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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

RITA NEUMA DANTAS CAVALCANTE DE ABREU

EFEITOS COMPORTAMENTAIS, NEUROQUÍMICOS E ANTIOXIDANTE DA

HECOGENINA OBTIDA DE Agave sisalana Perrine EM CAMUNDONGOS

FORTALEZA

2013

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RITA NEUMA DANTAS CAVALCANTE DE ABREU

EFEITOS COMPORTAMENTAIS, NEUROQUÍMICOS E ANTIOXIDANTE DA

HECOGENINA OBTIDA DE Agave sisalana Perrine EM CAMUNDONGOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia em saúde. Orientadora: Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos Patrocínio

FORTALEZA

2013

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A Deus, pois sem ele nada é possível;

À minha família, com especial gratidão ao meu

pai, Vicente Abreu, e à minha mãe Idezite, por

me haver encorajado, inúmeras vezes, por meio

do orgulho e da confiança de me ver vitoriosa;

À minha linda filha, Giovanninha, o grande amor

da minha vida.

Ao meu esposo, Gilvan, pela força e incentivo

para a realização e conclusão deste curso.

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AGRADECIMENTOS

À Profª Drª Silvânia Maria Mendes Vasconcelos pelas orientações seguras, amizade,

paciência, confiança e incentivo. Muito obrigada! A senhora é um orgulho para enfermagem;

À Profª Drª Thereza Maria Magalhães Moreira, minha orientadora do mestrado em

Cuidados clínicos, a quem serei sempre grata por todos os ensinamentos e, acima de tudo, por

sua amizade e disponibilidade que tornaram meus sonhos uma realidade;

À Profª Drª. Luiza Jane Eyre, pela amizade, incentivo ao longo de minha caminhada e por

ter me apresentado ao mundo da pesquisa científica;

Aos docentes do Doutorado em Biotecnologia, especialmente ao Dr. Krishnamurti de

Morais Carvalho pela disponibilidade;

Às Professoras Dras. Glauce Viana, Danielle Silveira e Francisca Cléa, pesquisadoras do

Laboratório de Neuropsicofarmacologia, pela organização do Laboratório;

Ao Dr. José Maria Barbosa Filho do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da

Universidade Federal da Paraíba, que gentilmente nos cedeu a molécula estudada;

Aos professores Dra. Thereza Magalhães, Dra. Lissiana Aguiar e Dr. José Eduardo

Honório Júnior pelas contribuições no exame de qualificação do projeto;

Aos professores Dra. Thereza Magalhães, Dra. Lissiana Aguiar, Dra. Maria Goretti

Queiroz, Dr. Manoel Cláudio Patrocínio, Dr. José Eduardo e Dra. Edna Camelo por

terem aceito gentilmente o convite para participar desta banca examinadora;

À Universidade de Fortaleza (UNIFOR) por me proporcionar as horas de estudo;

Aos meus queridos ex-alunos e agora colegas enfermeiros Lara Martins, Aline Miranda e

Euclides Sales Barbosa Filho pelo carinho e ajuda nos experimentos no início do Curso de

Doutorado;

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Aos alunos de iniciação científica do LabNeuro pela amizade e ajuda nos experimentos:

Manuel Júnior, Naiara, Caren, Germana, Anália, Paulo Vitor, Camila, Lucas e Helene.

Aos meus amigos do LabNeuro Eliane Brito, Edna Camelo, Márcia Calheiros, José

Eduardo, Rafael Sampaio, Taciana, Tatiana, Sara Escudeiro, Valdécio, Edith, Clayton,

Carlos Eduardo, Dayana, Kátia Cilene, Elaine pela ajuda nos experimentos, amizade e

confiança depositada;

Aos funcionários da UFC, Valmor, Vilanir, Lena, Nájila pela convivência e ajuda nos

cuidados aos camundongos e ao Arnaldo pelo apoio técnico;

A todos do Lab Neuro da UFC, o meu verdadeiro agradecimento pelo prazeroso ambiente que

me proporcionaram;

Aos funcionários do BIOTÉRIO, Sr. Haroldo e Sr. Adalto pela manutenção dos animais;

Aos enfermeiros, médicos e técnicos de enfermagem da emergência do Instituto Dr. José

Frota pela confiança e incentivo; Aos médicos Iara e Carlos Serra Azul pela ajuda nos meus

momentos de ansiedade;

Aos colegas professores da UNIFOR, especialmente Liliane Costa, Rafael Sampaio, Ítalo

Rigoberto, Ângela Uchoa, Débora Guerra, Karla Rolim e Goretti Monteiro;

Aos alunos da UNIFOR pela compreensão nos momentos em que precisei me ausentar mais

cedo dos estágios;

Aos enfermeiros do Hospital de Saúde Mental de Messejana pela amizade. Aos amigos de

Pedra Branca, minha terra querida;

À minha sogra Maria Aldeir pelas orações e estímulo;

Aos secretários do curso de Doutorado em Biotecnologia da UECE Patrícia e Paulo pela

disponibilidade;

Aos funcionários do Núcleo de Pesquisa da UNIFOR, Arlene e Rafael pelo carinho;

8

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para que este trabalho fosse possível, meu

MUITO OBRIGADA!

9

“E sabemos que todas as coisas contribuem juntamente

para o bem daqueles que amam a Deus, daqueles que são

chamados segundo o seu propósito”

(Romanos 8: 28)

10

RESUMO

Agave sisalana, popularmente conhecida como sisal, é uma planta originada do México,

fazendo parte da família Agavaceae. No suco das folhas de Agave é encontrado hecogenina

(HEC), uma sapogenina esteroidal. O objetivo foi estudar os efeitos comportamentais,

neuroquímicos e antioxidante de HEC em camundongos. Foram utilizados camundongos

Swiss, machos, pesando de 25-35 g. Os efeitos comportamentais da administração aguda da

HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, via intraperitoneal - ip) ou em doses repetidas por sete dias (20

ou 40 mg/kg, ip) foram avaliados pelos testes: labirinto em cruz elevado, campo aberto, placa

perfurada e suspensão de cauda. Nestes testes, determinou-se o mecanismo de ação da HEC

com administração aguda de Flumazenil 2,5 mg/kg (FLU) ou Reserpina 2 mg/kg (RES). Após

os testes comportamentais, as áreas cerebrais córtex Pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e

corpo estriado (CE) foram dissecadas. O teste de labirinto em cruz elevado mostrou que a

HEC, administrada agudamente, nas doses de 10, 20 ou 40 mg/kg, causou aumento

significativo no número de entradas nos braços abertos (NEBA) comparado ao controle.

Efeito semelhante foi observado no tempo de permanência nos braços abertos (TPBA) nas

doses de 20 ou 40 mg/kg em relação ao grupo controle. A administração em doses repetidas

da HEC (20 ou 40 mg/kg) também aumentou o NEBA. HEC (20 ou 40 mg/kg), administrada

agudamente, aumentou o número de head dips comparado ao controle. Efeito semelhante foi

observado após o tratamento em doses repetidas com a HEC na dose de 40 mg/kg em relação

ao grupo controle. O FLU não foi capaz de reverter os efeitos ansiolíticos agudos da HEC no

labirinto em cruz elevado e no teste de placa perfurada. Hecogenina reduziu o tempo de

imobilidade no teste de suspensão de cauda após o tratamento agudo ou em doses repetidas. A

molécula em estudo (HEC) reverteu o efeito depressor da RES. Referente aos efeitos da

administração aguda da HEC sobre a peroxidação lipídica, observou-se uma diminuição nas

três areas estudadas nas doses 5, 10, 20 ou 40 mg/kg, comparado com os grupos controles.

Nas doses de 20 ou 40 mg/kg, HEC causou diminuição dos níveis de nitrito no CPF, HC e CE

comparado ao controle. No CPF, de camundongos tratados agudamente com HEC, o

aminoácido excitatório glutamato (GLU) aumentou nas doses de 10, 20 ou 40mg/kg.

Enquanto os inibitórios ácido gamaaminobutírico (GABA) e Taurina (TAU) aumentaram nas

doses de 20 ou 40mg/kg. No hipocampo, houve aumento de Aspartato (ASP), GLU, Glicina

(GLI) e TAU apenas na maior dose de HEC. No corpo estriado, ocorreu o aumento do ASP,

GLU e TAU após as doses de 20 ou 40 mg/kg de HEC. As concentrações de GLI e GABA

aumentaram na maior dose de HEC (40 mg/kg) nesta área cerebral. Os níveis de 5-HT e 5-

HIAA foram aumentados apenas na dose de 40 mg/kg de HEC. Concluiu-se que HEC (20 ou

11

40 mg/kg) apresentou efeitos ansiolíticos e este efeito não foi relacionado aos receptores

benzodiazepínicos. A molécula não causou estresse oxidativo ao SNC.

Palavras-chave: Ansiedade. Depressão. Aminoácidos.

12

ABSTRACT

Agave sisalana, popularly known as sisal, is a plant originaly from Mexico and belongs to the

family Agavaceae. Hecogenin (HEC) is a steroidal sapogenin found in the juice from the

leaves of Agave. The purpose was to study the behavioral, neurochemical and antioxidant

effects of HEC in mice. We used swiss mice weighing 25-35 g. The behavioral effects of

HEC’s acute administration (5, 10, 20, or 40 mg/kg intraperitoneally – i.p.) or in repeated

doses for seven days (20 or 40 mg/kg, i.p.), were evaluated by tests: elevated plus maze, open

field, hole board test and tail suspension. In these tests, we determined the mechanism of

action of HEC with acute administration of Flumazenil 2.5 mg/kg (FLU) or Reserpine 2

mg/kg (RES). After the behavioral tests, the brain areas pre-frontal cortex (PFC),

hippocampus (HC) and striatum (CE) were dissected. The elevated plus-maze test showed

that HEC, acutely administered, at doses of 10, 20 or 40 mg/kg, caused a significant increase

in the number of entries in the open arms (NEOA) compared to control. A similar effect was

observed in the time spent in the open arms (TPOA) at doses of 20 or 40 mg/ kg compared to

the control group. The administering repeated doses of HEC (20 or 40 mg/kg) increased the

NEOA. HEC (20 or 40 mg/kg) administered acutely increased the number of head dips

compared to control. A similar effect was observed after treatment with repeated doses of

HEC at a dose of 40 mg/kg compared to the control group. The FLU was unable to reverse the

acute anxiolytic effects of HEC in the elevated plus-maze test and in the hole board test.

Hecogenin reduced the immobility time in the tail suspension test after acute treatment or

repeated doses. The molecule under study (HEC) reversed the depressant effect of RES.

Related to the effects of acute administration of HEC on lipid peroxidation, we observed a

decrease in the three studied areas at 5, 10, 20 or 40 mg/kg doses, compared to control groups.

At doses of 20 or 40 mg/kg, HEC caused decreased levels of nitrite in the PFC, HC and CE

compared to control. In PFC’s mice acutely treated with HEC, the excitatory amino acid

glutamate (GLU) increased at doses of 10, 20 or 40mg/kg, while the inhibitory

gamaaminobutiric acid (GABA) and taurine (TAU) increased at doses of 20 or 40mg/kg. In

the mice’s hippocampus treated with HEC, there was increased aspartate (ASP), GLU,

glycine (GLY) and TAU only at the highest dose HEC. In the striatum, there was an increase

of ASP, and GLU and TAU after doses of 20 or 40 mg/kg of HEC. Concentrations of GLY

and GABA increased HEC at the highest dose (40 mg/kg) in this brain area. The 5-HT and 5-

HIAA levels were increased only in 40 mg/kg dose of HEC. We concluded that HEC (20 or

40 mg/kg) showed anxiolytic effects and this effect was not related to benzodiazepine

receptors. The molecule did not cause oxidative stress to the CNS.

Keywords: Anxiety. Depression. Amino acids.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Biossíntese das catecolaminas 28

Figura 2 - Biossíntese e metabolismo da 5-hidroxitriptamina 30

Figura 3 – Metabolismo dos aminoácidos transmissores no cérebro 33

Figura 4 - Óxido nítrico e as enzimas óxido nítrico sintases 39

Figura 5 - Estresse oxidativo 43

Figura 6 - Estrutura geral das saponinas esteroidais 46

Figura 7 - Estrutura Molecular de hecogenina 50

Figura 8 - Áreas cerebrais dissecadas 61

Figura 9 - Aparelho de HPLC 63

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Reagentes e Drogas utilizados nos experimentos

51

Quadro 2 - Equipamentos utilizados nos experimentos 52

Quadro 3 – Esquema do teste do campo aberto 53

Quadro 4 – Teste do Labirinto em Cruz Elevado 55

Quadro 5 – Teste de Placa Perfurada 56

Quadro 6 – Teste de suspensão de cauda

58

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT serotonina

AAS ácido acetilsalicílico

ALE Atividade locomotora espontânea

ALP fosfatase alcalina

ALT transaminase

AMPA alfa-amino-3-hydroxi-5-methyl-4 lisoxazole propionic acid

ANOVA Análise de Variância

ASP aspartato

CAT catalase

CE Corpo estriado

COMT catecol-O-metiltransferase

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CPF Córtex pré-frontal

DA Dopamina

DAG descarboxilase do ácido glutâmico

D2 Receptor dopaminérgico do tipo D2



DOPAC ácido diidroxifenilacético

DZP Diazepam

EHAS Extrato Hidrolisado de Agave sisalana

eNOS òxido Nítrico Sintase endotelial

ERO Espécies Reativas de Oxigênio

EPM Erro Padrão da Média

EUA Estados Unidos da América

FHAS Fração Hexânica de Agave sisalana

FLU Flumazenil

GABA Ácido gama-aminobutírico

GABAA Receptor do ácido gama-aminobutírico do tipo A

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GABAB Receptor do ácido gama-aminobutírico do tipo B

GGT Gama-glutamil transferase

GLU Glutamato

GLI Glicina

GSH Glutationa

GSH-Px glutationa peroxidase

GSSG glutationa oxidada

GSH red. glutationa redutase

H Hora

HEC Hecogenina

HIAA 5-hidroxindolacético

HVA ácido homovanílico

HC Hipocampo

HPLC High Perfomance Liquid Chomatography

iNOS Óxido Nítrico Sintase induzível

ip Intraperitoneal

IMI Imipramina

ISRS Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina

LCE Labirinto em cruz elevado

MAO inibidores da Monoaminoxidase

MCV volume corpuscular média

MCH hemoglobina corpuscular média

MCHECO Média, corpuscular da concentração de hemoglobina

mGluR receptores glutamatérgicos metabotrópicos

MDA malonildialdeído

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NEBA Número de Entradas nos Braços Abertos

NA norepinefrina

NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NMDA N-metil-D-aspartato

NO Óxido nítrico

NOS óxido nítrico sintases

OMS Organização Mundial de Saúde

P Nível de Significância

RES Reserpina

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SNC Sistema Nervoso Central

SOD superóxido dismutase

TAU Taurina

TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TPBA Tempo de Permanência nos Braços abertos

TPBF Tempo de Permanência nos Braços fechados

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SUMÁRIO

1) INTRODUÇÃO……………………………………………………………………. 20

2) REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………….... 23

2.1 Doenças do Sistema Nervoso Central: ansiedade e depressão.................................. 23

2.2) Neurotransmissores Centrais.................................................................................... 27

2.3) Áreas cerebrais: Córtex Pré-frontal, Hipocampo e Corpo estriado.......................... 34

2.4) Estresse oxidativo e as doenças do SNC.................................................................. 36

2.5) Saponinas e Sapogeninas esteroidais....................................................................... 46

3) OBJETIVOS.............................................................................................................. 48

4) MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 49

4.1) Material Vegetal………………………………………………………………… 49

4.2) Animais…………………………………………………………………………. 50

4.3) Reagentes e Drogas……………………………………………………………... 51

4.4) Equipamentos…………………………………………………………………… 52

4.5) Protocolo de tratamento agudo para os testes de comportamento………………. 53

4.7) Protocolo de tratamento em doses repetidas para os testes de comportamento… 59

4.5) Testes de comportamento………………………………………………………. 59

4.8) Testes Neuroquímicos…………………………………………………………... 60

4.9) Análise Estatística………………………………………………………………. 65

5) RESULTADOS…………………………………………………………………….. 65

Artigo 1: Composição química, atividades biológicas e farmacológicas de Agave

sisalana Perrine e seus constituintes

66

19

Artigo 2 - Efeitos da administração aguda ou em doses repetidas da hecogenina

isolada de Agave sisalana Perrine sobre o comportamento de camundongos

88

Artigo 3 – Determinação da concentração de aminoácidos no córtex pré-frontal,

hipocampo e corpo estriado de camundongos tratados agudamente com hecogenina

110

Artigo 4 - Determinação da concentração de monoaminas no corpo estriado de

camundongos tratados agudamente com hecogenina

127

Artigo 5 - Ação da hecogenina, isolada de Agave sisalana Perrine, sobre os

parâmetros do estresse oxidativo no cérebro de camundongos.

140

6) CONCLUSÕES GERAIS………………………………………………………… 157

REFERÊNCIAS………………………………………………………………………. 158

20

1 INTRODUÇÃO

A utilização da natureza para fins terapêuticos é tão antiga quanto a civilização

humana e, por muito tempo, produtos minerais, de plantas e animais foram fundamentais para

a área da saúde. Historicamente, as plantas medicinais são importantes como fitoterápicos e

na descoberta de novos fármacos, estando no reino vegetal a maior contribuição de

medicamentos (BRASIL, 2012).

