatteri ambientali (e.g. M. avium-intracellulare complex) che

causano ipersensibilità alla tubercolina aviare nei test SICCT e IFN*• Vaccinazione contro Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (malattia di Johne)* e **• Infezione concorrente con virus che deprimono il sistema immunitario (e.g. BVD)* e **• Farmaci (e.g. corticosteroidi e agenti immunosoppressivi)*• Immunosopressione nel primo periodo post-partum*• Stress nutrizionali o da trasporto* • Ceppo di M. bovis*

Fattori legati alla tubercolina usata• Prodotto scaduto*• Conservazione inappropriata del prodotto (esposto alla luce e calore per lunghi periodi di tempo)*• Errori di produzione (uso di ceppi inadeguati, non corretta calibrazione della potenza, etc.)*

Fattori legati al metodo di somministrazione, lettura e registrazione del test (errori degli operatori do-vuti ad inesperienza, mancanza di attenzione, scarsa manutenzione dell’attrezzatura, etc.)• Inoculazione di una dose insuffi ciente di tubercolina• Iniezione sottocutanea di tubercolina• Sito di inoculazione non corretto• Inoculazione di tubercolina bovina nel sito della tubercolina aviare e viceversa (SICCT test)• Lettura dei risultati troppo precoce o troppo tardiva (non entro le 72 h ± 4-6 h dopo l’inoculazione della

tubercolina)• Errori nella registrazione delle letture• Errori nell’identifi cazione degli animali che reagiscono• Distorsioni consce o inconsce dell’operatoreLegenda: * applicabile anche al IFN e ad altri test in vitro che rilevano risposte cellulo-mediate alla tubercolina bovina** potenziale causa anche di risultati falsi positivi

9 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

M. bovis (che rilevano la malattia tubercolare) sono meno sensibili dei test immunologici (che rilevano spesso un’infezione sub-clinica, i.e. la risposta im-munitaria cellulo-mediata contro il batterio).Il secondo equivoco è l’insuffi ciente apprezzamento della differenza tra il tasso di falsi positivi (“dato che un animale non è infetto, qual è la probabilità che il test sarà positivo?”) e il valore predittivo di un risul-tato positivo al test (“dato che l’animale che ho con-trollato è positivo, qual è la probabilità che l’animale sia veramente infetto?”). Il primo è l’inverso della specifi cità del test, mentre l’ultimo è una funzione della Se, Sp e della prevalenza vera dell’infezione nella popolazione (che raramente è conosciuta). Qua-lunque test di screening per TB con meno del 100% di Sp classifi cherà, per defi nizione, degli animali come falsi positivi, che, naturalmente, non avranno lesioni visibili (NVL) e risulteranno negativi all’esa-me colturale.Nondimeno, è importante non confondere tutti i reat-tori NVL con i veri reattori non specifi ci (falsi po-sitivi) (NSR = non-specifi c reactors). Mentre i NSR saranno NVL per defi nizione, non tutti gli NVL, reat-tori negativi all’esame colturale sarebbero necessa-riamente considerati come NSR.I reattori NVL originano per molteplici ragioni e il loro signifi cato dipende dalla specifi cità intrinseca del test, dallo stadio della campagna d’eradicazione della TB, dall’accuratezza dell’esame dei reattori al macello, dal tempo d’inizio dell’infezione, dalla dose infettante, dalla prevalenza di TB e dal numero di reattori trovati nell’allevamento controllato.Gli animali NVL possono, perciò, essere indicativi di:• animali ad uno stadio precoce d’infezione con M.

bovis, quando i granulomi sono troppo piccoli o in-frequenti per essere notati durante l’esame ispetti-vo post-mortem;

• animali infetti con M. bovis, ma senza malattia, i.e. temporaneamente capaci di contenere i bacilli in una condizione di latenza (sebbene la natura e l’estensione della TB latente nei bovini richieda ul-teriori ricerche);

• animali non-infetti esposti ad antigeni di micobat-teri ambientali che cross-reagiscono con la tuberco-lina bovina o altri antigeni di M. bovis usati nei test diagnostici ante-mortem (i.e. veri “falsi positivi o NSR”).