A Organização Mundial da Saúde (OMS), considerando as plantas medicinais como

importantes instrumentos da assistência farmacêutica, por meio de vários comunicados e

resoluções, expressa sua posição a respeito da necessidade de valorizar a sua utilização no

âmbito sanitário ao observar que 70% a 90% da população nos países em vias de

desenvolvimento dependem delas no que se refere à Atenção Primária à Saúde (WHO, 1993;

2011). Em alguns países industrializados, o uso de produtos da medicina tradicional é

igualmente significante, como o Canadá, França, Alemanha e Itália, onde 70% a 90% de sua

população tem usado esses recursos da medicina tradicional sobre a denominação de

complementar, alternativa ou não convencional (WHO, 2011).

O Brasil é um dos países com maior diversidade, concorrendo com a Indonésia pelo

título de nação biologicamente mais rica do planeta (MITTERMEIER et al., 2005). Estima-se

que em nosso território existam mais de 56.000 espécies vegetais catalogadas, o equivalente a

19% da flora mundial (GIULIETTI et al., 2005). A Biodiversidade da flora brasileira tem

promovido crescimento da produção de fitoterápicos (da ordem de 15% ano), enquanto o

crescimento anual de medicamentos alopáticos gira em torno de 3 a 4% (DUNDER, 2009).

É válido destacar que a maior parte da flora medicinal é ainda desconhecida

químico/farmacologicamente. Portanto, o fomento à pesquisa, ao desenvolvimento

tecnológico e à inovação com base na biodiversidade brasileira e de acordo com as

necessidades epidemiológicas da população, constitui importante estratégia para a Política

Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2009).

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), baseada nas diretrizes das

políticas nacionais, promoveu ampla revisão das legislações, elaborou novas normas, como a

RDC nº 10/2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais, assim como promoveu,

por meio da Farmacopeia Brasileira, a revisão das monografias de plantas medicinais. Todas

essas normas apresentam avanço no setor de regulamentação brasileiro, sendo importantes

para vários segmentos desde as Farmácias Vivas até o industrial (BRASIL, 2012).

21

No Nordeste, o projeto Farmácias Vivas foi desenvolvido com a finalidade de

oferecer, sem fins lucrativos, assistência às comunidades onde existe carência de atendimento

dos programas de saúde pública, promovendo o uso correto de plantas de ocorrência local ou

regional, dotadas de atividade terapêutica cientificamente comprovada (MATOS, 1998). Em

virtude da importância desse programa no contexto da fitoterapia na rede pública, o

Ministério da Saúde, por meio da Portaria GM nº 886, de 20 de abril de 2010, instituiu a

Farmácia Viva no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS), sob gestão estadual, municipal

ou do Distrito Federal (BRASIL, 2012).

Os estudos dos usos tradicionais de plantas e seus produtos vêm aumentando

progressivamente nos últimos anos na região Nordeste do Brasil (AGRA; FREITAS;

BARBOSA-FILHO, 2007; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2002). Em uma pesquisa

desenvolvida com índios Tapebas do Ceará, foi constatado que essa população fazia uso de

muitas espécies vegetais sem dados químicos e farmacológicos registrados, bem como outras

que já foram alvo de pesquisa científica, mas que necessitam ainda de estudos

complementares pra garantir segurança para uso geral e preparação de fitoterápicos (MORAIS

et al., 2005).

Referente aos efeitos de compostos de origem vegetal com ação no sistema nervoso

central (SNC), estudos têm demonstrado que causam mudanças no comportamento animal

com potencial depressivo, sedativo e anticonvulsivante (GOMES et al., 2005; GOMES et al.,

2008), ansiolítico (ARAGÃO et al., 2006), antidepressivo (LIMA et al., 2010) e propriedades

antinociceptiva (GOMES et al., 2005).

No laboratório de Neuropsicofarmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC),

em parceria com o Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho da Universidade Federal da Paraíba

(UFPB), pesquisas têm sido realizadas com substâncias isoladas de plantas (ALMEIDA et al.,

2012; CHAVES, 2012; GOMES et al, 2008) com o objetivo de descobrir novas moléculas

com potencial terapêutico para a ansiedade, depressão e convulsão, além dos estudos

(HONÓRIO JUNIOR et al., 2012) sobre avaliação de compostos antioxidantes no SNC.

Acrescenta-se que as doenças neuropsiquiátricas têm aumentado em conseqüência do

aumento da população idosa, o que acarreta um grande problema social. Os transtornos de

ansiedade e a depressão são as doenças mentais mais comuns em todo o mundo e tornou-se

uma área importante de pesquisa em psicofarmacologia (BADGUJAR; SURANA, 2010).

Os transtornos de ansiedade afetam 25% dos indivíduos ao longo da vida, acarretando

considerável sofrimento e custo econômico (SILVA JÚNIOR, 2010; SMOLLER et al., 2009).

A depressão também causa prejuízo da qualidade de vida nos portadores, representando um

importante problema de saúde pública. A depressão afeta as pessoas em todo o mundo. A

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Pesquisa Mundial de Saúde Mental realizada em 17 países constatou que, em média, cerca de

uma em cada 20 pessoas relataram ter um episódio de depressão no ano anterior. Os

transtornos depressivos muitas vezes começam em idade jovem e, muitas vezes, são

recorrentes. Por estas razões, a depressão é a principal causa de incapacidade no mundo em

termos de total de anos perdidos (WHO, 2012).

Portanto, a investigação de novos compostos como ferramentas terapêuticas para tais

distúrbios tem progredido constantemente. Foi iniciado, no laboratório de

Neuropsicofarmacologia da UFC, estudo sobre a ação de sapogeninas esteroidais, isoladas de

Agave sisalana Perrine, no sistema nervoso central (ALMEIDA et al., 2012; SAMPAIO et al.,

2012; VASCONCELOS et al., 2010).

As saponinas são uma classe de metabólitos secundários que apresentam diferentes

funções terapêuticas, de grande interesse comercial e farmacológico (DUNDER, 2009). A

venda mundial de hormônios sexuais, drogas antiinflamatórias, anticoncepcionais e outros

medicamentos de natureza esteroidal é da ordem de bilhões de dólares por ano. Por diversas

razões de ordem química e industrial, a diosgenina, uma sapogenina esteroidal, é considerada

ainda como a principal matéria-prima para a produção de compostos farmacêuticos

esteroidais, mas a crescente demanda tem aberto espaço para outras substâncias, tais como a

hecogenina e a solasodina (SILVA, 2008).

Assim, o foco desta tese é o estudo da hecogenina isolada de Agave sisalana Perrine

no sistema nervoso central de camundongos.

23

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Doenças do Sistema Nervoso Central: ansiedade e depressão

Nas diversas relações que o indivíduo tem na sociedade, pode-se deparar com

problemas de ordem psicológica, social, familiar ou econômica, problemas físicos, estéticos

ou funcionais, valorização que as pessoas atribuem aos contatos sociais, tipos de lazer, que

também podem funcionar como fatores estressantes, tipo de profissão que exerce

características inerentes à pessoa e ao seu convívio. As manifestações de estresse favorecem o

aparecimento de distúrbios relacionados à capacidade de compreensão, interação com o meio

no qual o paciente está inserido, provoca descontroles emocionais como irritabilidade,

cansaço, preocupação, tristeza, distúrbios do humor, dificuldade de memória, inquietação,

ansiedade, dificuldade para relaxar, distúrbios do sono, sensação de medo e depressão

(CASTRO; SCATENA, 2004).

Assim, estados de tensão emocional e de inquietação são experimentados por todas as

pessoas. Para os indivíduos considerados sadios, essas emoções são suficientemente leves e

de tão curta duração que as intervenções farmacológicas são desnecessárias. Entretanto, às

vezes os sintomas de ansiedade tornam-se muito desconfortantes e podem interferir na

capacidade da pessoa agir de modo eficiente (DAILEY, 1996).

As respostas psicológicas, comportamentais e fisiológicas que caracterizam a

ansiedade podem assumir muitas formas. Com frequência, a ansiedade é secundária a estados

mórbidos orgânicos ou decorre de circunstâncias (ansiedade situacional) que, provavelmente,

devem ser enfrentadas apenas uma ou algumas vezes, incluindo a expectativa de

procedimentos médicos, doença familiar ou outro evento estressante. Embora a ansiedade

situacional tenda a ser autolimitada, o uso de sedativo-hipnóticos a curto prazo pode ser

apropriado para o tratamento. A ansiedade excessiva ou irracional em relação às

circunstâncias da vida (transtorno de ansiedade generalizada), os transtornos de pânico e a

agorafobia também são acessíveis à terapia farmacológica, algumas vezes em associação com

psicoterapia (KATZUNG, 2007).

A ansiedade generalizada é caracterizada por preocupação excessiva e tensão contínua

durante os vários eventos diários da vida, com duração de, pelo menos, seis meses, e

incapacidade em controlar estes sentimentos. Esta condição vem acompanhada por, no

mínimo, três ou mais sintomas adicionais, que podem ser psíquicos, como agitação,

dificuldade de concentração, irritabilidade, ou somáticos, incluindo fadiga, tensão muscular e

distúrbios do sono (DSM-IV-TR, American Psychiatric Association, 2002).

24

Além do comportamento subjetivo (emocional) da ansiedade humana, há efeitos

comportamentais e fisiológicos mensuráveis que também ocorrem em animais de

experimentação. Em termos biológicos, a ansiedade induz uma forma particular de inibição

do comportamento que ocorre em resposta a novos eventos ambientais que não sejam

gratificantes (sob condições em que se espera gratificação), ameaçadores ou dolorosos. Em

animais, esta inibição do comportamento pode assumir a forma de imobilidade ou supressão

de uma resposta comportamental, como apertar uma barra para obter alimento (RANG et al.,

2012).

A hipótese de que a severidade ou presença de eventos de vida estressores são

preditivos de severidade ou presença de sintomas de ansiedade ou de transtornos de ansiedade

têm sido alvo de estudos recentes. Diferentes substâncias têm sido estudadas visando

compreender a neurofisiologia que envolve a ansiedade e o estresse. Entre elas as aminas

biogênicas, como a noradrenalina, a dopamina e a serotonina; aminoácidos, como o ácido

gama-aminobutírico (GABA), a glicina e o glutamato; peptídeos, como o fator de liberação de

corticotropina (CRF), o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e a colecisticinina (CCK) e

esteróides, como a corticosterona (MARGIS et al., 2003).

No que se refere ao tratamento farmacológico da ansiedade, os principais grupos de

fármacos ansiolíticos e hipnóticos são os seguintes: Benzodiazepínicos: é o grupo mais

importante, usado como ansiolítico e hipnótico; Buspirona: Agonista do receptor 5-HT1A é

ansiolítico, mas não notavelmente sedativo; Antagonistas dos receptores β-adrenérgicos como

o propanolol, usados para tratar algumas formas de ansiedade, particularmente naquelas em

que os sintomas físicos como sudorese, tremor e taquicardia forem problemáticos. Sua

eficácia depende do bloqueio das respostas simpáticas periféricas, e não de efeito central;

Zolpidem: Este hipnótico atua de forma semelhante aos benzodiazepínicos, embora seja

quimicamente distinto, mas não possui notável atividade ansiolítica; Barbitúricos: Estes estão

obsoletos atualmente e foram suplantados pelos benzodiazepínicos. Seu uso está confinado à

anestesia e ao tratamento da epilepsia; Fármacos variados (p.ex.; hidrato de cloral,

meprobamato e metaqualona). Já não são recomendados, mas como é difícil abandonar

completamente os hábitos terapêuticos, são usados ocasionalmente. Anti-histamínicos

sedativos, como a difenidramina. Algumas vezes são usados como medicamentos para fazer

dormir, particularmente em crianças muito alertas (RANG et al., 2012).

Segundo Venâncio (2009), um agente ansiolítico deve reduzir a ansiedade com pouco

ou nenhum efeito sobre as funções motoras ou mentais, por isso, muitas companhias

farmacêuticas estão conduzindo estudos para encontrar uma alternativa médica com efeitos

ansiolíticos mais específicos.

25

No tocante à depressão, trata-se de um transtorno heterogêneo, que tem sido

classificado de diversas maneiras (KATZUNG, 2007). Os critérios de depressão, presentes

nos dois principais sistemas de classificação dos transtornos mentais, são semelhantes. Para a

Classificação Internacional de Doenças, da Organização Mundial de Saúde (CID-10) e o

Manual Diagnóstico e Estatístico dos Transtornos Mentais, da Associação Psiquiátrica

Americana (DSM-IV), os sintomas depressivos devem estar presentes na maioria dos dias por

pelo menos duas semanas consecutivas e devem causar prezuízo funcional significativo.

Enquanto sintoma, a depressão pode surgir nos mais variados quadros clínicos, entre

os quais: transtorno de estresse pós-traumático, demência, esquizofrenia, alcoolismo, doenças

clínicas, dentre outros. Pode ainda ocorrer como resposta a situações estressantes, ou a

circunstâncias sociais e econômicas adversas. Enquanto síndrome, a depressão inclui não

apenas alterações do humor (tristeza, irritabilidade, falta da capacidade de sentir prazer,

apatia), mas também uma gama de outros aspectos, incluindo alterações cognitivas,

psicomotoras e vegetativas (sono, apetite). Finalmente, enquanto doença, a depressão tem

sido classificada de várias formas, na dependência do período histórico, da preferência dos

autores e do ponto de vista adotado. Entre os quadros mencionados na literatura encontram-

se: transtorno depressivo maior, melancolia, distimia, depressão integrante do transtorno

bipolar tipos I e II, depressão como parte da ciclotimia, dentre outros (DEL PORTO, 1999).

Embora a característica mais típica dos estados depressivos seja a proeminência dos

sentimentos de tristeza ou vazio, nem todos os pacientes relatam a sensação subjetiva de

tristeza. Muitos referem, sobretudo, a perda da capacidade de experimentar prazer nas

atividades em geral e a redução do interesse pelo ambiente. Freqüentemente associa-se à

sensação de fadiga ou perda de energia, caracterizada pela queixa de cansaço exagerado (DEL

PORTO, 1999).

Ressalta-se a hipótese das monoaminas na depressão, a qual, por meio dos estudos

conduzidos com a reserpina, revelou-se que o principal mecanismo de ação desse fármaco

consistia em inibir o armazenamento neuronial de neurotransmissores amínicos, como a

serotonina e a norepinefrina (NA), o que induzia depressão. Assim, foi deduzido que a

depressão devia estar associada à diminuição da transmissão sináptica funcional dependente

de aminas (GOLAN et al., 2010).

Apesar da teoria das monoaminas, foi sugerido que o neurotransmissor dopamina

(DA) também participa da depressão. Um estudo sobre a avaliação do efeito antidepressivo

de uma substância demonstrou que, tal como a bupropriona (um inibidor seletivo da

recaptação de dopamina), o mecanismo subjacente ao efeito de diminuição do tempo de

26

imobilidade no teste de nado forçado em camundongos é dependente do aumento nos níveis

de dopamina na fenda sináptica (MELO et al., 2011).

Foi constatada uma atividade antidepressiva em uma variedade de estruturas químicas.

Entretanto, com a exceção da bupropiona, a ação antidepressiva central até mesmo dos

fármacos mais recentes deriva de mecanismos propostos para os antidepressivos, introduzidos

há quatro décadas. Os antidepressivos tricíclicos, assim denominados em virtude do núcleo

caraterístico com três anéis, vêm sendo utilizados clinicamente há quatro décadas. A

imipramina e a amitriptilina são os protótipos dessa classe de fármacos como inibidores

mistos da captação de norepinefrina e serotonina, embora também exerçam vários outros

efeitos (KATZUNG, 2007). Estudos têm sugerido uma ação antiinflamatória e analgésica para

o antidepressivo amitriptilina (VISMARI, 2010).

A pesquisa de moléculas com maior seletividade para o transportador da serotonina

levou à introdução da fluoxetina, um antidepressivo efetivo e mais seletivo, com toxicidade

autônoma mínima. Desde então, foram introduzidos quatro Inibidores Seletivos da

Recaptação de Serotonina (ISRS), bem como a forma enantiomérica ativa de um deles, o (S)-

citalopram. Todos são estruturalmente distintos das moléculas dos agentes tricíclicos

(GOLAN et al., 2010).

Os inibidores da Monoaminoxidase (MAO) podem ser classificados como hidrazidas,

exemplificadas pelo componente C-N-N, como no caso da fenelzina e da isocarboxazida, ou

como não-hidrazidas, que carecem desse componente, como a tranilcipromina. As hidrazidas

parecem combinar-se de modo irreversível com a enzima, enquanto a tranilcipromina possui

duração prolongada dos efeitos, apesar de não se ligar de forma irreversível. Esses inibidores

mais antigos da MAO são inibidores não-seletivos da MAO-A e da MAO-B. A selegilina, um

inibidor da MAO utilizado no tratamento da doença de Parkinson, que é seletiva para a MAO-

B em baixas doses, porém menos seletiva em doses mais altas, foi aprovada para o tratamento

da depressão maior (KATZUNG, 2007). Os fármacos mais recentes, de terceira geração,

incluem a venlafaxina, a mirtazapina, a nefazodona e a duloxetina.

Neste contexto, sabe-se que os fármacos que agem sobre o SNC produzem seus efeitos

pela modificação de alguma etapa da transmissão sináptica química. Os fármacos que agem

na síntese, no armazenamento, metabolismo e liberação dos neurotransmissores caem na

categoria pré-sinápico. Na região pós-sináptica, o receptor do transmissor fornece o local

primário de ação dos fármacos, podendo estes agirem tanto como agonistas do

neurotransmissor ou podem bloquear a função do receptor (RANG et al., 2012).

27

2.2 Neurotransmissores Centrais

Alguns dos neurotransmissores que atuam no SNC são os aminoácidos (GABA, glicina,

glutamato e o aspartato), acetilcolina, catecolaminas (dopamina, norepinefrina e epinefrina),

histaminas, peptídeos, purinas, entre outros (ALMEIDA, 2006).