In regioni dove la TB bovina è endemica o in alle-vamenti in cui la presenza della malattia è già stata confermata da esami post-mortem o di laboratorio, i reattori alla tubercolina sono molto predittivi d’infe-zione da M. bovis e, a quel punto, è insignifi cante se sono o no NVL.Al contrario, analogamente alla diminuzione della prevalenza di TB, anche il valore predittivo di una

prova intradermica positiva ( o γ IFN) declina e gran-di proporzioni di risultati positivi al test deriveranno da sensibilizzazioni non specifi che dei bovini ad an-tigeni di M. bovis (NSR).In tali casi, può essere raccomandata l’applicazione di test ancillari da usare in serie, al fi ne di chiarire lo stato dei reattori alla tubercolina.In sintesi, il “problema” dei reattori NVL non è lega-to ad una scarsa specifi cità della prova tubercolinica, ma ad un inadeguato gold standard e ad un basso va-lore predittivo del risultato positivo al test, quando si controlla una popolazione libera da TB o con una bassa prevalenza d’infezione.

“Un buon test d’allevamento, ma non per l’animale”Una delle teorie avanzate per spiegare la mancanza di progressi nell’eradicazione della TB dal Regno Unito e dall’Irlanda e in altri paesi è l’imperfetta Se del test SICCT. Con altre prove intradermiche, esso è descritto come un buon test d’allevamento, ma scar-so nell’individuare singoli animali infetti. Il fatto è che ogni test diagnostico, non solo quello intrader-mico) che viene applicato al singolo animale, avrà una chance maggiore di individuare gruppi infetti di animali rispetto ad animali infetti controllati singo-larmente. Ciononostante, è stato ipotizzato che l’uso routinario di un test di screening con una Se imper-fetta può portare ad un gruppo sostanziale d’infezioni non rilevate negli allevamenti britannici.A questo punto, è importante non trascurare alcune importanti caratteristiche dei programmi di controllo della TB nei paesi sviluppati.La sensibilità a livello d’allevamento (Herd-level sensitivity o HSe) o la probabilità che un allevamento infetto sia identifi cato come tale dal test di screening è una funzione della prevalenza all’interno dell’alle-vamento (within-herd prevalence), il numero di ani-mali controllati in allevamento, la Se del test a livello di singolo animale e il numero minimo di singoli ani-mali positivi al test richiesto per classifi care un alle-vamento come infetto (uno, nel caso della TB).HSe aumenterà rapidamente al massimo livello (100%) nel momento in cui il numero di animali te-stati nell’allevamento aumenta. Questa correlazione è vera, anche se la prevalenza di malattia all’interno dell’allevamento è bassa o moderata e la Se indivi-duale del test è lontana dall’essere perfetta. In Gran Bretagna, per esempio, l’80% e il 75% di tutti i nuo-vi focolai confermati scoperti nel 2002 e nel 2003 contenevano un totale di due o più reattori. Inoltre, il test annuale in aree endemiche per TB era eseguito su tutti gli animali oltre le sei settimane di vita. Perciò, l’HSe della prova intradermica è molto più elevata ri-spetto alla Se calcolata a livello del singolo animale.In accordo con i protocolli UE sui test, la prova in-

Sanità animale 10 ’OSSERVATORIOL

Tabella 4. Riassunto dei risultati di studi pubblicati sulla sensibilità e specifi cità del IFN (Bovigam®) nel bovino, in ordine cronologico di pubblicazione

Tubercolina bovina (mg/

ml)

Tubercolina aviare (mg/

ml)

Criteriod’interpre-

tazione del test

N° testati(o sottoposti a necroscopia)

Propor-zione

apparenste di

malati (%)

Sensi-bilità (%)

Speci-ficità (%)

Referenze(paese di studio)

0,3 0,3 C4 6.264 (6.264) 1,4 81,6 99,4Wood et al.

(1991) (Australia)

0,3 0,3

C1C2C3C4C5

5.733 (0) bovini da all. UI da 5 anni

0,0Non

valutata

96,297,498,098,197,8

Wood et al. (1991) (Australia)

0,2 0,2 C4 1.362 (1.362) 1,6 81,8 99,1Wood et al.

(1992) (Australia e NZ)

0,5 1,0 C61.396 (389) bovini presunti non infetti

0,0Non

valutata99,6

Neill et al. (1994) (Nord Irlanda)

0,5 1,0 Non stabilito 2.799 (192?) 6,4 84,3Non

valutataNeill et al. (1994)

(Nord Irlanda)

Non fornito Non fornito C4656 (656) da un all.

infetto31,1 73,0

Non valutata

Whipple et al. (1995) (USA)

0,02 0,02C4

C111.036 (140) 10,7

93,787,4

Non valutata

Domingo et al. (1995) (Spagna)

Non fornito Non fornito

C1

C7

203 (203) bovini da un n° non specificato

di all. infetti (stima della Se)

923 (0) bovini da 13 all. UI da 5 anni

(stima Sp)