2.2.1 Monoaminas

As monoaminas incluem as catecolaminas (dopamina e norepinefrina) e a 5-

hidroxitriptamina (KATZUNG, 2007; GOLAN et al., 2010). As aminas simpaticomiméticas -

catecolaminas contém o grupamento catecol que corresponde ao diidroxibenzeno (anel

benzeno).

A noradrenalina é formada a partir do aminoácido tirosina, de origem alimentar, que

chega até aos locais da biossíntese, como à medula adrenal, às células cromafins e às fibras

sinápticas por meio da corrente sangüínea. A tirosina é transportada para o citoplasma do

neurônio adrenérgico por meio de um carregador ligado ao sódio (Na+). A síntese de

dopamina segue a mesma via que a da noradrenalina, que consiste na conversão da tirosina

em dopa, seguida de descarboxilação para formar dopamina. Os neurônios dopaminérgicos

carecem de dopamina β-hidroxilase e, portanto, não produzem noradrenalina – Figura 1

(RANG et al, 2012). Esse é o ponto chave da sítese de dopamina, pois na ausência da enzima

dopamina β-hidroxilase nos neurônios dopaminérgicos não há conversão de DA em NA,

occorendo, assim, o acúmulo de DA nas vesículas sinápticas (VENÂNCIO, 2009).

28

Figura 1: Biossíntese das catecolaminas (RANG et al., 2012).

29

A dopamina é encontrada em quantidades mais abundandes no corpo estriado,

ocorrendo também em altas concentrações em certas partes do sistema límbico e hipotálamo.

A dopamina é, em grande parte, capturada após a sua liberação das terminações nervosas por

um transportador específico de dopamina. É metabolizada pela MAO e catecol-O-

metiltransferase (COMT), sendo os principais produtos o ácido diidroxifenilacético (DOPAC)

e o ácido homovanílico (HVA, o derivado metoxi do DOPAC) (RANG et al, 2012).

Os efeitos conseqüentes à diminuição na função do sistema dopaminérgico são,

reconhecidamente, demência e depressão, enquanto uma ativação desse sistema conduz à

psicose, ansiedade, confusão e agressão. No sistema de neurotransmissão dopaminérgico, a

atividade neuronal é modulada pela dopamina por meio de duas famílias de receptores

acoplados à proteína-G, os receptores do tipo D1R (D1 e D5) e os do tipo D2R (D2, D3 e D4).

Essa classificação é baseada na estimulação ou inibição, respectivamente, da atividade da

adenilato ciclase (ARAÚJO et al., 2006).

Sobre a 5-hidroxitriptamina (5-HT) é sintetizada a partir do triptofano pela triptofano

hidroxilase (Figura 2), e o suprimento do triptofano é um evento taxa-limitante na síntese de

5-HT, que por sua vez é degradada pela monoamina oxidase em ácido 5-hidroxindolacético

(5-HIAA) (PAGE et al., 2004). A serotonina está envolvida em praticamente todos os

comportamentos tais como o apetite, atividade motora, nocicepção, sexual e humor

(VENÂNCIO, 2009).

30

Figura 2: Biossíntese e metabolismo da 5-hidroxitriptamina (RANG et al., 2012).

31

O principal sítio dos corpos celulares serotonérgicos localiza-se na área da ponte

superior e do mesencéfalo. Os núcleos medianos e dorsais da rafe são as áreas clássicas de

neurônios contendo 5-HT. Os neurônios dos núcleos das rafes se projetam para os gânglios

basais e para várias partes do sistema límbico, e estão amplamente distribuídos ao longo dos

córtices cerebrais, além das conexões cerebrais. Todos os receptores 5-HT identificados até

agora são acoplados à proteína G, exceto o receptor 5-HT3 que é operado por um canal de

Na+/K+ (PAGE et al., 2004).

2.2.2 Aminoácidos Neurotransmissores

O glutamato é o neurotransmissor excitatório predominante no SNC de mamíferos. Esse

neurotransmissor medeia a transmissão química na maioria das sinapses do SNC e está

envolvido em muitos processos fisiológicos importantes, desde o desenvolvimento da

formação das sinapses à aprendizagem e memória. Outros aminoácidos excitatórios, tais como

L-aspartato (ASP), podem exercer ações similares. Uma estimativa bruta é que mais de 50%

de todas as sinapses no SNC são glutamatérgicas (ALMEIDA, 2006). O glutamato é liberado

na fenda sináptica pela exocitose dependente de Ca2+. O glutamato liberado age nos

receptores pós-sinápticos de glutamato e é eliminado pelos transportadores de glutamato

presentes na glia circundante. Na glia, o glutamato é convertido em glutamina pela glutamina

sintetase, liberado da glia, captado pelo terminal nervoso e convertido de volta em glutamato

pela enzima glutaminase, conforme a Figura 3 (KATZUNG, 2007).

O sistema glutamatérgico inclui receptores ionotrópicos e receptores metabotrópicos.

Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluR) agem por meio de segundos

mensageiros via ativação da proteína G. Em condições fisiológicas, a ativação de mGluRs via

glutamato produz uma corrente pós-sináptica lenta. Os mGluRs estão presentes em todas a

regiões do cérebro e vêm sendo considerados um dos maiores moduladores de segundo

mensageiros no SNC em mamíferos. Os receptores ionotrópicos contêm canais iônicos que

quando ativados permitem a entrada de Na+ e K+ favorecendo a despolarização do neurônio.

Eles são divididos em receptores NMDA e receptores não-NMDA, que, por sua, vez incluem

os receptores alfa-amino-3-hydroxi-5-methyl-4 lisoxazole propionic acid (AMPA) e kainato.

Os receptores AMPA e kainato se localizam em regiões telencefálicas e mediam a

transmissão rápida em sinapses excitatórias. Quando ativados, estes receptores induzem uma

despolarização rápida do neurônio pós-sináptico que dura somente alguns milisegundos

(BRESSAN; PILOWSKY, 2003).

32

Outro importante aminoácido no SNC é o GABA, formado a partir do glutamato pela

ação da descarboxilase do ácido glutâmico (DAG), uma enzima encontrada apenas nos

neurônios sintetizadores de GABA no cérebro. O GABA atua como transmissor inibitório em

muitas vias diferentes do SNC. É liberado principalmente por interneurônios curtos, mas

também por tratos GABA-érgicos longos que seguem seu trajeto até o cerebelo e o estriado. A

ampla distribuição do GABA, e o fato de praticamente todos os neurônios serem sensíveis a

seu efeito inibitório, sugerem que a sua função é ubíqua no cérebro. Foi estimado que o

GABA atua como transmissor em cerca de 30% de todas as sinapses no SNC. Em comum

com o glutamato e com vários outros transmissores do SNC, o GABA atua em dois tipos

distintos de receptores: um deles (o receptor GABAA) consiste num canal regulado por

ligante, enquanto o outro (GABAB) é um receptor acoplado à proteína G. Os

benzodiazepínicos, que exercem poderosos efeitos sedativos e ansiolíticos, potencializam

seletivamente os efeitos do GABA sobre os receptores de GABAA (RANG et al., 2012).

O receptor GABAA é um canal iônico acionado por ligante, consistindo de um

aglomerado pentamérico, construído pela associação de 18 ou mais subunidades diferentes. A

subunidade α do complexo pentamérico ocorre em seis isoformas (α1–α6). Diferentes efeitos

benzodiazepínicos podem, assim, estar ligados a diferentes subtipos de receptores de GABAA,

sugerindo a possibilidade de desenvolvimento de novas substâncias com efeitos mais seletivos

do que os benzodiazepínicos existentes (GOLAN et al., 2010; VENÂNCIO, 2009).

Outro neurotransmissor de ação inibitório é a glicina. Está presente em concentrações

particularmente elevadas na substância cinzenta da medula espinhal. Aplicada

ionoforeticamente aos neurônios motores ou aos interneurônios, ela produz hiperpolarização

inibitória que é indistinguível da resposta sináptica inibitória. No entanto, o efeito inibitório

da glicina é distinto de seu papel na ativação facilitadora dos receptores de NMDA. O

receptor de glicina é semelhante ao receptor GABAA sendo um canal iônico multimérico

regulado por ligante. Foram encontradas mutações nos receptores da glicina em alguns

distúrbios neurológicos hereditários associados a espasmos musculares e heperexcitabilidade

reflexa. A glicina também está envolvida na convulsão, visto que drogas como a estricnina,

um veneno com atividade convulsivante que atua principalmente sobre a medula espinhal,

bloqueia tanto a resposta inibitória sináptica quanto a resposta à glicina (RANG et al., 2012).

Ressalta-se que para que o glutamato exerça seus efeitos, há necessidade da presença da

glicina, que também atua sobre seu próprio canal de Cl- operado por receptor (PAGE et al.,

2004).

33

Figura 3: Metabolismo dos aminoácidos transmissores no cérebro (RANG et al., 2012).

34

A taurina, ou ácido 2-aminoetanosulfônico, é um dos aminoácidos livres mais

abundantes em diferentes tecidos, sendo essencial para o funcionamento do sistema nervoso

central dos mamíferos, atuando na osmorregulação, estabilização e manutenção da integridade

da membrana neuronal, e na neuroproteção e controle da homeostasia do cálcio

(SARANSAARI e OJA, 2007). Taurina regula um número incomum de fenômenos

biológicos, incluindo o ritmo cardíaco, a função contrátil, a pressão arterial, agregação

plaquetária, a excitabilidade neuronal, temperatura corporal, aprendizagem, comportamento

motor, o consumo de alimentos, a visão, motilidade espermática, proliferação e viabilidade

celular, metabolismo energético e síntese de ácidos biliares (SCHAFFER; TAKAHASHI;

AZUMA, 2000).

Áreas cerebrais como córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado têm sido

amplamente estudadas (CHAVES, 2012; VENÂNCIO, 2009) com o objetivo de avaliar

alterações em neurotransmissores.

2.3 Áreas cerebrais: Córtex Pré-frontal, Hipocampo e Corpo estriado

As áreas cerebrais estudadas no presente estudo serão o córtex pré-frontal (CPF), o

hipocampo (HC) e o corpo estriado (CE).

O córtex pré-frontal compreende a maior parte do lobo frontal, situado rostralmente ao

córtex pré-motor. É bem desenvolvido apenas em primatas e especialmente em humanos.

Acredita-se que ele desempenhe um papel no julgamento e comportamento afetivos. Lesões

no córtex pré-frontal levam à deficiência das funções executoras, como tomada de decisões,

atribuição de prioridades e planejamento. Estas deficiências costumam manifestar-se em

associação com alterações na emoção e de comportamento social. O córtex pré-frontal é

caracterizado por apresentar três divisões: dorsolateral, ventromedial e medialsuperior. Por

meio de suas conexões com córtices de associação de outros lobos e com o hipotálamo,

tálamo medial e corpo amigdalóide, o córtex pré-frontal recebe informação de todas as

modalidades sensitivas, assim como sobre estados motivacionais e emocionais (AFIFI;

BERGMAN, 2007).

O córtex pré-frontal funcionalmente regula a liberação de dopamina no estriado

dorsolateral, que é mediado por receptores do ácido γ-aminobutírico tipo GABA-A alterando

as funções de locomoção e rearing nos camundongos (CHAVES, 2012).

O hipocampo é uma estrutura complexa que ocupa a porção medial do assoalho do

corno temporal, formando um arco ao redor do mesencéfalo. Anatomicamente, pode ser

dividido em cabeça, corpo e cauda (ISOLAN et al., 2007). Portanto, é constituído de duas

35

massas neuronais, uma em cada hemisfério, encurvadas e mergulhadas na intimidade do

córtex temporal. Em suas trajetórias no sentido ventral, elas se conectam na linha mediana

pelas comissuras hipocampais e projetam-se na área septal, por meio do giro supracaloso. O

septo e o hipocampo constituem-se no substrato neural do sistema de inibição

comportamental que é ativado pelas situações de estresse emocional ou ansiedade

(BRANDÃO; LACHAT; COIMBRA, 2005).

O hipocampo (e suas estruturas adjacentes dos lobos temporal e parietal, em conjunto

chamadas de formação hipocâmpica) tem inúmeras conexões, porém, principalmente,

indiretas com muitas porções do córtex cerebral, assim como as estruturas basais do sistema

límbico – a amígdala, o hipotálamo, o septo e os corpos mamilares. Quase todos os tipos de

experiências sensoriais causam ativação de, pelo menos, alguma parte do hipocampo, e, por

sua vez, o hipocampo distribui muitos sinais eferentes para o tálamo anterior, o hipotálamo e

outras partes do sistema límbico, especialmente pelo fórnix, uma importante via de

comunicação. Assim, o hipocampo é um canal adicional por meio do qual os sinais sensoriais

aferentes podem iniciar reações apropriadas do comportamento, com objetivos diferentes. Da

mesma forma como para as outras estruturas límbicas, a estimulação de áreas diferentes do

hipocampo pode causar quase todos os padrões comportamentais diferentes, tais como prazer,

raiva, passividade ou excesso de impulso sexual (GUYTON; HALL, 2002).

O termo corpo estriado refere-se aos núcleos caudado, putame e globo pálido. Os

termos estriado, estriado dorsal e neostriado referem-se aos núcleos caudado e putame. Os

neurônios neostriatais são de dois tipos: espinhosos e não-espinhosos. O neostriado adulto é

composto de dois compartimentos: o compartimento de estriossomos contém células

fracamente marcadas para acetilcolinesterase, intercaladas por áreas fortemente marcadas, o

compartimento da matriz. Além das diferenças na reação para acetilcolinesterase, os dois

compartimentos diferem nas suas aferências, eferências, neurotransmissores,

neuromoduladores, fontes de aferências dopaminérgicas e distribuição de subtipos de

receptores dopaminérgicos (AFIFI; BERGMAN, 2007).

A maioria dos neurônios no globo pálido e da parte reticular da substância negra é

composta de grandes neurônios multipolares de projeção. Interneurônios são freqüentes.

Todos os neurônios palidais e nigrais usam o GABA como neurotransmissor inibitório. Os

neurônios palidais e nigrais são aproximadamente 100 vezes menos numerosos que os

neurônios estriatais espinhosos, fornecendo, portanto, convergência de aferências do estriado

para o pálido (AFIFI; BERGMAN, 2007).

36

2.4 Estresse oxidativo e as doenças do SNC

2.4.1 Radicais Livres

O conhecimento sobre os radicais livres de oxigênio tem despertado grande interesse

nas últimas décadas, pelo papel desempenhado por essas moléculas em várias situações

clínicas como choque hemodinâmico, septicemia, resposta inflamatória sistêmica, hepatites

fulminantes, hepatite alcoólica, transplante de órgãos, insuficiência cardíaca e respiratória,

entre outras. O ponto comum a todas essas situações clínicas é a existência de microambientes

de hipóxia seguidos por reoxigenação, ou de isquemia seguidos por reperfusão, condições que

propiciam a geração desses radicais livres (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005).

Radical livre é definido como um átomo ou uma molécula que contém um ou mais

elétrons não pareados. Eles alteram a reatividade química de um átomo ou de uma molécula,

normalmente tornando-os mais reativos (HAESER, 2006). Portanto, os radicais livres são

formados em um cenário de reações de óxido-redução, isto é, ou cedem o elétron solitário,

oxidando-se, ou recebem outro, reduzindo-se. Em condições fisiológicas do metabolismo

celular aeróbio, o O2 sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando

na formação de H2O (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Contudo, se ocorrer redução do

oxigênio por um número menor de elétrons, diferentes radicais livres de oxigênio

intermediários podem ser formados, como ilustrado a seguir (ANDRADE JÚNIOR et al.,

2005):

Assim, as principais Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) são: singlet de O2,

hidroxila (*OH), superóxido (*O2-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ressalta-se, ainda, o

envolvimento das Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN) no estresse oxidativo.

O Peróxido de hidrogênio (H2O2) não é um radical livre, mas pode reagir com ânion

superóxido e formar o radical hidroxila (HAESER, 2006). Pode reagir com metais redox-

ativos como ferro e cobre, produzindo novos radicais livres de oxigênio. Além disso, tem

meia vida longa e grande capacidade de se difundir pelas membranas celulares hidrofóbicas

37

(com difusão semelhante à da água), ampliando o efeito tóxico da reoxigenação (ANDRADE

JÚNIOR et al, 2005).

O oxigênio singlet (1O2) também não é um radical, mas pode sofrer rearranjo de

elétrons que o torna mais reativo, ficando no estado excitado, sendo que pode gerar luz

química (quimioluminescência) quando muda do estado excitado para seu estado

fundamental, reagindo com cadeias laterais de ácidos graxos poliinsaturados dos lipídeos de

membrana e, assim, formando peróxidos (HAESER, 2006).

Sobre o superóxido (*O2-), há muitos anos tem-se acreditado que o superóxido é

certamente “super-oxidante” e pode oxidar diretamente biomoléculas pelo chamado ciclo de

Haber-Weiss. Mas agora é bem conhecido que a via prejudicial que pode ser iniciada pelo

superóxido é a reação de Fenton, em que os íons ferrosos decompõem o (H2O2) para os

radiciais hidroxila (*OH): altamente reativos (AFANAS’EV, 2010):

O radical hidroxila (*OH) é considerado a ERO mais reativa em sistemas biológicos.

A combinação extremamente rápida do OH. com metais ou outros radicais no próprio sítio

onde foi produzido confirma sua alta reatividade (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Este

radical livre reage amplamente com aminoácidos, fosfolípides, ácido desoxirribonucleico,

ácido ribonucleico e ácidos orgânicos (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005).