100

0,0

87,7

Non valutata

Non valutata

96,6

Monaghan et al. (1997)

(Repubblica d’Irlanda)

Non fornito Non fornito C4 220 (8) - 100 94,0Lilenbaum et al. (1999) (Brasile)

0,3 0,3 C4 232 (218) 57,8 84,9Non

valutata

Gonzalez Llamazares et al. (1999) (Spagna)

Non fornito Non fornito C12

1.557 (0) bovini da all. UI con notevoli reazioni alla PPD

aviare

0,0Non

valutata88,9

Lauzi et al. (2000) (Italia)

0,2 0,2 Non stabilito 30 zebu (30) 73,3 95,5 87,7Ameni et al.

(2000) (Etiopia)

Non fornito Non fornito

C6, C13

C13

163 (163) bovini po-sitivi a SIT e colturale da 21 all. (stima Se)

213 (57) bovini da 82 all. senza infezione evidente, ma con

anamnesi remota di test + e necrospia +

(stima Sp)

100

0

85,0

Non valutata

Non valutata

93,0

Ryan et al. (2000) (Nuova

Zelanda)

Legenda: il criterio d’interpretazione per un test positivo non era lo stesso per tutti gli studi. Criteri d’interpretazione usati per il test del γ IFN nei differenti studi:C1: BOD-COD > 0 e BOD-AOD > 0C2: BOD/COD > 1,25 e BOD-AOD > 0C3: BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0C4: BOD/COD ≥ 0,0,5 e BOD-AOD > 0C5: se BOD = 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0. Se BOD > 0,1, allora BOD/COD > 1,5 e BOD-AOD > 0,5 e BOD-AOD > 0C6: BOD-AOD ≥ 0,1C7: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,8C8: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 1,25C9: BOD-AOD ≥ 1,8C10: BOD/COD ≥ 0,05 e BOD-AOD ≥ 1,8 (= C4 se BOD-AOD ≥ 1,0)C11: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD > 0C12: BOD/COD ≥ 2 (COD) e BOD-AOD ≥ 0,05C13: BOD/COD ≥ 0,1 e BOD-AOD ≥ 0,1C14: BOD-AOD ≥ 0,4BOD = valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD bovinaAOD: valore medio di Densità Ottica del plasma stimolato dalla PPD aviareCOD: valore medio di Densità Ottica del plasma incubato con buffer di soluzione salina fosfato (nessun antigene di controllo)

11 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

tradermica è automaticamente ripetuta ad intervalli di 60 giorni in allevamenti con reattori alla TB, fi ni a quando uno o due test risultino negativi (in relazio-ne alla conferma o meno di malattia nei precedenti reattori). I test di controllo sono eseguiti 6 mesi dopo la rimozione delle misure restrittive e 12 mesi dopo, prima che l’allevamento in questione ripristini il suo normale intervallo di controllo.L’interpretazione severa è applicata automaticamente per la conferma di TB in un allevamento.Nuovamente, questo aumenta la Se a livello indivi-duale del test SICCT.La sorveglianza della TB a livello d’allevamento con la prova intradermica è affi ancata dall’ispezione dei bovini al macello e dal rintraccio di qualunque carcas-sa con granulomi sospetti. In Gran Bretagna il nume-ro di casi di TB riportati annualmente dai veterinari ispettori e confermati in seguito dagli esami colturali varia da 100 a 300. Questa è una proporzione molto piccola su oltre 2,5 milioni di bovini macellati ogni anno e ha inciso per il 14% di tutti gli allevamenti nuovi infetti nel 2004. Il parziale o totale de-popolamento dei bovini è ap-plicato quando necessario, al fi ne di risolvere focolai cronici o esplosivi.Indubbiamente, ogni animale infetto non rimosso al test tubercolinico può essere, o diventare, infetto e potenzialmente agire come fonte di M. bovis per gli altri animali in allevamento, vanifi cando la risoluzio-ne del focolaio.L’imperfezione della Se del test aumenta il rischio che bovini infetti non rilevati rimangano nell’allevamen-to dopo la rimozione delle restrizioni. Questi scenari sono stati investigati e modellati in Gran Bretagna. Le regole della probabilità indicano che in allevamenti

con reattori multipli (infetti), l’uso di un test più sen-sibile o una combinazione di due test differenti che identifi cano lievemente sub-popolazioni differenti di animali infetti (test parallelo) aumenterebbe la veloci-tà di risoluzione del focolaio. Analogamente, in assen-za di una fonte esterna di re-infezione la probabilità di recidiva del focolaio sarebbe ridotta dall’uso di due o più test in parallelo (i.e. interpretazione “qualunque positivo”). La questione cruciale per chi governa la politica sanitaria è di determinare le specifi che circo-stanze nelle quali l’applicazione di un test ancillare in parallelo a fi anco della prova intradermica è consiglia-ta e rappresenta un uso effi ciente delle risorse.

Il test del γ interferon (γ IFN)Il γ IFN fu sviluppato negli anni 80 in Australia come test diagnostico da usarsi in combinazione con il SIT caudale. L’Australia diventò uffi cialmente indenne da TB nel1997 attraverso la sistematica applicazione del test intradermico, lo stringente controllo dei mo-vimenti e la rimozione dei reservoirs d’infezione nei bufali d’acqua e nei bovini selvatici.Con il tempo, il test è stato ottimizzato e valicato per l’uso sul campo, ma i foci d’infezione rimasti in Au-stralia erano pochi e troppo distanti dai laboratori per poterlo utilizzare nell’eradicazione. Nondimeno esso fu autorizzato come metodo diagnostico uffi ciale nel 1991 ed adottato come test uffi ciale in Nuova Zelan-da alla fi ne degli anni 90.Il γ IFN è una citochina che viene prevalentemente ri-lasciata dai linfociti T dopo stimolazione antigenica e gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria verso i micobatteri tubercolari come maggior fattore d’attivazione macrofagica. Analogamente alla prova intradermica esso rileva la risposta immunitaria cel-

Box 1 - Vantaggi del test γ IFN sulla prova intradermica

• La sua sensibilità è considerata simile a quella del SIT e maggiore rispetto al SICCT;• il tempo necessario per sviluppare la risposta al test γ IFN dopo l’infezione (tra 1 e 5

settimane) è lievemente più breve rispetto al test intradermico (3-6 settimane);• consente una più rapida ripetizione del test (non vi è interferenza con il sistema im-

munitario dell’ospite). Comunque, test intradermici recenti possono infl uenzare le risposte al test γ IFN;

• non vi è necessità di una seconda visita in allevamento per la lettura del test;• vi è un’interpretazione dei risultati più obiettiva, standardizzata, poiché tutte le misure

sono basate sul laboratorio;• riduce molti dei problemi pratici legati al test intradermico (scarse attrezzature, errori

degli operatori, possibilità di frode), che possono contribuire a sottostimare gli anima-li infetti o dubbi;

• è soggetto all’inclusione di antigeni defi niti e ciò aumenta la differenziazione delle risposte al γ IFN dovute ad infezione con micobatteri patogeni da quelle derivate dal-l’esposizione a micobatteri ambientali o da ceppo vaccinale.

Sanità animale 12 ’OSSERVATORIOL

lulo-mediata dell’ospite nei confronti dell’infezione con M. bovis.Dopo 1-4 settimane dall’infezione, le cellule T nel sangue periferico del bovino rilasciano quantità mi-surabili di γ IFN, quando stimolate dalla tubercolina bovina o antigeni simili. Nel caso in cui l’infezione sia causata da M. avium o micobatteri ambientali, la produzione di γ IFN sarà più copiosa da parte delle cellule T incubate con la tubercolina aviare. L’infe-zione con M. bovis è determinata, quando la tuberco-lina bovina stimola una produzione di γ IFN maggio-re della tubercolina aviare o dell’antigene di control-lo negativo. La quantità di γ IFN prodotto è misurato con lo sviluppo di colore all’ELISA test ed è espresso in unità di densità ottica (DO).

Accuratezza diagnostica, vantaggi e svantaggi del γ IFNLa performance diagnostica del γ IFN convenziona-le è stata valutata in diversi studi svolti in Australia, Brasile, Etiopia, Gran Bretagna, Repubblica d’Irlan-da, Italia, Nuova Zelanda, Irlanda del Nord, Spagna e USA. In questi trias la Se del γ IFN variava tra il 73% e il 100%, con un valore mediano di 87,6%. Il valore mediano della Sp era del 96,6%, con un ran-ge di 85,0-99,6% (tabella 5). Come atteso, i risultati furono infl uenzati anche dalle caratteristiche della popolazione bovina sottoposta al test, dai differenti valori di cut-off adottati per classifi care gli animali come positivi, dal lotto e dalla fonte di tubercolina PPD usata come antigene e dal gold standard usato per determinare il vero stato d’infezione degli anima-li in studio.