Outro radical livre fisiológico é o óxido nítrico (NO), o qual é produzido pelo

endotélio vascular, por fagócitos e no cérebro pela enzima óxido nítrico sintetase (HAESER,

2006). O NO é o principal mediador citotóxico de células imunes efetoras ativadas e constitui

a mais importante molécula reguladora do sistema imune. Tem um papel como

mensageiro/modulador em diversos processos biológicos essenciais. No entanto, o NO é

potencialmente tóxico. A toxicidade se faz presente, particularmente, em situações de estresse

oxidativo, geração de intermediários do oxigênio e deficiência do sistema antioxidante. A

determinação de ativadores e inibidores específicos da síntese de NO constitui o novo desafio

para o entendimento e o tratamento de várias doenças, e tem sido um dos principais alvos da

indústria farmacêutica (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).

O óxido nítrico (NO) é um radical livre produzido endogenamente a partir da oxidação

de um dos nitrogênios do grupo guanidino terminal do aminoácido L-arginina por oxigênio

38

molecular. Essa biossíntese é catalisada por uma família de enzimas denominadas óxido

nítrico sintases (NOS), as quais podem ser inibidas por análogos estruturais da L-arginina que

possuem grupos substituintes no grupo guanidino terminal. O NO tem significativa

reatividade com espécies químicas diversas tais como oxigênio, ânion superóxido, grupos

tióis e metais de transição, sendo que os íons nitrito (NO2-) e nitrato (NO3

-) são os produtos

finais estáveis da oxidação do NO no entorno fisiológico (TEIXEIRA, 2001).

39

Figura 4: Óxido nítrico e as enzimas óxido nítrico sintases (SANTIAGO et al., 2000).

40

O óxido nítrico foi descoberto em sistemas biológicos muitos anos depois que

superóxido. NO é também relativamente um radical livre inativo, mas pode reagir

rapidamente com superóxido, formando peroxinitrito reativo (AFANAS'EV, 2010):

·O2

− + ·NO → ONO2−

No cérebro, o NO é produzido pela NOS neuronal quase que exclusivamente pela

ativação dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA. Apesar dos neurônios que contêm

NOS representarem apenas 1% das células neuroniais, a ramificação de seus axônios é tão

extensa que parece atingir a grande maioria das células cerebrais (SALUM; PEREIRA;

GUIMARAES, 2008). Há evidências de que a formação excessiva de NO possa ser

neurotóxica. Uma série de estudos tem demonstrado que a estimulação da produção de NO

pelos substratos de NOS, NG-hidroxi-L-arginina (H-ARG) ou L-arginina, produz um

aumento da liberação de DA e de GLU no estriado e em outras regiões cerebrais. Por sua vez,

a inibição de NOS por meio de inibidores enzimáticos como o 7-nitroindazole (7-NI) produz

efeito oposto (KISS; VIZI, 2001).

A reação dos radicais livres com as estruturas celulares de diversos sistemas e órgãos

ocorre de maneira diferente dependendo do tecido analisado. Enquanto alguns deles podem

ser altamente reativos no organismo atacando lipídios, proteínas e DNA, outros são reativos

apenas com os lipídios (MICHELETTI, 2009).

Os ácidos graxos poli-insaturados contidos nas membranas celulares fazem com que

essas sejam potentes geradoras de radicais livres, alcoxila (LO•) e peroxila (LO2•), por meio

da lipoperoxidação. Tal processo constitui-se de reações em cadeia, representadas pelas etapas

de iniciação, propagação e terminação (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Com a ajuda de

metais catalíticos, a decomposição dos hidroperóxidos resulta na formação dos radicais

alcoxil e peroxil que podem iniciar uma reação em cadeia, propagando a peroxidação lipídica.

A seguinte sequência de reações ilustra o fenômeno (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005):

41

O processo de peroxidação lipídica pode causar modificações em alguns aminoácidos

como triptofano, cisteína, histidina e tirosina, responsáveis pela formação de algumas

proteínas, gerando doenças mutagênicas. O resíduo de triptofano, quando atacado por

espécies radicalares, perde o grupamento aromático e consequentemente não participa mais

no processo bioquímico normal (ROVER JUNIOR et al., 2001).

Os radicais livres de oxigênio são difíceis de se detectar nos ensaios experimentais

pela sua meia vida curta. Para superar essa dificuldade técnica, muitos métodos têm surgido

baseados na detecção de produtos estáveis formados pela ação dos radicais livres de oxigênio

em substratos específicos. Os hidroperóxidos são os produtos estáveis formados durante a

peroxidação de lipídios insaturados, como ácidos graxos e colesterol. Entre os métodos

disponíveis para a detecção dos hidroperóxidos, destacam-se o TBARS e o método químico

FOX (ferrous oxidation in xylenol orange). O método TBARS é um dos mais utilizados para

estudos de peroxidação lipídica, e é baseado na reação do malondialdeído com o ácido

tiobarbitúrico (ANDRADE JÚNIOR et al., 2005).

2.4.2 Sistema de defesa antioxidante

Sobre o sistema de defesa antioxidante, sabe-se que o estado de estresse oxidativo é

resultante de um desequilíbrio entre as moléculas pró e antioxidantes, comumente associado a

danos celulares (MAGALHÃES; FRIES; KAPCZINSKI, 2012).

Para manter a homeostase, é essencial o equilíbrio entre a geração de agentes pró-

oxidantes e o sistema de defesa antioxidante (MICHELETTI, 2009). Os antioxidantes atuam

em diferentes níveis na proteção dos organismos: O primeiro mecanismo de defesa contra os

radicais livres é impedir a sua formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia

com o ferro e o cobre. Os antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres gerados

pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os lipídeos, os

aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poliinsaturados e as bases do

DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular. Os antioxidantes obtidos

da dieta, tais como as vitaminas C, E e A, os flavonóides e carotenóides são extremamente

importantes na intercepção dos radicais livres (BIANCHI; ANTUNES, 1999).

Outro mecanismo de proteção é o reparo das lesões causadas pelos radicais. Esse

processo está relacionado com a remoção de danos da molécula de DNA e a reconstituição

das membranas celulares danificadas. Em algumas situações pode ocorrer adaptação do

organismo em resposta a geração desses radicais com o aumento da síntese de enzimas

antioxidantes (BIANCHI; ANTUNES, 1999).

42

Os antioxidantes são agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas

pelos radicais livres nas células. Eles podem ser classificados em antioxidantes enzimáticos:

superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), NADPH-quinona oxidoredutase, glutationa

peroxidase (GSH-Px), enzimas de reparo. Os antioxidantes não enzimáticos compreendem:

alfa-tocoferol (vitamina E), Ácido ascórbico (vitamina C), flavonóides, proteínas do plasma,

Glutationa (GSH), L-cisteína (MICHELETTI, 2009).

Ressaltam-se, ainda, os minerais no sistema de defesa não-enzimático como: zinco,

cobre, magnésio e selênio. Estudo mostrou que a suplementação de selênio ou selênio e

magnésio simultaneamente melhorou significativamente a defesa antioxidante e foi mais

eficaz contra o estresse oxidativo induzido por álcool, alterações da função hepática e

metabolismo do colesterol do que o uso isolado de magnésio (MARKIEWICZ-GO'RKA et

al., 2011).

Portanto, muitas das reações radicalares prejudiciais in vivo são evitadas ou modificadas

pela ação de agentes inibidores ou antioxidantes. Por exemplo, no caso de superóxidos, a

enzima SOD age como agente de defesa contra esta espécie, enquanto as enzimas catalase e

GSH-Px atuam sobre H2O2 (ROVER JUNIOR et al., 2001).

Catalase, enzima localizada em peroxissomos, catalisa a conversão do peróxido de

hidrogênio em água e oxigênio molecular, considerando que GSH-Px varre o peróxido de

hidrogênio na presença de GSH, obtendo-se a glutationa oxidada (GSSG) e água (WOJCIK;

BURZYNSKA-PEDZIWIATR; WOZNIAK, 2010).

As propriedades multifuncionais da glutationa estão refletidas num interesse crescente

desta molécula como parte integrante de investigações às mais diversas, incluindo

mecanismos enzimáticos de regulação antioxidante, biossíntese de macromoléculas, câncer,

toxicidade devido à oxigenoterapia prolongada e mais recentemente associações com lesões

oxidativas em DNA. Um dos papéis do ciclo redox da glutationa e enzimas que compõem seu

metabolismo é o de manter os níveis de hidroperóxidos lipídicos a níveis controlados, para

evitar danos celulares provenientes do ataque desses radicais (ROVER JÚNIOR et al., 2001).

A enzima glutationa redutase é responsável pela recuperação da glutationa à sua forma

reduzida (GSH). Esse processo ocorre na presença de nicotinamida adenina dinucleotídeo

fosfato (NADPH) (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; ROVER JÚNIOR et al., 2001;

WOJCIK; BURZYNSKA-PEDZIWIATR; WOZNIAK, 2010).

43

Figura 5: Estresse oxidativo. Ânion superóxido pode evoluir para radical hidroxila. Também pode reagir com o óxido nítrico para formar peroxinitrito. Ambas as espécies são os principais responsáveis pelo dano oxidativo. SOD: superóxido dismutase; CAT: catalase; GSH: glutationa reduzida; GSH-perox.: glutationa peroxidase; GSSG: glutationa oxidada; GSH red.: glutationa redutase. Fonte: MADRIGAL et al., 2006.

44

2.4.3 Sistema de defesa antioxidante no Sistema Nervoso Central

As células cerebrais são vulneráveis ao estresse oxidativo. O cérebro tem um conteúdo

lipídico relativamente alto, com grande quantidade de ácidos graxos insaturados, os quais são

substratos para os radicais livres e a peroxidação lipídica. Atividades de enzimas

antioxidantes, como a catalase e glutationa peroxidase, e níveis des moléculas antioxidantes,

como a glutationa (GSH) e vitamina E, são baixas no cérebro. O cérebro é rico em ferro que

pode ser um poderoso catalisador para formação de hidroxila (BOVERIS;

OPORTUNIDADE, 1973; TURRENS, 1997). Além disso, o SNC tem uma capacidade

limitada de regeneração. Estas características tornam o cérebro particularmente sensível a

danos oxidativos (ARMAGAN; KANIT; YALCIN, 2011).

Mecanismos de defesa antioxidantes, tais como GSH, catalase, superóxido dismutase

(SOD), GSH-Px e vitamina E, normalmente impedem ou limitam a produção de ERO e danos

teciduais neuronais (ARMAGAN; KANIT; YALCIN, 2011).

Ressalta-se que tem havido interesse em compreender as interações dos

neurotransmissores centrais e o sistema de defesa antioxidante, possivelmente envolvidos em

desordens como ansiedade, depressão e outras condições neurológicas.

Estudos pré-clínicos já demonstraram que os níveis de vitaminas E e C estão reduzidos

em soro de pacientes deprimidos. Além disso, drogas antidepressivas demonstraram

propriedades antioxidantes e alguns antioxidantes têm efeitos antidepressivos (SCAPAGNINI

et al., 2012).

Além da relação entre depressão e estresse oxidativo, outro estudo demonstrou a ação

de drogas antipsicóticas. Na pesquisa, o estresse oxidativo foi induzido pela cetamina por

elevação da peroxidação lipídica, aumento da atividade da catalase e da concentração de

nitrito. No entanto, os antipsicóticos típicos e atípicos reverteram os efeitos da cetamina sobre

estresse oxidativo, mostrando atividade de neuroproteção nas áreas cerebrais estudadas

(SAMPAIO, 2011).

Os efeitos antioxidantes de fármacos usados no tratamento de distúrbios psiquiátricos

também têm sido alvos de investigação. Foi demonstrado que o emprego do clonazepam

como agente antidepressivo, associado a seu efeito ansiolítico, é de especial interesse para

pacientes diabéticos insulino-dependentes, uma vez que a ansiedade também está presente

nesta doença. Outra vantagem do emprego deste fármaco é que ele parece diminuir o estresse

oxidativo de animais diabéticos. Atuando como antioxidante, o clonazepam pode diminuir o

efeito das ERO sobre os sistemas, reduzindo algumas complicações secundárias nos

diabéticos, como, por exemplo, a encefalopatia diabética (HAESER et al., 2007).

45

Ainda no tocante ao estresse oxidativo e ansiedade, outro estudo avaliou a influência

do Labirinto em Cruz (LCE), um teste comportamental amplamente utilizado para avaliar o

efeito de drogas ansiolíticas, na geração do estresse oxidativo e demonstrou que este teste

comportamental pode causar alterações oxidativas importantes no SNC (MICHELETTI,

2009).

Em outro estudo, a avaliação dos efeitos do ácido lipóico (AL) no conteúdo de

glutamato e taurina no hipocampo de ratos durante convulsões induzidas por pilocarpina

demonstrou que o pré-tratamento com o antioxidante reduziu significativamente o nível de

glutamato e aumentou os níveis de taurina no hipocampo dos ratos, quando comparado ao

grupo pilocarpina, sugerindo que o efeito protetor poderia ser alcançado com pré-tratamento

com ácido lipóico, provavelmente pelo aumento da liberação ou redução da taxa de

metabolização dos aminoácidos durante as convulsões (SANTOS et al., 2011).

Muitos compostos de origem vegetal vêm sendo avaliados quanto ao potencial

antioxidante no SNC, tais como o Extrato de Ginkgo biloba (EGb 761) (URÍKOVÁ et al.,

2006), dentre outros. Pesquisa conduzida com Dioscorea pseudojaponica Yamamoto

demonstrou que, nas doses de 100 ou 500 mg/kg, houve melhora das alterações cognitivas,

como também aumentou a atividade de enzimas antioxidantes endógenas no cérebro de ratos

(CHUAN-SUNG et al., 2009). Cabe ressaltar que os tubérculos dessa espécie contêm

saponinas esteroidais.

46

2.5 Saponinas e Sapogeninas esteroidal

Dá-se o nome de saponinas (do latim sapon = sabão) a um grupo de glicoconjugados

que se dissolvem na água e diminuem sua tensão superficial de modo que, ao se agitar suas

soluções, forma-se uma espuma abundante e relativamente estável. A estrutura das saponinas

consiste em uma porção oligossacarídea formada por carboidratos como glicose, galactose, N-

acetilglucosamina, ácido glicurônico, xilose, ramnose ou metilpentose ligada a uma porção

aglicona (não-acúcar), insolúvel em água, chamada genericamente de sapogenina e quando

esta possui um esqueleto esteroidal, ela é chamada de sapogenina esteroidal - Figura 6

(SILVA, 2008).

Figura 6: Estrutura geral das saponinas esteroidais (SILVA, 2008).

Saponinas já foram descritas em mais de 100 famílias botânicas (DUNDER, 2009). As

saponinas incluem uma grande variedade de moléculas que podem apresentar várias

aplicações na farmacologia como antiinflamatória, antitumoral, hipocolesterolêmica, anti-

HIV, antibacteriana, antifúngica, moluscicida e atividade anti-Leishmania (COSTA et al.,

2011; SILVA et al., 2005).

Dentre as plantas ricas em saponinas esteroidais, citam-se as plantas da família

Agavaceae, principalmente do gênero Agave, com destaque para Agave sisalana, conhecida

como sisal. A composição química, atividades biológicas e farmacológicas da Agave sisalana

foram descritas nos resultados (Artigo 1) desta tese.

47

Justificativa e Relevância

A realização de pesquisas com compostos bioativos presentes nas plantas representa

uma oportunidade para se obter benefícios à saúde da população. Conforme explicitado, o

Ministério da Saúde (2012) tem encorajado o desenvolvimento de estudos com plantas

tradicionais. Estudos sobre a ação de moléculas isoladas de plantas no SNC revestem-se de

fundamental importância devido o cérebro ser considerado a área de controle de quase todas

as atividades vitais.

A hecogenina, isolada de A. sisalana, possui diversas atividades farmacológicas como

antiinflamatória, antifúngica, antitumoral, vasodilatadora e gastroprotetora (CERQUEIRA et

al., 2009; DUNDER et al., 2010). No entanto, ainda considera-se escasso o conhecimento

acerca do potencial terapêutico de hecogenina, sendo ainda mais raros os estudos sobre sua

ação no SNC.

Tabach (2011) explica que o estudo com plantas medicinais que possuam um efeito

sobre o SNC se faz necessário, pois grande parte da população mundial possui baixo poder

aquisitivo e não tem acesso a medicamentos de origem sintética; além disso, a procura por

novas ferramentas terapêuticas para o tratamento de doenças cujos efeitos colaterais estejam

ausentes ou em menor intensidade do que seu equivalente sintético é uma das metas de toda a

pesquisa pré-clínica e clínica da atualidade.

Em se tratando de neuropatologias associadas aos radicais livres, grandes esforços têm

sido empregados para a identificação e graduação da capacidade antioxidante de extratos

vegetais e de fitoterápicos isolados de plantas (ALMEIDA, 2006), visto que o estresse

oxidativo está envolvido na gênese de várias doenças como as neurodegenerativas. Ressalta-

se que o bloqueio da produção de radicais livres com o uso de hecogenina foi demonstrado

em um estudo (CERQUEIRA et al., 2011). No entanto, é necessário estudar a ação

antioxidante dessa susbstância no SNC.

Sabendo-se que a espécie vegetal saponínica Agave sisalana está largamente presente

no Nordeste, é importante buscar suas ações no SNC, por meio de estudos farmacológicos,

trazendo, assim, perspectivas de uso medicinal da Agave sisalana. Destaca-se também a

integração de pesquisadores do Nordeste para o desenvolvimento deste projeto, fortalecendo

os Grupos de pesquisa da região e promovendo avanço científico e tecnológico. Espera-se que

a hecogenina possa contribuir para a descoberta de novos agentes a serem utilizados como

alternativas terapêuticas relacionadas às doenças do sistema nervoso central, o que poderá

contribuir ainda para agregar valor à produção da planta no Nordeste.