Generalmente, si considera che il γ IFN abbia una sensibilità sovrapponibile alla prova intradermica (tabella 4). Alcuni autori sostengono che il test del γ IFN sveli un numero sostanziale di bovini infetti che sfuggono al test tubercolinico, poiché riesce ad identifi care gli animali ad uno stadio precoce d’in-fezione. Perciò, i due test rilevano due sottopopola-zioni di animali tubercolotici leggermente differenti. I bovini positivi al γ IFN e negativi all’IDT che non sono immediatamente macellati hanno una maggior probabilità di reagire a test intradermici susseguenti rispetto ad animali negativi ad entrambi i test. Re-centi studi in Gran Bretagna hanno dimostrato che l’intervallo tra l’infezione e il tempo necessario per giungere ad una risposta positiva al γ IFN (periodo d’insensibilità) è del tutto indipendente dalla dose in-fettiva di M. bovis.Il γ IFN e l’IDT hanno una bassa probabilità di indi-viduare bovini infetti anergici (risposta immune cel-lullo-mediata depressa).I vantaggi pratici del test γ IFN paragonati all’IDT sono riassunti nel box 1.Nella tabella 3 sono elencati alcuni fattori che depri-mono la risposta cellulo-mediata e che diminuiscono la sensibilità dell’IDT e del test γ IFN.Nel box 2 sono evidenziati gli svantaggi del test γ IFN rispetto all’IDT.

Infl uenza del test intradermico sulla risposta del γ IFNDati preliminari di un lavoro del 1992 hanno sug-gerito che risposte al γ IFN in bovini infetti erano

Box 2 - Svantaggi del test γ IFN nei confronti della prova intradermica

• Specifi cità apparentemente più bassa. Ciò può essere parzialmente compensato utiliz-zando al posto della tubercolina bovina determinati antigeni del micobatterio come la proteina ESAT 6 (early secretory antigenic target) e la proteina fi ltrata da coltura 10 (CFP). Entrambe le proteine sono codifi cate da geni presenti nei genomi di M. bovis e M. tuberculosis e assenti da M. bovis BCG e quasi tutti i micobatteri ambientali;

• una piccola proporzione di bovini infetti che reagiscono al test intradermico non sono individuati dal test γ IFN;

• è più probabile che vitelli non infetti diano reazioni non specifi che al test. Questo è do-vuto probabilmente alla produzione innata di γ IFN da parte delle cellule natural killer nel sangue periferico, quando stimolate in vitro con certi antigeni del MTB complex;

• alcune diffi coltà logistiche associate alla necessità di trasportare i campioni di sangue in un ambiente stabile (circa 10-26°C) e di incubarli con l’antigene entro poche ore dalla raccolta. Ritardi nel processo dei campioni può ridurre signifi cativamente la sen-sibilità del test;

• alto costo della componente del laboratorio, sebbene si eviti il ritorno in allevamento e via sia l’automazione e l’economia di scala;

• necessità di un’accurata identifi cazione degli animali al campionamento, poiché i po-sitivi non sono marcati nella reazione al test.

13 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

infl uenzate dalla precedente applicazione del test in-tradermico; in particolare, si osservava un graduale incremento nei valori OD per il test γ IFN tra 7 e 59 giorni dopo il SIT caudale.Ad ogni modo, successivi studi differenti hanno por-tato a conclusioni contrastanti circa la temporanea di-minuzione nella risposta al γ IFN dopo applicazioni recenti del test intradermico.Queste discrepanze sono probabilmente dovute a condizioni variabili con cui sono stati condotti i di-versi studi, incluso il tipo di skin test applicato. Al-cuni autori hanno valutato il test Bovigam® in bovini naturalmente infetti tra 8 e 28 giorni dopo la lettura del SIT caudale. Le conclusioni sono state favorevoli all’utilizzo del test anche dopo 8 giorni dalla lettu-ra del SIT. Questi risultati sono alla base dell’attuale protocollo del test con γ IFN in Nuova Zelanda, dove il campionamento di sangue viene eseguito tra 13 e 33 giorni dopo l’inoculazione della tubercolina.Negli USA altri studi confermano che il SIT caudale incrementa le risposte del γ IFN a partire da tre gior-ni dopo lo skin test e fi no a 63 giorni. Applicando il SICCT test a 63 giorni dopo il SIT non si evidenzia-va un ulteriore incremento nella risposta al γ IFN. Inoltre, è stato dimostrato che si raggiungono valori di OD elevati nel sangue prelevato dopo 3 giorni dal SIT e conservati per una notte rispetto a campioni prelevati contestualmente, ma testati immediatamen-te, entro 2 ore.Questi risultati hanno supportato l’autorizzazione da parte del Dipartimento dell’Agricoltura USA di ap-plicare il test Bovigam® tra 3 e 30 giorni dopo il SIT caudale.Diversi studi condotti in Irlanda e in Gran Bretagna non hanno mostrato signifi cative differenze nella risposta al γ IFN in animali naturalmente infetti e reattori allo skin test fi no a 7 e 65 giorni dopo il test SICCT. In un altro lavoro si afferma che il test del γ IFN può essere eseguito su campioni prelevati tre giorni dopo l’applicazione del SICCT test senza in-fl uenzarne la sensibilità.Di converso, un altro studio eseguito su vitelli infet-tati sperimentalmente con alte dosi di M. bovis, ha di-mostrato una diminuzione pronunciata della risposta