48

3 OBJETIVOS

Estudar os efeitos comportamentais, neuroquímicos e antioxidante após a administração

aguda e em doses repetidas de hecogenina isolada da espécie Agave sisalana em

camundongos.

Artigo 1:

• Fazer uma revisão sistemática acerca da composição química, atividades biológicas,

aspectos farmacológicos de Agave sisalana Perr., ressaltando desde os aspectos botânicos

da planta, prováveis mecanismos de ação e toxicidade.

Artigo 2:

• Determinar os efeitos comportamentais da administração aguda e em doses repetidas da

hecogenina, isolada de Agave sisalana Perrine, em camundongos por meio dos modelos

de ansiedade, depressão e atividade motora.

Artigo 3:

• Verificar as concentrações de aminoácidos excitatórios e inibitórios no córtex pré-frontal

(CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE) de camundongos após a administração

aguda de hecogenina.

Artigo 4:

• Determinar as concentrações das monoaminas (dopamina (DA), norepinefrina (NA),

serotonina (5-HT)), e seus metabólitos (ácido 3,4-hidroxifenil (DOPAC), ácido

homovanílico (HVA) e 5 ácido hydroxiindolacético (5-HIAA)) no corpo estriado de

camundondos após administração aguda de hecogenina.

Artigo 5:

• Avaliar o efeito da administração aguda e em doses repetidas de hecogenina sobre

parâmetros de estresse oxidativo em CPF, HC e CE de camundongos.

49

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material Vegetal

A folha de Agave sisalana Perrine foi coletado de várias plantações de sisal, na

cidade de Santa Rita, Estado da Paraíba, Brasil, em abril de 2007. A exsicata, L.P. Felix

6246 (EAN) está depositada no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB), Universidade

Federal da Paraíba, Brasil.

Hecogenina foi obtida pelo Pesquisador Dr. José Maria Barbosa Filho do Laboratório

de Tecnologia Farmacêutica - Universidade Federal da Paraíba (UFPB) seguindo a

metodologia de Jaffer et al (1983); Agrawal et al (1985); Kim et al (2001). As amostras das

folhas secas de A. sisalana (5 kg) foram extraídas com seis litros de álcool etílico (etanol)

95% em um aparelho de Soxhlet por 24 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida

e o resíduo foi hidrolisado sob refluxo por quatro horas com 1,5 litros de ácido hidroclórico

etanólico 2N. A mistura reacional foi coletada e filtrada. A fração ácida insolúvel foi lavada

com água, solução de carbonato de sódio e água, até neutralizar. Depois de seco, o resíduo

ácido insolúvel foi extraído com hexano em um aparelho Soxleht por 12 horas. O extrato

hexânico foi levado à um refrigerador por 24 horas. Após este período, um precipitado foi

formado. O precipitado foi filtrado e depois recristalizado em acetona, formando 1g de

hecogenina (0,02%), m.p. 256-258°C (lit.1 258 – 260°C). A hecogenina encontrada é

idêntica a uma amostra autêntica (co-TLC e mixed m.p.). 1H- e 13C-NMR (500 e 125 MHz)

o espectro da hecogenina está de acordo com a literatura previamente citada (AGRAWAL et

al., 1985; JAFFER et al., 1983). O acetato de hecogenina foi obtido por reação de acetilação

da hecogenina com uma mistura de anidrido acético/piridina (KIM et al., 2001). O

sobrenadante foi concentrado e o resíduo foi submetido à cromatografia em coluna e

cromatografia líquida em camada delgada com fase fixa sílica gel produzindo mais

hecogenina (0.35 g, 0.007 %), 200 – 202 o C (lit.5 200 – 202 o C). A estrutura da hecogenina

usada neste estudo é mostra na Fig. 7.

50

Figura 7: Estrutura Molecular da Hecogenina.

4.2 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando 25-35g, provenientes do

Biotério da Universidade Federal do Ceará (UFC). Todo o manejo e manutenção desses

animais, antes, durante e após experimentação, seguiu as regras de manutenção e

manipulação de animais de laboratório, preconizadas pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA, 2008). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Nº protocolo 44/2010).

51

4.3 Reagentes e Drogas

Quadro 1: Reagentes e Drogas utilizados nos experimentos

Drogas Origem

Ácido perclórico Sigma® – USA

Ácido Tiobarbitúrico Sigma® – USA

DA, 5-HT, DOPAC, HVA e 5-HIAA

Sigma® – USA

Diazepam Cristália Prod. Química Farm. Ltda® (São Paulo, Brasil)

Flumazenil Cristália Prod. Química Farm. Ltda® (São Paulo, Brasil)

GABA, Glutamato, Glicina, Taurina, Aspartato

Sigma – USA

Imipramina Novartis Biociências S.A. ® (São Paulo, Brasil)

Reserpina Sigma Chem. Co. ® (St. Louis, MO, USA)

Tween 80 Vetec Química Farm. Ltda® (Rio de Janeiro, Brasil)

vitamina E Laboratório Teuto®, Brasil

52

4.4 Equipamentos

Quadro 2: Equipamentos utilizados nos experimentos

Equipamentos Origem

Balança analítica Modelo H5, Mettler, Suíça

Balança para animais Filizola ID-1500 – (Brasil)

Banho-maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil

Campo Aberto para camundongos Fabricação própria

Centrífuga refrigerada Modelo 215 – Fanem (Brasil)

Cronômetros Incoterm, Brasil

Deionizador USF Elga, USA

Equipamento de Cromatografia Líquida da

Alta Performance (HPLC) Detector de

fluorescência e eletroquímico

Shimadzu, Japão

Freezer Legacy Sistem, U.S.A

Guilhotina Harvard, USA

Homogeinizadores elétricos Bellico, USA

Labirinto em Cruz Elevado para

camundongos

Fabricação própria

Material cirúrgico

Micropipetas, H.E. Pedersen, Dinamarca

Placa Perfurada Ugo Basile, Italy

Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc. NY, USA

53

4.5 Protocolo de tratamento agudo para os testes de comportamento

4.5.1 Avaliação da atividade exploratória da hecogenina no teste de campo aberto

No teste do campo aberto (Quadro 3), foram usados os grupos: controle (Tween 80

4%); HEC 5, 10, 20 ou 40 mg/kg; diazepam (DZP) 2 mg/kg. Todos os grupos foram tratados

por via intraperitonial (ip) e 30 minutos depois os animais foram submetidos aos testes de

campo aberto, labirinto e Placa Perfurada. A via de administração intraperitoneal foi escolhida

para este estudo devido a baixa absorção das saponinas no trato gastrointestinal (DUNDER et

al., 2010).

Quadro 3 – Esquema do teste do campo aberto

Archer, 1973

30 minutos

Rearing GroomingALE (número de travessias)

5 minutos

Hecogenina

Teste do Campo Aberto

54

4.5.2 Avaliação da atividade ansiolítica da hecogenina e envolvimento do sistema

GABAérgico no Teste do Labirinto em cruz elevado

Os grupos usados no teste de labirinto foram divididos da seguinte forma: controle

(Tween 80 4 %), hecogenina (HEC) 5, 10, 20 ou 40 mg/kg; diazepam (DZP) 1 mg/kg;

flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg; DZP 1 mg/kg + FLU 2,5 mg/kg; FLU 2,5 mg/kg + HEC 20 ou

40 mg/kg.

Os animais tratados com FLU 2,5 mg/kg associado a HEC na dose de 20 ou 40 mg/kg

foram submetidos ao seguinte protocolo: administrou-se FLU-2,5 e 15 minutos depois foi

injetado HEC e, então, após 30 minutos foram submetidos ao experimento.

55

Quadro 4 – Teste do Labirinto em Cruz Elevado

Quadro 4A

Quadro 4B

56

4.5.3 Avaliação da atividade ansiolítica da hecogenina e envolvimento do sistema

GABAérgico no Teste da Placa Perfurada

Referente à placa perfurada, os camundongos foram tratados da seguinte forma:

controle (Tween 80 4 %); HEC 20 ou 40 mg/kg; diazepam (DZP) 1 mg/kg; flumazenil (FLU)

2,5 mg/kg; DZP 1mg/kg + FLU 2.5 mg/kg; FLU 2.5 mg/kg + HEC 20 ou 40 mg/kg.

Quadro 5 – Teste de Placa Perfurada

Quadro 5A

Quadro 5B

57

4.5.4 Avaliação da atividade antidepressiva da hecogenina no teste de suspensão de cauda

O tempo de imobilidade dos animais foi avaliado por meio do teste de suspensão de

cauda. A imipramina (IMI), um antidepressivo clássico, foi usada sozinha como controle

positivo. Reserpina (RES), uma droga que causa depleção das aminas biogênicas

(Noradrenalina, dopamina e serotonina), também foi utilizada como controle positivo. Os

animais foram divididos em sete grupos: controle (Tween 80 4 %), hecogenina (HEC) 5, 10,

20 ou 40 mg/kg; Imipramina (IMI) 10 mg/kg e RES 2 mg/kg.

Com o intuito de avaliar o mecanismo de ação do efeito antidepressivo da HEC 5, 10,

20 ou 40 mg/kg, RES 2 mg/kg foi administrada 10 minutos antes da HEC e o teste foi

realizado 30 minutos depois (ARAGÃO et al., 2006).

58

Quadro 6 – Teste de suspensão de cauda

Quadro 6A

Quadro 6B

Os esquemas dos quadros 3, 4 e 5 foram elaborados a partir do trabalho de Chaves

(2012).

59

4.6 Protocolo de tratamento em doses repetidas para os testes de comportamento

Na segunda fase dos experimentos, os animais foram assim agrupados: 1) Controle –

Tween 80 4 %); 2) diazepam (DZP) 1 mg/kg; 3) HEC 20 mg/kg; 4) HEC 40 mg/kg; 5)

Imipramina (IMI) 10 mg/kg. Nesta fase, cada grupo de animais foi tratado diariamente com o

composto durante um período de 7 dias. Todas as administrações foram realizadas por via ip.

Os experimentos para avaliação dos efeitos comportamentais da administração em doses

repetidas da HEC, DZP ou IMI no SNC de camundongos por meio dos modelos de ansiedade,

depressão e atividade motora foram realizados no sétimo dia de tratamento após 30 minutos

da administração dos compostos citados.

4.7 Testes de comportamento

4.7.1 Avaliação da atividade exploratória - Teste do campo aberto

O campo aberto para camundongos é feito de acrílico (paredes transparentes e piso

preto, 30 x 30 x 15 cm) dividido em 9 quadrantes iguais. A metodologia de Archer (1973) foi

utilizada para avaliar a atividade exploratória do animal. Os principais parâmetros para

observação durante o teste: número de cruzamentos com as quatros patas (Atividade

Locomotora Espontânea - ALE), número de comportamentos de autolimpeza (“grooming”),

número de levantamentos (“rearing”), registrados durante um tempo de 5 minutos, após 1

minuto de habituação. A tendência natural do animal em um ambiente novo é a de explorá-lo,

apesar do conflito com o medo provocado pelo ambiente novo.

4.7.2 Avaliação da atividade ansiolítica - Teste do Labirinto em cruz elevado (“plus

maze”)

Sabe-se que para que novos ansiolíticos sejam desenvolvidos, é importante que se

façam testes em animais. Nesse contexto, um rato colocado em um ambiente ao qual não está

familiarizado normalmente responde ficando imóvel, embora alerta (supressão

comportamental) por algum tempo, o que pode representar ansiedade produzida pelo

ambiente estranho. Esta imobilidade se reduz se forem administrados ansiolíticos. O labirinto

em cruz elevada é um modelo de teste amplamente usado (RANG et al., 2012).

O labirinto em cruz elevado (LCE) (LISTER, 1990) consiste de dois braços abertos

opostos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x 25 cm), também opostos, em forma de

cruz. Os braços abertos e fechados estão conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A

plataforma, as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico

transparente e o chão em acrílico preto. O aparelho está elevado a uma altura de 45 cm do

60

nível do chão. Trinta minutos após a administração da HEC ou o veículo, os camundongos

foram colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para um dos braços fechados e o

seu comportamento observado por 5 min. As medidas comportamentais registradas no LCE

compreeenderam: frequência de entradas e o tempo despendido nos braços abertos e nos

fechados. Um aumento seletivo nos parâmetros correspondentes aos braços abertos revela um

efeito ansiolítico (PELOW et al. 1985), entre outros achados. Normalmente, os ratos passam a

maior parte do tempo nos braços fechados e evitam os braços abertos (medo, possivelmente,

de cair) (RANG et al., 2012).

4.7.3 Avaliação da atividade ansiolítica - Placa Perfurada (hole board)

O hole board consiste numa caixa quadrada de acrílico (50 x 50 cm) a 10 cm de altura,

com 16 orifícios e 2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas. Registrou-se o

número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa (CLARK et al.

1971) por um período de 5 minutos para avaliação de possível ação ansiolítica da hecogenina.

4.7.4 Avaliação do efeito antidepressivo – Teste de suspensão de cauda

Para o teste de suspensão de cauda, utilizou-se o método descrito por Porsolt et al.

(1978). Os camundongos foram suspensos pela cauda na borda de uma plataforma 58 cm

acima de uma mesa com fita adesiva colocados cerca de 1 cm da ponta da cauda. A duração

da imobilidade foi registrada durante um período de cinco minutos. Cada animal foi utilizado

apenas uma vez.

4.8 Testes Neuroquímicos

4.8.1 Protocolo de tratamento para os experimentos sobre estresse oxidativo

Protocolo agudo: Os animais foram divididos em 6 grupos, recebendo HEC via ip

nas doses de 5, 10, 20 ou 40 mg/kg; animais controle receberam Tween 80 4% ou vitamina

E (400 mg/kg) pela mesma via. Após 30 minutos de administração, os animais foram

sacrificados e as áreas do cérebro como CPF, HC e CE (Figura 8) isoladas e

homogeneizadas para avaliação da peroxidação lípídica, atividade da catalase e

determinação de Nitrito/Nitrato.

Protocolo em doses repetidas: Os experimentos relacionados a avaliação antioxidante

da hecogenina após 7 dias de tratamento dos animais somente foram realizados com as doses

61

que mostraram atividade farmacológica nos testes comportamentais e no tratamento agudo

citado.

Figura 8: Áreas cerebrais dissecadas (VENÂNCIO, 2009).

4.8.1.1 Avaliação da peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi analisada determinando-se a concentração de

malonildialdeído (MDA), uma das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), em

homogenatos (HUONG et al., 1998). Resumidamente, as amostras foram misturadas com

tampão fosfato 50 mM de potássio (pH 7,4), e 63 µL de homogenato foram misturados com

100 µL de ácido perclórico a 35%. As amostras foram então centrifugadas (3,350 g/10 min) e

150 µL dos sobrenadantes foram recuperados e misturada com 50 µL de ácido tiobarbitúrico a

1,2%. A mistura foi, então, colocada em banho de água e aquecida por 30 minutos em 95-

100°C. Depois que a solução foi resfriada, a absorbância foi medida em comprimento de onda

de 532 nm e os resultados expressos como µmol MDA/g de tecido.

4.8.1.2 Avaliação da atividade da catalase

A atividade da enzima catalase foi medida por meio do método que emprega a geração

H2O e O2 a partir do peróxido de hidrogênio (MAEHLY; CHANCE, 1954). A atividade da

enzima foi medida pelo grau desta reação. Uma alíquota das amostras (20 µl) foi adicionada a

62

980 µl de meio reativo (H2O2 15%, Tampão Tris-HCl 1 M; EDTA 5 mM pH 8,0; H2O Milli-

Q). As absorbâncias inicial e final foram gravadas a 230 nm após o 1º e 6º minuto,

respectivamente. Uma curva padrão foi estabelecida utilizando catalase pura (Sigma, MO,

USA) sob condições idênticas. Todas as amostras foram diluídas com 0,1 mmol/l de tampão

fosfato (pH 7.0) para provocar 50% de inibição da taxa de diluente. Os resultados foram

expressos em µM/min/µg de proteína.

4.8.1.3 Determinação de Nitrito/Nitrato

A concentração de nitrito foi determinada nos cérebros dos camundongos

homogeneizados imediatamente após a decapitação em todos os grupos. Após centrifugação

(800×g/10 min), o sobrenadante do homogenato foi coletado e a produção de Óxido Nítrico

(NO) foi determinada com base na reação Griess 50 (GREEN; TANNENBAUM;

GOLDMAN, 1981). Para tanto, 100µL do sobrenadante foi incubado com 100µL do reagente

de Griess (sulfanilamine em 1% H3PO4/0.1% N-(1-naftil) etilenodiamina-dicloridrato / 1%

H3PO4 / água destilada, 1:1:1:1) em temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi

medida em leitor de microplaca a 550nm. A curva padrão foi preparada com várias

concentrações de NaNO2 (variando de 0,75-100 µM) e os resultados expressos em µmol/g de

tecido.

4.8.2 Protocolo de tratamento para Dosagem de Aminoácidos e Monoaminas

Foram realizadas dosagens de aminoácidos no CPF, HC e CE e Monoaminas no CE.

Assim, após 30 minutos da administração aguda da HEC, os animais foram sacrificados por

rápida decapitação e seus cérebros foram removidos e lavados em salina gelada. As regiões

cerebrais citadas foram dissecadas, congeladas e armazenadas a -70 ºC até serem utilizadas

para os ensaios.

63

4.8.2.1 Dosagem de Aminoácidos

Para a determinação das concentrações de aminoácidos, utilizou-se o equipamento de

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detector de fluorescência (Figura

9). A espectroscopia de fluorescência pode ser usada como um método de detecção específica,

e é um dos mais sensíveis para compostos que fluorescem. Fluorescência pode ser

desenvolvida em compostos não fluorescentes por reações de derivatização realizadas pré ou

pós-coluna (HALLMAN, SUNDSTRÖM, JOSSON et al., 1984).