al γ IFN in sangue prelevato dopo 3 giorni dall’ap-plicazione del SICCT test, anche se l’interpretazione del test non veniva infl uenzata quando si usavano le tubercoline bovina e aviare. Anche in Gran Bretagna è stato segnalato che le risposte del γ IFN alla tu-bercolina aviare in vitelli sperimentalmente infettati aumentano transitoriamente, quando il sangue è rac-colto una settimana dopo il SICCT test.Questo incremento selettivo della risposta alla tuber-colina aviare potrebbe mascherare la diagnosi d’infe-zione con il test Bovigam®.Nel box 3 sono rappresentate le conclusioni generali di tutti gli studi presi in considerazione circa gli ef-fetti dello skin test sulle risposte del γ IFN in animali infetti.

Applicazioni in campo del γ IFN Come già affermato, la specifi cità mediana del γ IFN convenzionale usando la PPD bovina è 96,6%; può sembrare alta e solo marginalmente bassa se parago-nata al 99,5% del SICCT test. Ad ogni modo, in un paese o regione dove la prevalenza di TB a livello individuale è bassa, questo valore porterebbe a ma-cellare un numero inaccettabile di bovini non infetti. Questo è il principale argomento portato contro l’uti-lizzo del test Bovigam® come test di screening di massa. Inoltre, il test è relativamente costoso e il suo uso comporta alcuni svantaggi logistici e non identi-fi ca ogni animale infetto che reagisce allo skin test. Perciò, l’applicazione più idonea del γ IFN ad oggi è il suo uso come test ancillare in parallelo in focolai di TB o in allevamenti persistentemente infetti a più skin test, in cui la rimozione di pochi animali o falsi positivi è di trascurabile importanza. L’impiego sia dello skin test che del γ IFN in rapida successione può innalzare la sensibilità diagnostica totale fi no al 20% in più rispetto al solo SIT test, con la rimozione di più bovini infetti, ma non necessariamente tutti, da allevamenti infetti con più rapidità.In più, in paesi dove il SIT è il test di screening pri-mario (compresa l’Italia), il test γ IFN è il test seriale di scelta per ri-testare i reattori allo skin test in alle-vamenti bovini indenni da TB situati in aree a bassa prevalenza di TB.

Box 3 - Riassunto degli effetti osservati dello skin test su susseguenti risposte di γ IFN in animali infetti.

• Il SIT caudale può incrementare le risposte del γ IFN in bovini infetti con M. bovis;• il SICCT test non incrementa signifi cativamente le risposte del γ IFN;• il sangue per il test Bovigam® può essere prelevato dopo tre giorni dal SIT test, senza

infl uenzare il risultato;• vi sono risultati contradditori in relazione al SICCT test. Alcuni risultati supportano

l’affermazione precedente, altri dati sperimentali suggeriscono che è più sicuro evitare di usare il test Bovigam® nei 7 giorni seguenti il SICCT test.

Sanità animale 14 ’OSSERVATORIOL

La tabella 5 riassume le diverse applicazioni in cam-po del test γ IFN in una selezione di paesi non uf-fi cialmente indenni da TB con attivi programmi di controllo.