Figura 9: Aparelho de HPLC com detecção de Fluorescência e eletroquímica – Soluções Reagentes (AGUIAR, 2002).

Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30s e

centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O sobrenadante foi

separado e filtrado por meio de uma membrana (millipore - 0,2 µm) e, posteriormente,

associado a uma solução de derivatização pré-coluna, para obtenção de fluorescência, em uma

proporção de 1:1. Um minuto depois do início dessa associação uma alíquota de 20 µl foi

retirada e injetada no equipamento de HPLC para a análise química.

Para a análise dos aminoácidos, uma coluna CLC-ODS (M) com comprimento de 15

cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 m, da Shimadzu-Japão foi utilizada. A fase

móvel foi utilizada em gradiente com duas fases: A- NaH2PO4 (50mM) e metanol (20%, v/v)

em pH 5,5; B- Metanol puro (100 %). Aspartato (ASP), Glutamato (GLU), Glicina (GLI),

Taurina (TAU) e GABA foram detectados com uso de um detector de fluorescência (Modelo

RF-535 da Shimadzu, Japão) com comprimento de ondas de EX-Wavelength (370 nm) e EM-

64

Wavelength (450 nm). Os cromatogramas foram registrados e quantificados por um

computador usando um software da Shimadzu. A quantidade dos aminoácidos foi calculada

por comparação da altura dos picos obtidos com a média dos padrões e os resultados

expressos em µmol/g de tecido.

4.8.2.2 Determinação das concentrações das monoaminas e seus metabólitos

O CE foi utilizado para preparar homogenatos a 10%. Os tecidos cerebrais foram

sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30 s e centrifugados por 15 minutos em

centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µl do sobrenadante foi, então,

injetada no equipamento de HPLC com detecção eletroquímica, para a análise química.

Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de 25

cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 µm, da Shimadzu-Japão, foi utilizada. A fase

móvel utilizada foi composta por tampão ácido cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido

octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS), como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4

% v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v. Dopamina (DA), DOPAC (Ácido diidroxifenilacético

(DOPAC), Ácido homovanílico (HVA), Serotonina (5-HT), Ácido 5-hidroxiindolacético (5-

HIAA) e Noradrenalina (NE) foram eletronicamente detectados usando um detector

amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em um eletrodo de

carbono vítreo fixado em 0,85 V relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl. Os padrões

foram preparados em uma concentração final de 4 ng de NE, DA, 5-HT, DOPAC, HVA e 5-

HIAA (Sigma, MO, EUA). A partir da altura ou área dos picos desses padrões, as amostras

foram calculadas no programa Microsolf Excel e os resultados expressos em ng/g de tecido.

4.9 Análise Estatística

As análises foram realizadas por meio da análise de variância (ANOVA), usando o

software Prism 5.0. versão para Windows, GraphPad Software (San Diego, CA, EUA). Para

avaliação da significância, comparações múltiplas foram feitas com ANOVA e por Tukey

como post hoc testes. Os resultados foram considerados significativos para p <0,05 e

apresentados como média ± EPM.

65

5 RESULTADOS

Artigo 1

Composição química, atividades biológicas e farmacológicas de Agave sisalana Perrine e

seus constituíntes

Submetido à: Revista Brasileira de Farmacognosia

66

Composição química, atividades biológicas e farmacológicas de Agave sisalana Perrine e

seus constituíntes

Abreu, R.N.D.C.a,b, Barbosa-Filho, J.Mc, Ximenes, N.C.d, Santos Júnior, M.A.S.d, Sampaio,

L.R.Lb,d, Macêdo, D.S.d, Camila Maria de Araújo Silveirad, Manoel Claudio Azevedo

Patrocínioe, Silvânia Maria Mendes Vasconcelosd

aRENORBIO – Rede Nordeste de Biotecnologia, UECE – Paranjana, 1700 – Campus Itaperi

– 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil; bUniversidade de Fortaleza – Avenida Washington Soares, 1321, Edson Queiroz – 60.811-

905, Fortaleza, CE, Brasil. cUniversidade Federal da Paraíba, Cidade Universitária - 58051-900 João Pessoa, PB, Brasil.

dDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal

do Ceará, Rua Cel. Nunes de Melo, 1127 – 60430-270, Fortaleza, CE, Brasil. e Faculdade Christus, Rua João Adolfo Gurgel, 133 – 60190-060, Fortaleza, CE, Brasil.

RESUMO: Objetivou-se fazer uma revisão sistemática, utilizando bancos de dados,

programas de pesquisa científica e em livros relacionados, acerca da composição química,

atividades biológicas, aspectos farmacológicos de Agave sisalana Perr., ressaltando desde os

aspectos botânicos da planta, prováveis mecanismos de ação e toxicidade. Pesquisas

realizadas com Agave sisalana e seus constituíntes demonstraram algumas atividades

biológicas como: anti-helmíntica, antiinflamatória, antinociceptiva, antioxidante, antifúngica,

antimicrobiana, antitumoral e gastroprotetora. No entanto, ainda considera-se escasso o

conhecimento acerca do potencial terapêutico de alguns dos constituíntes da espécie Agave

sisalana, como a hecogenina.

Palavras-chave: Atividade Farmacológica; Agave sisalana; hecogenina; composição

química.

67

INTRODUÇÃO

A realização de pesquisas com compostos bioativos constituíntes de plantas representa

uma oportunidade para se obter produtos com alto valor agregado. A tarefa dos pesquisadores

sobre produtos naturais é selecionar aqueles compostos com interesse farmacêutico por meio

de fracionamento biomonitorado das “bibliotecas combinatórias de produtos naturais”

produzidos por extração e depois colaborar na otimização e desenvolvimento da estrutura do

composto com ação principal do produto natural (RUFATTO et al., 2012).

Os estudos dos usos tradicionais de plantas e seus produtos vêm aumentando

progressivamente nos últimos anos na região Nordeste do Brasil. Pesquisas têm sido

realizadas na área de neuropsicofarmacologia com compostos extraídos de plantas

(HONÓRIO JUNIOR et al., 2012; LIMA et al., 2012; SOUSA et al., 2012; VASCONCELOS

et al., 2011). Dentre essas, evidenciam-se os estudos sobre a ação de Agave sisalana Perrine e

alguns de seus constituíntes, como as sapogeninas, no Sistema Nervoso Central de

camundongos (SAMPAIO et al., 2012).

Agave sisalana Perrine, popularmente conhecida como sisal, é cultivada por sua fibra,

com valor ornamental e medicinal. A planta ocupa o sexto lugar entre as plantas fibrosas, o

que representa 2% da produção mundial de fibras vegetais (fibras da planta fornecem 65% das

fibras do mundo). No entanto, a indústria de produção da fibra de sisal produz alta quantidade

de resíduos usando atualmente apenas cerca de 2% da planta como fibra. A planta contém

saponinas úteis para a fabricação de sabão e com importância farmacológica

(MUTHANGYA; MSHANDETE; KIVAISI, 2009; DEBNATH et al., 2010). Neste sentido,

tornam-se necessários estudos que abordem a utilização dos constituíntes da planta visando o

seu maior aproveitamento.

A pesquisa tem como objetivo descrever a composição química, atividades biológicas,

aspectos farmacológicos de Agave sisalana Perr., ressaltando desde os aspectos botânicos da

planta, prováveis mecanismos de ação e exemplos experimentais de toxicidade. Trata-se de

uma revisão sistemática, utilizando programas de pesquisa científica e em livros, dissertações

e teses acerca da referida espécie.

68

RESULTADOS

Agave sisalana Perrine

Agave sisalana Perrine pertence à família Agavaceae, e tem, principalmente, uma

distribuição pantropical, especialmente em regiões áridas. Esta família possui distribuição

predominantemente pantropical, especialmente em regiões áridas, incluindo cerca de 25

gêneros e 650 espécies. No Brasil ocorrem quatro gêneros e cerca de 20 espécies. A. sisalana

é uma planta produtora de fibra, cujo cultivo é uma alternativa econômica para as áreas secas

do Nordeste do Brasil (SOUZA; LORENZI, 2005).

O sisal é uma planta originada do México (ANDRADE; ORNELAS; BRANDÃO,

2012). No entanto, na região semiárida do Nordeste Brasileiro está inserida a região sisaleira,

responsável pela quase totalidade da produção de A. sisalana do Brasil, a qual é a maior do

mundo (BRANDÃO et al., 2011).

Aspectos botânicos

A. sisalana é uma planta perene, herbácea, ciclo de vida entre 8 a 10 anos, quase

acaulescente com folhas grandes, que variam de 1,2 a 2,0m de comprimento, dispostas em

espiral, em geral carnosas, duras, de coloração verde-lustrosa, convexas e canaliculadas na

parte superior, apresentando ápice pungente, margem irregularmente acauleada e pendão

floral de aproximadamente 6 a 9 metros de altura por 15 cm de diâmetro (Figura 1). Os

frutos do sisal são cápsulas com cerca de 3,0 cm de comprimento e 2,0 cm de diâmetro, três

lóculos, nos quais as sementes, delgadas, de forma redondo-triangular, de cor preta e leves, se

distribuem em duas colunas (SOUZA, 2009). O plantio é feito utilizando os ramos novos que

nascem na base da planta mãe ou por meio dos bulbilhos, emitidos pela planta quando atinge

o final do ciclo de vida. Após o plantio, o sisal leva aproximadamente três anos para ser

colhido pela primeira vez. Após a primeira colheita, o sisal é colhido anualmente

(ANDRADE; ORNELAS; BRANDÃO, 2012).

69

Figura 1: Agave sisalana Perrine.

Fonte: BELLAKHDAR, 1997.

70

Cultivo e aplicações dos coprodutos

Na região Nordeste do Brasil, a integração lavoura sisaleira-pecuária é uma realidade.

Alguns produtores utilizam a mucilagem, coproduto gerado após a obtenção da fibra das

folhas do sisal, como alimento volumoso para os animais na forma de silagem e feno ou,

ainda, submetem os seus campos de sisal ao pastejo, permitindo que os animais se alimentem

do extrato herbáceo entre as fileiras de sisal e dos bulbilhos - pequenas plantas de 5 a 10 cm,

que caem do escapo floral das plantas de sisal. Outros coprodutos do sisal, como o pó da

batedeira - material oriundo da varredura de galpões de armazenamento e processamento da

fibra -, o pseudocaule - parte interna do bulbo da planta -, além dos bulbilhos, são potenciais

coprodutos utilizados pelos produtores de forma empírica, sem o conhecimento prévio do seu

valor nutricional (BRANDÃO et al., 2011).

Os principais empregos do sisal dizem respeito à fabricação de cordas, barbantes

grossos, tapetes, dentre outros. As folhas de A. sisalana encontram ainda aplicação na

obtenção de pasta celulósica para papel (RIZZINI; MORS, 1976). Com a indústria química

são fornecidos gorduras, cera, glicosídeo, álcool, ácidos adubos, além do emprego, na

alimentação animal, dos resíduos oriundos da extração da fibra (GONDIM; SOUZA, 2009).

Composição química

A composição química de extratos lipofílicos das fibras de Agave sisalana foi

estudada por Gutiérrez et al. (2008). Os compostos predominantes identificados foram:

ácidos graxos (30%), alcoóis graxos (20%), esteróis livres (11%) e alcanos (11%). Além

disso, outros hidrocarbonetos e cetonas esteroides, monoglicerídeos, aldeídos, ceras e

glicosídeos esteróis também foram encontrados, juntamente com pequenas quantidades de

diglicerídeos.

Uma investigação sobre a composição de resíduos líquidos da folha de sisal resultou

no isolamento de D-manitol do extrato etanólico. A presença de D-manitol nos resíduos de A.

sisalana pode agregar valor econômico à cadeia de produção de fibra de sisal no Nordeste do

Brasil. Este composto é amplamente utilizado na indústria farmacêutica para produção de

diurético e regulador osmótico e é também usado como matéria-prima para a produção de

vários tipos de polímeros (BRANCO et al., 2010).

Os extratos aquoso e metanólico da Agave sisalana foram preparados e avaliados para

as suas propriedades fitoquímicas. A análise fitoquímica revelou que a concentração de

saponinas era elevada no extrato aquoso, enquanto a mesma foi moderada no extrato

71

metanólico. Esteróides, taninos e flavonóides estavam presentes em concentrações moderadas

no extrato metanólico. No extrato aquoso foram encontrados apenas flavonóides em

concentração moderada, com esteróides e taninos em baixas concentrações. Glicosídeos

cardíacos estavam em baixa concentração no extrato metanólico e ausente no extrato aquoso

(HAMMUEL et al., 2011).

A purificação do extrato acetato de etila de A. sisalana possibilitou a obtenção de uma

fração contendo como componente majoritário um homoisoflavonóide e outra fração

contendo uma mistura de saponinas (BOTURA et al., 2013). Chen et al. (2009) isolaram três

flavonóides e 7 homoisoflavonóides a partir do extrato metanólico das folhas de A. sisalana

Perr.

A análise química do extrato aquoso de resíduos de sisal demonstrou a presença de

sapogeninas: hecogenina e tigogenina (BOTURA et al., 2011).

Tabela 1: Composição química dos diferentes extratos de A. sisalana

Extratos Composição química Referências

Fração lipofílica obtida do

extrato de acetona

Ácidos graxos

Alcoóis graxos

Alcanos

Monoglicerídeos

Aldeídos

Diglicerídeos

GUTIÉRREZ et al., 2008

Extrato etanólico D-manitol BRANCO et al., 2010

Extrato Metanólico e

extrato aquoso

Saponinas: hecogenina e

tigogenina

Glicosídeos cardíacos

Esteróides

Taninos

Flavonóides

• Homoisoflavonóides

HAMMUEL et al., 2011 CHEN et al., 2009

BOTURA et al., 2011

Acetato de etila Homoisoflavonóides

Alto índice de saponinas BOTURA et al., 2013

Extratos butanólico e

acetato de etila

Maior de índice de compostos

saponínicos

DAMASCENO, BRANCO

e SANTOS, 2012

72

Em outros estudos, a partir do resíduo do sisal, foram obtidos os extratos acetato de

etila, butanólico e aquoso. Ao realizar o teste de espuma foi verificada a presença de

compostos saponínicos. Os extratos butanólico e acetato de etila apresentaram maior índice de

espuma em relação ao aquoso, o que indica maior concentração de compostos saponínicos

nestes (DAMASCENO; BRANCO; SANTOS, 2012).

Saponinas

As saponinas (do latim sapon = sabão) são um grupo de glicoconjugados que se

dissolvem na água e diminuem sua tensão superficial de modo que, ao se agitar suas soluções,

forma-se uma espuma abundante e relativamente estável. A estrutura das saponinas consiste

em uma porção oligossacarídea formada por carboidratos como glicose, galactose, N-

acetilglucosamina, ácido glicurônico, xilose, ramnose ou metilpentose ligada a uma porção

aglicona, insolúvel em água, chamada genericamente de sapogenina e quando esta possui um

esqueleto esteroidal, ela é chamada de sapogenina esteroidal (SILVA, 2008).

No caso da A. sisalana, as sapogeninas (porção não glicosídica de uma saponina)

encontradas são: a tigogenina, a diosgenina e a hecogenina, registrando-se maior percentual

para esta última (PIZARRO et al., 1999). Outra molécula constituinte da A. sisalana, é a

barbougenina (BLUNDEN; PATEL; CRABB, 1986).

Dentre as plantas ricas em saponinas esteroidais, citam-se as plantas da família

Agavaceae, principalmente do gênero Agave, com destaque para A. sisalana. De modo geral,

o isolamento de sapogeninas tem importância significativa, já que muitas delas são utilizadas

como precursores de esteróides. A extração de sapogeninas é realizada através de hidrólises

(ácida, básica ou enzimática), seguida de extração por solvente orgânico (DUNDER, 2009).

A Figura 2 apresenta as estruturas químicas de algumas sapogeninas esteroidais

encontradas em A. sisalana. A estrutura (1) diosgenina é predominantemente encontrada em

plantas do gênero Dioscorea; hecogenina (2) é um contituínte majoritário da A. sisalana;

tigogenina (3) está presente também em espécies A. sisalana; barbourgenina (4) é contituinte

da A. sisalana (BLUNDEN; PATEL; CRABB, 1986; SILVA, 2008; TROUILLAS et al.,

2005; ZULLO et al., 1989).

73

Figura 2: Estruturas das sapogeninas esteroidais encontradas em Agave sisalana Perrine.

Estrutura (1) diosgenina; (2) hecogenina; (3) tigogenina; (4) barbourgenina.

Fonte: BLUNDEN; PATEL; CRABB, 1986; SILVA, 2008; TROUILLAS et al., 2005; ZULLO et al., 1989

1 2

3 4

74

A hecogenina é uma sapogenina esteroidal de peso molecular 430.63 e sua fórmula

estrutural é C27H42O4 e sua nomenclatura na IUPAC é: 3β-hidroxi-5α-spirostan-12-ona.

(Pharmaloialty) (DUNDER, 2009).

Pesquisadores como Zullo et al. (1989) determinaram os teores de sapogeninas

esteroídicas, hecogenina e tigogenina, em folhas secas de sisal (Agave sisalana) e dos híbridos

de A. amaniensis x A. Angustifolia, obtidos no Instituto Agronômico. Esses híbridos

mostraram maiores teores de sapogeninas (220-480mg/100g) do que o sisal (140 ±

28mg/100g), assim como maiores teores de tigogenina (148-217mg/100g). Apenas o híbrido

003B apresentou teor de hecogenina (99 ± 16mg/100g) significativamente maior que o

encontrado no sisal comum (26 ± 3mg/100g).

Atividades biológicas de Agave sisalana Perr. e seus constituíntes

A. sisalana apresenta atividades biológicas, como antiinflamatória, antinociceptivo

(DUNDER et al., 2010; GAMA et al., 2013), gastroprotetora (CERQUEIRA et al., 2012),

antitumoral (CORBIERE et al., 2003), antimicrobiana (SANTOS et al., 2009), antifúngica

(PIRES; PURCHIO, 1991), anti-helmíntica (DOMINGUES et al., 2010), inseticida

(PIZARRO et al., 1999; SOUZA, 2009), entre outras. Ver Tabela 2.

75

Tabela 2: Estudos sobre as atividades biológicas de A. sisalana

Extratos ou moléculas isoladas

de A. sisalana Atividades biológicas Referências

Diosgenina Apoptose induzida em células HepG2 através da família de proteínas Bcl-2.

CORBIERE et al., 2003

Diosgenina Controle e quimioproteção do câncer RAJU et al., 2008

Extrato acetato de etila

Potencial antifúngico e antioxidante DAMASCENO, BRANCO e

SANTOS, 2012

Sulco filtrado Inibição do crescimento de Aspergillus

flavos e Aspergillus parasiticus. PIRES e PURCHIO,

1991

Extrato hidroalcoólico Inibição significativa de Candida

albicans SANTOS et al., 2009

Hecogenina Efeitos gastroprotetores; propriedades antioxidantes; ação anti-inflamatória.

CERQUEIRA et al., 2012

Hecogenina Ação Neuroprotetora sobre os

parâmetros da peroxidação lipídica SAMPAIO et al.,

2012

Hecogenina

Diminuição da atividade enzimática de fosfolipase A2 secretória (sPLA2) de Crotalus durissus terrificus (Atividade

anti-inflamatória)

COTRIM, 2011.

Acetato de Hecogenina

Efeito Antinociceptivo GAMA et al., 2012

Extrato hidrolisado Anti-inflamatório e atividade

antinociceptiva DUNDER et al., 2010

Extrato das folhas Potencial antiparasitário in vivo em ovos, larvas e nematódeos adultos no trato

gastrointestinal.

SILVEIRA et al, 2012

Extrato aquoso Efeito moderado contra ovos e estágios

de vida livre de parasitas. BOTURA et al., 2011

Frações de flavonoides (FF) obtidas do extrato acetato de etila

Atividade in vitro contra nematódeos gastrointestinal em bodes.

BOTURA et al., 2013

Resíduo líquido Atividade antihelmíntica contra

nematódeos gastrointestinais do gênero Haemonchus spp.

DOMINGUES et al., 2010.

Resíduo líquido Atividade larvicida contra Culex

Quinquefasciatus. PIZARRO et al, 1999

Extratos hidroetanólico e

butanólico

Atividade inseticida contra Spodoptera frugiperda em milho.

SOUZA, 2009

76

Extrato metanólico e aquoso

Atividades antimicrobianas HAMMUEL et al,

2011

Atividade antiinflamatória

A resposta inflamatória está associada com uma gama de doenças, e é difícil de

estabelecer uma terapia eficaz para controlar os processos inflamatórios. Assim, existe uma

necessidade clara e evidente em pesquisar novos compostos para medicamentos,

especialmente aqueles derivados de plantas. Estudos com extratos, óleos e compostos de

várias espécies têm demonstrado atividades importantes (RUFATTO et al., 2012).

O conjunto de dados apresentados por Dunder et al. (2010) demonstra que o extrato

hidrolisado de Agave sisalana Perrine ex Engelm, Asparagaceae (EHAS) apresenta ações

significativas nos modelos clássicos de inflamação aguda em camundongos Swiss: O

tratamento com EHAS (500 mg/kg) reduziu significativamente o edema de orelha induzido

por xilol em duas vias (oral e intraperitoneal) em comparação com os controles salina e ácido

acetilsalicílico (AAS). O EHAS também diminuiu o edema induzido por carragenina nas duas

vias, quando comparado com os grupos controle salina e indometacina.

Neste mesmo estudo (DUNDER et al., 2010), no modelo crônico de inflamação

granuloma cotton pellet em ratos Wistars, EHAS (ip) bem como a dexametasona diminuiu o

tecido granulomatoso comparado com ao grupo controle com salina, isto sugere que o

potencial anti-inflamatório de sapogeninas pode está relacionada com a estrutura da molécula,

que é semelhante à estrutura de glicocorticóides (Figura 3).

77

Figura 3: Principais substâncias produzidas a partir da hecogenina.

Fonte: Silva, 2008

78

Os efeitos da hecogenina, isolada a partir de A. sisalana, na liberação de

mieloperoxidase (MPO) a partir de neutrófilos humanos foram avaliadas in vitro. O MPO (um

biomarcador para a inflamação) demonstrou que a inflamação foi significativamente

diminuída na presença de hecogenina (CERQUEIRA et al., 2012).

Outra pesquisa, realizada com o objetivo de avaliar o efeito da hecogenina sobre as

atividades catalítica e farmacológicas de uma isoforma de fosfolipase A2 secretória (sPLA2)

de Crotalus durissus terrificus em duas situações: pré-incubado e co-incubado, demonstrou

que a hecogenina, dependendo da dose, pode inibir ou estimular a atividade enzimática da

sPLA2. Nesta pesquisa, a hecogenina não apresentou potencial para bom antiinflamatório, já

que dependendo da dose, o composto inibiu ou potencializou a atividade catalítica (COTRIM,

2011).

Chen et al. (2009) isolaram três flavonóides e sete homoisoflavonóides de folhas de

sisal e descobriu-se que três homoisoflavonóides interferiram com a resposta celular imune e

inibiu a produção de interleucina-2 (IL-2) e interferon-γ pelas células mononucleares do

sangue periférico humano que tinham sido ativadas por fito-hemaglutinina. Os resultados

surgeriram que os homoisoflavonóides tiveram efeitos imunossupressores.

Efeito Antinociceptivo

Os efeitos do extrato hidrolisado de Agave sisalana (EHAS) sobre as contorções

abdominais induzidas por ácido acético em camundongos foram descritos por Dunder et al,

(2010). O ácido acético atua indiretamente pela liberação de mediadores endógenos como

prostaglandinas que estimulam os neurônios nociceptivos sensíveis a anti-inflamatórios não

esteroidais e drogas com efeito central. O efeito antinociceptivo de EHAS (500 mg/kg) sobre

as contorções abdominais mostrou inibição da estimulação dolorosa por 30,7% (vo) e 88,7%

(ip), comparado com aquele produzido pelo (AAS) 70.6%. Na pesquisa, os resultados

sugerem que esta atividade antinociceptiva está relacionada ao potencial anti-inflamatório de

sapogeninas esteroidais.

Outros autores (GAMA et al., 2013) investigaram as propriedades antinociceptivas do

acetato de hecogenina, isolada de A. sisalana, e seu mecanismo de ação. O efeito

antinociceptivo de hecogenina foi demonstrado no teste de retirada da cauda, o que indica um

efeito antinociceptivo central para esta molécula. Foram avaliados os efeitos do bloqueio

farmacológico dos receptores opióides sobre a atividade antinociceptiva do acetato de

hecogenina. A antinocicepção máxima produzida por acetato de hecogenina (40 mg/kg) foi

completamente evitada em camundongos pré-tratados com naloxona (5 mg/kg, ip, 15 minutos

antes), um antagonista não seletivo do receptor opióide, sugerindo uma atividade opióide

79

semelhante para esta sapogenina. De igual modo, a administração da µ-antagonista de

receptores opióides CTOP (1 mg/kg ip) 30 min após a administração do acetato de

hecogenina bloqueou o efeito antinociceptivo observado. O pré-tratamento com o antagonista

do receptor κ-opioide, nor-BNI (0,5 mg/kg sc, 15 minutos antes), ou o antagonista do receptor

opióide-δ, Naltrindole (3 mg/kg sc; 5 min antes), também preveniu a antinocicepção induzida

por hecogenina. Estes resultados sugerem que os receptores opióides desempenham um papel

importante no efeito antinociceptivo do acetato de hecogenina (GAMA et al., 2013).

Foram avaliados os efeitos do bloqueio farmacológico de canais de K+-ATP na

atividade antinociceptiva de acetato de hecogenina. O efeito antinociceptivo da hecogenina

(40 mg/kg) foi completamente evitado em camundongos pré-tratados com glibenclamida (2

mg/kg ip, 30 minutos antes). A função de acetato de hecogenina nos canais K +- ATP reforça

a hipótese do envolvimento do sistema opióide nos seus mecanismos de antinocicepção

(GAMA et al., 2013).

Atividade gastroprotetora

Resultados de pesquisa (CERQUEIRA et al., 2012) indicam que, hecogenina, possui

efeitos gastroprotetores significativos, em ambos os modelos de etanol e úlcera induzida por

indometacina. Estes efeitos gastroprotetores foram confirmados por testes histológicos e

COX-2 pela técnica de imuno-histoquímica. Além disso, o fármaco apresenta propriedades

antioxidantes, como foi observado com o aumento no conteúdo de GSH e o bloqueio da

lipoperoxidação e da produção de radicais livres. O estudo de Cerqueira et al (2012) também

postulou que hecogenina participa no mecanismo da integridade da mucosa gástrica por meio

da ativação de canais K+ATP pois seus efeitos foram revertidos pelo pré-tratamento com a

glibenclamida, um potente antagonista desses canais.

Atividades no Sistema Nervoso central

A elevada concentração de lípidos insaturados no cérebro e o metabolismo deste órgão

ser basicamente aeróbico fazem deste tecido muito susceptível ao dano peroxidativo

(ZERVOS et al., 2011). Sampaio et al. (2012) demonstrou ação neuroprotetora relacionada à

diminuição da peroxidação lípídica em áreas cerebrais de camundongos após administração

intraperitonial da hecogenina (5 ou 10 mg/kg) isolada de A. sisalana.

Nos testes de indução de convulsão com pentilenotetrazol (PTZ), hecogenina, nas

doses estudadas (5 ou 10 mg/kg – ip), não apresentou ação anticonvulsivante (ALMEIDA et

al., 2012). As mesmas doses foram estudadas para avaliação do efeito sedativo da hecogenina,

80

quando foi demonstrado que a molécula não potencializou a ação do pentobarbital na latência

do sono em camundongos (SANTOS JÚNIOR et al., 2012).

Para avaliar possíveis efeitos miorrelaxante ou sedativo inespecíficos de acetato de

hecogenina, os ratos foram submetidos ao teste Rota rod. No estudo, efeitos de relaxamento

ou déficit motor foram descartados, uma vez que a administração de acetato de hecogenina

em doses antinociceptivas (40 mg/kg) não afetou o desempenho motor de ratos no teste

(GAMA et al., 2013).

Antitumoral

Corbiere et al. (2003) descobriu que a diosgenina, hecogenina e tigogenina, têm um

efeito anti-proliferativo em células de osteossarcoma humano 1547. No entanto, apenas

diosgenina causou um forte bloqueio do ciclo celular associado a apoptose. Este efeito

biológico parece correlacionado com um grande aumento da expressão da proteína p53. Raju

et al. (2009) destaca a atividade biológica de diosgenina que contribui para a

quimioprevenção e controle do câncer. O modo de ação antineoplásica de diosgenina tem sido

demonstrado através da modulação de múltiplos eventos de sinalização celular que envolve

candidatos moleculares críticos associados com o crescimento, diferenciação, apoptose, e

oncogênese. Os resultados pré-clínicos implicam o uso de diosgenina como agente

quimiopreventivo e terapêutico à base de múltiplos alvos contra vários tipos de câncer.

Ainda sobre os efeitos farmacológicos da hecogenina, embora de forma menos

acentuada que a diosgenina, essa sapogenina esteroidal também apresenta propriedades

antiproliferativas e pró-apoptóticas em determinados tipos de linhagens de células cancerosas

(CORBIERE et al., 2003; TROUILLAS et al., 2005).

Propriedades antimicrobiana e antiparasitária

As propriedades antimicrobiana e antiparasitária de compostos presentes em plantas

como produtos do metabolismo secundário têm sido conhecidos empiricamente durante

séculos, mas só recentemente eles têm sido cientificamente confirmados. Extratos e óleos

essenciais de plantas provaram a sua eficácia no controle do crescimento de uma ampla

variedade de microrganismos, incluindo bactérias, fungos, parasitas e outros (RUFATTO et

al., 2012).

Em uma pesquisa, o suco de A. sisalana nas concentrações testadas in vitro foi efetivo

contra nematódeos gastrintestinais de caprinos. No entanto, foi detectada reduzida eficácia

anti-helmíntica quando administrado esse resíduo por via oral em animais (DOMINGUES et

al., 2010).

81

Recentemente, foi avaliada a atividade anti-helmíntica in vivo de um extrato aquoso do

resíduo de sisal (Agave sisalana) contra nematódeos gastrintestinais em caprinos. O extrato

aquoso de resíduos de sisal demonstrou uma baixa eficácia contra parasitas em estágios

parasitários. No entanto, o extrato foi moderadamente eficaz contra ovos e estágios de vida

livre do parasita e não causou qualquer toxicidade nos caprinos (BOTURA et al., 2011).

Os resultados obtidos nos testes in vitro com nematoides gastrintestinais permitem

inferir que os extratos, aquoso, acetato de etila e a fração flavonoíde obtidos do resíduo de A.

sisalana têm elevado efeito ovicida, sendo que a substância responsável por esta atividade

possivelmente é um homoisoflavonóide. No entanto, no ensaio com larvas infectantes, a

fração saponínica mostrou maior atividade sobre a migração larvar. Dessa forma, a atividade

anti-helmíntica de A. sisalana possivelmente está relacionada aos compostos

homoisoflavonóides e saponinas, que apresentaram ação diferenciada sobre estádios

específicos dos nematóides (BOTURA et al., 2013).

A literatura atesta ainda a atividade antifúngica da espécie. Portanto, o suco filtrado da

folha de Agave sisalana apresenta substância inibitória do crescimento de fungos, como

Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus (PIRES; PURCHIO, 1991). Outra pesquisa

contribuiu para identificação das atividades biológicas de Agave sisalana e apresentou

resultados positivos para a atividade antioxidante, e de inibição de Candida albicans com o

extrato de acetato de etila, sendo o extrato butanólico mais ativo do que os demais na

avaliação antimicrobiana (DAMASCENO; BRANCO; SANTOS, 2012).

Em outro estudo, o extrato hidroalcoólico obtido a partir de folhas e a partir de

resíduos de sisal mostrou uma inibição significativa de Candida albicans, por outro lado, era

inativo contra três cepas de Staphylococcus aureus, duas cepas de Escherichia coli, uma cepa

de Micrococcus luteus, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella choleraesuis.

O extrato metanólico mostrou alguma ação contra C. albicans, quando comparados com os

extratos acima (SANTOS et al., 2009). Foi descrito outro efeito de Agave como antisséptico e

a inibição do crescimento de bactérias no estômago e no intestino (DEBNATH et al., 2010).

A atividade antimicrobiana in vitro do extrato metanólico e extrato aquoso da Agave

sisalana foram investigados. Tanto os extratos metanólico e aquoso apresentaram vários graus

de atividade antimicrobiana contra os microrganismos testados. O extrato metanólico (zona de

inibição de 28-32 mm), foi encontrado para ser mais eficaz do que o extrato aquoso (zona de

inibição de 25-29 mm) contra todos os microorganismos de ensaio. No extrato metanólico, a

Escherichia coli foi mais susceptível do que o de qualquer outro microorganismo selecionado

com a zona de inibição de 32 mm e Salmonella typhi mostrou o mínimo de susceptibilidade.

Também para o extrato aquoso, Staphylococcus aureus foi altamente suscetíveis ao extrato

82

(29 mm) e Streptococcus pyogenes apresentaram a menor suscetibilidade (25 mm)

(HAMMUEL et al., 2011).

Larvicida e inseticida

O aproveitamento do resíduo do desfibramento das folhas de Agave sisalana, como

um larvicida para o combate a mosquitos (Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus)

transmissores de doenças tropicais, foi descrito por Pizarro et al (1999). No estudo, a espécie

A. sisalana apresentou atividade larvicida para C. quinquefasciatus, sugerindo uma alternativa

de uso de um produto natural, com matéria prima abundante e de baixo custo na produção de

larvicida.

Outros bioensaios demonstraram a atividade inseticida dos extratos obtidos a partir do

resíduo líquido de A. sisalana para S. frugiperda, causando mortalidade pelo teste de ingestão

e pelo teste de aplicação tópica, sendo também observados sintomas de neurotoxicidade,

como agitação após a ingestão de folhas de milho tratadas (SOUZA, 2009).

Toxicidade: Dados experimentais

O mecanismo de ação de saponinas sobre células provavelmente está relacionado com

sua característica anfipática e capacidade de formar complexos com esteroides, proteínas,

fosfolipídeos de membranas, o que pode levar a uma desorganização das membranas celulares

(BOTURA et al., 2011). A atividade hemolítica de 63 saponinas esteroidais foi determinada

no estudo de Wang et al (2007), quando demonstrou que a atividade hemolítica dessas

saponinas é dependente de suas estruturas químicas, como o número de cadeias de açúcar e

seu sítio de ligação, assim como o tipo de aglicona.

O estudo de Botura (2009) teve como um dos objetivos investigar a citotoxicidade

sobre cultivos de células Vero (linhagem celular de rim de macaco verde africano). Assim, os

tratamentos de cultivos de células Vero com o extrato aquoso (EA), extrato acetato de etila

(EE) e Fração Saponínica (FS) de A. sisalana promoveram efeitos citotóxicos. Em ambos os

testes utilizados (MTT e exclusão ao corante azul de tripan), a FS mostrou maior

citotoxicidade ao promover completa inviabilidade celular em concentração 40 e 8 vezes

menor que a dos EA e EE respectivamente, o que sugere ser esta fração possivelmente

responsável pela atividade citotóxica de A. sisalana.