Negli USA il γ IFN è un test supplementare approva-to nel bovino dal 2001; ora è usato di routine in al-ternativa al SICCT per chiarire lo stato dei reattori al SIT caudale in allevamenti presumibilmente inden-ni dall’infezione (test seriale) ed è approvato anche come test in parallelo con il SIT caudale in alleva-menti infetti, in alternativa al de-popolamento.Anche in Nuova Zelanda il γ IFN è approvato nel bo-vino come test ancillare a complemento del SIT cau-dale, sia come test in serie per i reattori allo skin test e come test in parallelo per gli animali skin test negativi in allevamenti infetti. Inoltre, il γ IFN è usato in pa-rallelo con il SIT nel controllo dei bovini al pre-move-ment da allevamenti infetti (al contrario degli alleva-menti indenni, in cui i bovini sono testati al pre-move-ment solo con il SIT). Nel luglio 2002 il test γ IFN è

stato formalmente riconosciuto dall’Unione Europea come test parallelo supplementare per aumentare la rilevazione del numero di bovini infetti in allevamen-to. Il test ora è uno strumento standard nel controllo di bovini nei paesi europei con tubercolosi endemica.Dal punto di vista del costo-benefi cio della combina-zione dei due test in situazioni differenti non è stato pubblicato alcuno studio completo. Un modello deci-sionale ad albero dell’uso del γ IFN in allevamenti con reattori multipli alla tubercolina in Gran Bretagna ha comunque stimato che ci vorrebbero signifi cativi be-nefi ci nella riduzione della diffusione intra e inter-alle-vamenti per rendere effi ciente il test. Sarebbero neces-sari costosi trial rnadomizzati per controllare queste ipotesi sul campo, ad esempio se l’uso congiunto del γ IFN e dello skin test potesse signifi cativamente ac-corciare il tempo di restrizione cui sono sottoposti gli allevamenti infetti rispetto all’uso del solo skin test. Nondimeno, l’impiego del γ IFN in Gran Bretagna si è diffuso dal 2002 per l’uso ancillare ad hoc a comple-mento del SICCT test in situazioni specifi che.

Tabella 5. Esempi d’applicazioni in campo del test IFN (Bovigam®), a complemento dei test diagnostici primari per TB nel bovino

Paese

Test primario

di screening

per TB

Usi operativi del test γ IFN

Test in parallelo in bovini skin test negativi (interpretazione “qualsiasi positivo) per > Se

Test in serie (di conferma) di reattori allo skin test (interpretazione “entrambi

positivi”) per > Sp

Nuova Zelanda

SIT caudale

Allevamenti infetti in modo acuto o cronico, per ridurre il tempo d’eradicazione

Su tutti i reattori al test primario in allevamenti indenni. Tre differenti formati di test sono disponibili, mirati a diversi livelli

di specifcità

Pre-movement test in bovini > 6 settimane da allevamenti infetti

Applicati anche in circostanze eccezionali in allevamenti infetti o sospesi

USA SIT caudale

Come alternativa alla macellazione dell’intero allevamento infetto

In allevamenti presumibilmente TB free, per ri-testare i reattori sospetti di aspecificità al

test primario

Sud Africa

SIT caudale

Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo acuto o cronico -

Italia SIT cervicale

Allevamenti bovini e bufalini infetti in modo acuto o cronico -

Repubblica d’Irlanda SICCT

Allevamenti infetti in modo acuto o cronico, per ridurre il tempo di eradicazione

Nel caso di sospetto di reazioni non specifiche a SICCT, usando un punto di cut-off più alto e antigeni specifici di M.

bovisPossibile screening d’allevamenti contigui a focolai confermati

Nord Irlanda SICCT

Parte di un pilota per supportare la rilevazione di bovini infetti in allevamenti

“problema” con infezione cronica Gli allevamenti reclutati (e gli animali positivi

rimossi) sono su base volontaria

Parte di un trial volontario in un numero d’allevamenti indenni selezionati random

per stabilire la specificità

Gran Bretagna

(UK)SICCT

In focolai TB persistenti in cui ci sono reattori con lesioni visibili nei successivi 60

giorni d’intervallo tra gli skin test

In allevamenti reattori non confermati (NVL, colture negative) senza precedenti infezioni confermate e in aree a bassa

prevalenza, dove si sospetta una reazione non specifica alla tubercolina

In gravi focolai come alternativa alla macellazione totale o parziale Rapido ri-controllo di bovini con reazioni

anomale allo skin test, in cui si sospetta interferenza fraudolentaIn nuovi focolai confermati fuori da aree

endemiche

15 Sanità animale ’OSSERVATORIOL

Diagnosi basata sugli anticorpiLa reazione dell’ospite alla tubercolosi è prevalente-mente rappresentata dall’immunità cellulo-mediata, affi ancata, con il progredire della malattia, dalla ri-sposta anticorpale.

La fi gura 1 rappresenta schematicamente l’evoluzione.Sulla destra del grafi co vi sono gli animali con infe-zione avanzata e generalizzata, ma che non rispon-dono alla tubercolina a causa di una debole risposta dell’immunità cellulo-mediata. E’ stato speculato che questi animali “anergici” sono probabilmente malati e altamente infettanti e che potrebbero essere la causa di gravi e persistenti focolai. Un a certa proporzione di bovini “anergici” può essere rilevata con metodi sierologici (tipo ELISA). Questi test sono stati svi-luppati nelle ultime due decadi per rilevare la tuber-colosi bovina ed umana, ma generalmente soffrono di una bassa Se, quando paragonati allo skin test e al γ IFN, soprattutto quando applicati ad animali ai primi stadi d’infezione. L’inclusione d’antigeni di M. bovis più specifi ci (e.g. MPB70 e MPB83) ha aumentato la Sp, ma non la Se. Studi recenti hanno mostrato che la risposta anticorpale contro M. bovis è incrementata dallo skin test (risposta anamnestica). Questo incre-mento è direttamente proporzionale alla gravità della malattia e alla sua generalizzazione.In sintesi, i test sierologici che rilevano gli anticorpi sono relativamente economici e semplici da fare, ma non offrono, al momento un’alternativa ai test basati sull’immunità cellulo-mediata.Essi possono essere considerati come test ancillari per lo skin e il γ IFN test in bovini negativi appartenenti ad allevamenti con infezione cronica confermata o in caso di focolaio.

Altri test diagnostici complementari La coltura convenzionale rimane il gold standard per la rilevazione di M. bovis in campioni clinici come i tessuti, il muco nasale, il sangue. I metodi basati su

PCR offrono potenziali vantaggi di sensibilità, fl essi-bilità e rapidità. Le metodiche PCR non hanno però fi no ad ora mostrato d’essere superiori alla coltura di routine in termini di sensibilità e specifi cità. Le limi-tazioni probabilmente sono legate al basso numero di bacilli in campioni clinici, all’eliminazione intermit-tente, all’estrazione ineffi ciente del DNA dei micobat-teri o alla presenza d’inibitori di PCR nei campioni.PCR rimane d’uso limitato nell’identifi cazione d’in-fezione con M. bovis nei campioni clinici, poiché richiede elevate quantità di bacilli. In breve, anche se le metodiche PCR benefi ciano di una più preco-ce identifi cazione delle specie di micobatteri rispetto alla coltura, non è realistico considerale ancora una valida scelta agli strumenti impiegati per la diagnosi di routine di TB negli animali in vita.Infi ne, sono state investigate le potenzialità di sensori chimici nel diagnosticare l’infezione con M. bovis, che si basano sulla rilevazione ed analisi di composti organici volatili in campioni di siero da vitelli infet-ti, un approccio conosciuto come “naso elettronico” (“e-nose”). Nonostante risultati iniziali promettenti (8 vitelli infettati sperimentalmente discriminati cor-rettamente da controlli non infetti tre settimane dopo l’infezione), sono necessari altri studi allargati per valicare scientifi camente questa tecnologia.

Sviluppi futuriL’uso d’antigeni o peptici sintetici specifi ci per M. bovis, in alternativa alla PPD bovina, sono ancora in corso di valutazione per lo sviluppo di un test intra-dermico più specifi co.Le recenti acquisizioni sulle sequenze genomiche di M. tuberculosis, M. bovis e M. bovis BCG hanno per-messo di eseguire analisi genomiche comparative per screening immunologici di potenziali antigeni. Di-versi antigeni possono incrementare la sensibilità e la specifi cità del γ IFN quando usati in combinazione con ESAT-6 e CFP-10, anche se più antigeni vanno valutati per giungere alla sensibilità della tubercoli-na. L’uso d’antigeni ESAT-6 e CFP-10 nel test del γ IFN sono in grado di discriminare gli animali vacci-nati da quelli infetti, ma vi è bisogno di estendere i la sperimentazione ad un più grande numero di bovini.In Gran Bretagna si sta acquisendo esperienza circa l’evidenza di differenze esistenti tra ceppi di M. bovis (spoligotipi) nella loro capacità di indurre una risposta cellulo-mediata dell’ospite. Questo fenomeno è già stato descritto per differenti genotipi di M. tubercu-losis. Il riconoscimento di differenti cloni di M. bovis consentirà di paragonarli e di identifi care differenze nella virulenza, trasmissibilità e immunogenicità.Se esiste tale variabilità, la sorveglianza costante dei tipi molecolari può essere necessaria al fi ne di mirare la diagnosi di TB e le misure di controllo concernenti i ceppi di M. bovis prevalenti a livello locale.

Figura 1. Rappresentazione schematica dello spettro di risposte del sistema immunitario bovino ai vari test per TB (adattata da Vordermeier et al., 2004)