Domingues et al. (2010) avaliaram os possíveis efeitos tóxicos do resíduo líquido de

Agave sisalana (sisal) em caprinos. Portanto, o tratamento oral de caprinos com o resíduo

líquido de sisal (0,9 g/kg), durante quatro ou oito dias, demonstrou um declínio, dentro da

faixa fisiológica normal, de cada parâmetro hematológico, a saber: eritrócitos, proteína total,

83

leucócitos, neutrófilos, linfócitos, monócitos e eosinófilos; com exceção do hematócrito, que

foi abaixo da faixa de normalidade, no oitavo dia em grupo tratado com o suco de A. sisalana

(0,9 g/kg por 4 dias) e no grupo que recebeu o mesmo tratamento por oito dias (0,9 g/kg por 8

dias). No dia 15, houve queda também desse parâmetro no grupo tratado com o suco de A.

sisalana (0,9 g/kg por 4 dias) e no grupo controle, ou seja, que não recebeu tratamento. O

mesmo estudo demonstrou que, no soro, Gama-glutamil transferase (GGT); transaminase

ALT; fosfatase alcalina (ALP); uréia e creatinina mantiveram-se dentro da normalidade

durante todo o experimento.

No estudo de Dunder (2009) a hidrólise ácida inibiu a ação hemolítica das saponinas

pela retirada das cadeias laterais de açúcar. No estudo do mesmo autor, para a avaliação da

toxicidade da fração hexânica de Agave sisalana (FHAS) foram dosadas, no plasma, albumina

e proteínas totais. Nesse experimento, ratos Wistar foram tratados durante uma semana com

FHAS (nas doses de 10 e 25 mg/kg), com polietilenoglicol -200 e Dexametasona na dose de

0,5 mg/kg. Todos os animais foram sacrificados no 8º dia. Os resultados demonstraram que a

FHAS não apresentou aumento significativo de proteínas plasmáticas. Na avaliação do peso

dos animais, nenhuma das doses da fração hexânica de Agave sisalana apresentou efeito

significativo sobre a evolução ponderal, como foi o caso do controle positivo

Glicocorticóides, indicando ausência de efeitos colaterais, semelhantes aos Glicocorticóides.

Em estudos toxicológicos pré-clínicos com a hecogenina (CERQUEIRA et al., 2009;

CERQUEIRA, 2012), a administração desta molécula (ip ou vo) em camundongos, nas doses

de 15, 30, 60, 90, 300 e 2000 mg/Kg, não foi capaz de produzir alterações comportamentais

ou alterações nos padrões fisiológicos de evacuação e micção, apenas induzido uma única

morte. Nos camundongos tratados com hecogenina (vo) na dose de 300mg/Kg, durante os 14

dias, não foram observadas alterações na evolução ponderal estatisticamente significativa em

relação ao grupo controle. Dos parâmetros bioquímicos analisados quatorze dias após

administração da dose de 300mg/Kg (vo) da hecogenina, foi detectado um aumento nos níveis

plasmáticos de aspartato aminotransferase. No entanto, hecogenina não causou alterações nos

demais parâmetros a saber: glicose; colesterol total; triglicerídeos; uréia, creatinina; ácido

úrico; AST; Gama GT; fosfatase alcalina; LDH; proteínas totais; Albumina e Globulina.

Entre os parâmetros hematológicos analisados quatorze dias após administração da

dose de 300mg/Kg (vo) da hecogenina, foi observado um aumento estatisticamente

significantivo dos monócitos no sangue dos camundongos. No entanto, hecogenina não

alterou os outros parâmetros: hemácias; hemoglobina; hematócrito; volume corpuscular média

(MCV); hemoglobina corpuscular média (MCH); Média, corpuscular da concentração de

84

hemoglobina (MCHECO); plaquetas; leucócitos; neutrófilos; eosinófilos; basófilos e

linfócitos (CERQUEIRA, 2012).

Em seres humanos, a sensibilização alérgica entre trabalhadores expostos ao sisal foi

documentada por Kayumba et al. (2008), quando identificaram que todos os trabalhadores

expostos tiveram níveis elevados de IgE (>100 kU/l). No entanto, sua implicação clínica não é

óbvia. A alta prevalência de sintomas respiratórios foi encontrada em ambos os grupos de

trabalhadores (sensibilizados e não sensibilizados).

Diante das pesquisas realizadas com Agave sisalana, concluiu-se que os constituíntes

da espécie apresentam atividades biológicas como: anti-helmíntica, antiinflamatória,

antioxidante, antifúngica, antitumoral, antibacteriana, gastroprotetora, dentre outras. Ausência

de efeitos anticonvulsivantes e sedativos foi também demonstrado. No entanto, ainda

considera-se escasso o conhecimento acerca do potencial terapêutico de hecogenina, um dos

constituíntes de plantas da espécie Agave sisalana. Novas informações são necessárias, no

sentido de aumentar o conhecimento dos seus efeitos no organismo de humanos e animais e

desvendar seu exato mecanismo de ação, visando descobrir novos agentes, de modo a ampliar

agregação de valor à produção de sisal.

85

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Artigo 2

Efeitos da administração aguda ou em doses repetidas da hecogenina isolada de Agave

sisalana Perrine sobre o comportamento de camundongos

89

Efeitos da administração aguda ou em doses repetidas da hecogenina isolada de Agave

sisalana Perrine sobre o comportamento de camundongos

Rita Neuma D. C. de Abreua,b, José M. Barbosa Filhoc, Aline Miranda Sousab, Fernanda M. T.

Camposd, Lara Martins Diasb, Augusto Lopes Soutoc, Glauce Socorro de B. Vianad, Manuel

A. dos Santos Júniord, Francisca Cléa Florenço de Sousad, Silvânia M. M. Vasconcelosd





do Ceará, Rua Cel. Nunes de Melo, 1127 – 60430-270, Fortaleza, CE, Brasil.

RESUMO: Objetivou-se estudar os efeitos comportamentais da hecogenina (HEC). Foram

utilizados camundongos Swiss, machos, pesando de 25-35 g. Os efeitos comportamentais da

administração aguda da HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, via intraperitoneal - ip) ou em doses

repetidas por sete dias (20 ou 40 mg/kg, ip) foram avaliados pelos testes: campo aberto,

labirinto em cruz elevado (LCE), placa perfurada e suspensão de cauda. Determinou-se o

mecanismo de ação da HEC com administração aguda de Flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg ou

Reserpina (RES) 2 mg/kg. HEC não causou alteração na atividade locomotora dos animais no

campo aberto. O teste de LCE mostrou que a HEC, administrada agudamente, nas doses de

10, 20 ou 40 mg/kg, causou aumento no número de entradas nos braços abertos (NEBA)

comparado ao controle. Efeito semelhante foi observado no tempo de permanência nos braços

abertos nas duas maiores doses. A administração em doses repetidas da HEC (20 ou 40

mg/kg) também aumentou o NEBA. HEC (20 ou 40 mg/kg), administrada agudamente,

aumentou o número de head dips. Efeito semelhante foi observado após o tratamento em

doses repetidas na dose de 40 mg/kg em relação ao grupo controle. O FLU não reverteu os

efeitos ansiolíticos agudos da HEC no LCE e no teste de placa perfurada. Hecogenina reduziu

o tempo de imobilidade no teste de suspensão de cauda. HEC reverteu o efeito depressor da

RES. Concluiu-se que HEC apresentou efeitos ansiolíticos e antidepressivos nos testes

comportamentais.

Palavras-chave: Ansiedade; comportamento; sistema nervoso central; hecogenina.

90

INTRODUÇÃO

As moléculas de origem vegetal são utilizadas como fonte natural para obtenção de

moléculas protótipo, pois estas apresentam uma variedade de constituíntes químicos em suas

atividades biológicas, podendo ser usados como ferramentas farmacológicas.

Agave sisalana Perrine pertence à família Agavaceae, e tem, principalmente, uma

distribuição pantropical, especialmente em regiões áridas. No Brasil ocorrem quatro gêneros e

cerca de 20 espécies. A. sisalana é uma planta produtora de fibra, cujo cultivo é uma

alternativa econômica para as áreas secas do Nordeste do Brasil (SOUZA; LORENZI, 2005).

A planta ocupa o sexto lugar entre as plantas fibrosas, o que representa 2% da

produção mundial de fibras vegetais (fibras da planta fornecem 65% das fibras do mundo). No

entanto, a indústria de produção da fibra de sisal produz alta quantidade de resíduos usando

atualmente apenas cerca de 2% da planta como fibra (MUTHANGYA; MSHANDETE;

KIVAISI, 2009).

A análise química do extrato aquoso de resíduos de sisal demonstrou a presença de

sapogeninas: hecogenina e tigogenina (BOTURA et al., 2011). Embora a hecogenina tenha

apresentado várias ações biológicas como antiinflamatória, analgésica e gastroprotetora

(CERQUEIRA et al., 2009; DUNDER et al., 2010; GAMA et al., 2013), pouco se sabe sobre

sua ação no Sistema Nervoso Central (SNC).

Uma ação central significativa pode ser bastante interessante ou pode comprometer a

utilização de determinadas moléculas que apresentam atividades farmacológicas em outros

sistemas, como é o caso da planta em estudo. Um estudo prévio em nosso laboratório

demonstrou ação neuroprotetora relacionada a diminuição da peroxidação lípídica em áreas

cerebrais de camundongos, após administração aguda intraperitonial da HEC (5 ou 10 mg/kg)

(SAMPAIO et al., 2012).

Com base nessas considerações, foi realizado um screening dos efeitos da HEC

isolada da Agave sisalana Perrine no SNC, utilizando-se diversos modelos animais de

comportamento.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos comportamentais da administração

aguda e em doses repetidas da hecogenina, isolada de Agave sisalana Perrine, em

camundongos por meio dos modelos de ansiedade, depressão e atividade motora.

91

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal





As amostras das folhas secas de A. sisalana (5 kg) foram extraídas com seis litros de

álcool etílico (etanol) 95% em um aparelho de Soxhlet por 24 horas. O solvente foi

removido sob pressão reduzida e o resíduo foi hidrolisado sob refluxo por quatro horas com

1,5 litros de ácido hidroclórico etanólico 2N. A mistura reacional foi coletada e filtrada. A

fração ácida insolúvel foi lavada com água, solução de carbonato de sódio e água, até

neutralizar. Depois de seco, o resíduo ácido insolúvel foi extraído com hexano em um

aparelho Soxleht por 12 horas. O extrato hexânico foi levado à um refrigerador por 24 horas.

Após este período, um precipitado foi formado. O precipitado foi filtrado e depois

recristalizado em acetona, formando 1g de hecogenina (0,02%), m.p. 256-258°C (lit.1 258 –

260°C). A hecogenina encontrada é idêntica a uma amostra autêntica (co-TLC e mixed

m.p.). 1H- e 13C-NMR (500 e 125 MHz) o espectro da hecogenina está de acordo com a

literatura previamente citada (AGRAWAL et al., 1985; JAFFER et al., 1983). O acetato de

hecogenina foi obtido por reação de acetilação da hecogenina com uma mistura de anidrido

acético/piridina (KIM et al., 2001). O sobrenadante foi concentrado e o resíduo foi

submetido à cromatografia em coluna e cromatografia líquida em camada delgada com fase

fixa sílica gel produzindo mais hecogenina (0.35 g, 0.007 %), 200 – 202 o C (lit.5 200 –

202 o C). A estrutura da hecogenina usada neste estudo é mostra na Fig. 1.

92

Animais


Biotério da Universidade Federal do Ceará (UFC). O projeto foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Nº protocolo 44/2010).

Reagentes e drogas

Tween 80 4 % foi obtido de Vetec Química Farm. Ltda (Rio de Janeiro, Brasil).

Enquanto Diazepam e Flumazenil foram de Cristália Prod. Química Farm. Ltda (São Paulo,

Brasil). Imipramina de Novartis Biociências S.A. (São Paulo, Brasil). Reserpina foi adquirida

de Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO, USA).

Tratamento agudo

Teste de campo aberto

Foram usados os grupos: controle (Tween 80 4 %); HEC 5, 10, 20 ou 40 mg/kg;

diazepam (DZP) 2 mg/kg. Todos os grupos foram tratados por via intraperitonial (ip) e 30

minutos depois os animais foram submetidos ao teste.

Labirinto em Cruz Elevado

Os grupos usados no teste de labirinto foram divididos da seguinte forma: controle

(Tween 80 4 %), HEC 5, 10, 20 ou 40 mg/kg; DZP 1 mg/kg; flumazenil (FLU) 2,5 mg/kg;

DZP 1 mg/kg + FLU 2,5 mg/kg; FLU 2,5 mg/kg + HEC 20 ou 40 mg/kg.

Os animais tratados com FLU 2,5 mg/kg associado a HEC na dose de 20 ou 40 mg/kg

foram submetidos ao seguinte protocolo: administrou-se FLU-2,5 e 15 minutos depois foi

injetado HEC e, então, após 30 minutos foram submetidos ao experimento.

Teste de Placa Perfurada

Os camundongos foram tratados da seguinte forma: controle (Tween 80 4 %); HEC 20

ou 40 mg/kg; DZP 1 mg/kg; FLU 2,5 mg/kg; DZP 1mg/kg + FLU 2.5 mg/kg; FLU 2.5 mg/kg

+ HEC 20 ou 40 mg/kg.

Teste de suspensão de cauda

Os animais foram divididos em sete grupos: controle (Tween 80 4 %), HEC 5, 10, 20

ou 40 mg/kg; Imipramina (IMI) 10 mg/kg e Reserpina (RES) 2 mg/kg.

Com o intuito de avaliar o mecanismo de ação do efeito antidepressivo da HEC 5, 10,

20 ou 40 mg/kg, RES 2 mg/kg foi administrada 10 minutos antes da HEC e o teste foi

realizado 30 minutos depois (ARAGÃO et al., 2006).

93

Administração em doses repetidas

Os animais foram assim agrupados: Controle – Tween 80 4 %; DZP 1 mg/kg; HEC 20

mg/kg; HEC 40 mg/kg; IMI 10 mg/kg. Nesta fase, cada grupo de animais foi tratado

diariamente com o composto durante um período de 7 dias. Todas as administrações foram

realizadas por via ip. Os experimentos para avaliação dos efeitos comportamentais da

administração em doses repetidas da HEC, DZP ou IMI no SNC de camundongos por meio

dos modelos de ansiedade, depressão e atividade motora foram realizados no sétimo dia de

tratamento após 30 minutos da administração dos compostos citados.

Testes Comportamentais

Teste do campo aberto: Avaliação da atividade exploratória

O campo aberto para camundongos é feito de acrílico (paredes transparentes e piso

preto, 30 x 30 x 15 cm) dividido em 9 quadrantes iguais. A metodologia de Archer (1973) foi

utilizada para avaliar a atividade exploratória do animal. Os principais parâmetros para

observação durante o teste: número de cruzamentos com as quatros patas (Atividade

Locomotora Espontânea - ALE), número de grooming e rearing, registrados durante um

tempo de 5 minutos.

Teste do Labirinto em cruz elevado: Avaliação da atividade ansiolítica

O labirinto em cruz elevado (LCE) (LISTER, 1990) consiste de dois braços abertos

opostos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x 25 cm), também opostos, em forma de

cruz. Os braços abertos e fechados estão conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). O

aparelho está elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão. Trinta minutos após a

administração da HEC ou o veículo, os camundongos foram colocados no centro do aparelho

com a cabeça voltada para um dos braços fechados e o seu comportamento observado por 5

min. As medidas comportamentais registradas no LCE compreeenderam: frequência de

entradas e o tempo despendido nos braços abertos e nos fechados (PELOW et al. 1985).

Placa Perfurada: Avaliação da atividade ansiolítica

A placa perfurada consiste numa caixa quadrada de acrílico (50 x 50 cm) a 10 cm de

altura, com 16 orifícios e 2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas.

Registrou-se o número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa

(CLARK et al. 1971) por um período de 5 minutos.


Utilizou-se o método descrito por Porsolt et al. (1978). Os camundongos foram

suspensos pela cauda na borda de uma plataforma 58 cm acima de uma mesa com fita adesiva

94

colocados cerca de 1 cm da ponta da cauda. A duração da imobilidade foi registrada durante

um período de cinco minutos.

Análise estatística






95

RESULTADOS

Campo aberto

No teste de campo aberto (Tabela 1), foram avaliados a movimentação espontânea

dos animais (atividade locomotora), o número de rearings e o número de grooming. A

administração aguda ou em doses repetidas da HEC não causou nenhuma mudança

significativa na atividade locomotora espontânea (ALE) dos animais em relação ao grupos

controles. O diazepam (DZP), usado como controle positivo, causou uma redução desse

comportamento, quando comparado ao controle.

Com relação ao número de rearing, não houve diferença entre os grupos tratados

agudamente com HEC, nas quatro doses estudadas, e o grupo controle. No entanto, HEC 20

ou 40 mg/kg diminuiu o número de rearing após a administração em doses repetidas em

relação ao grupo controle. Uma diminuição desse parâmetro também foi observado após o

tratamento agudo ou em doses repetidas com o DZP.

Quanto número de grooming, apenas os animais tratados agudamente com HEC na

dose de 10 mg/kg apresentaram aumento desse comportamento em relação ao controle. A

molécula em estudo, administrada em doses repetidas, não causou mudanças significativas no

número de grooming. O DZP não alterou este parâmetro em ambos os tratamentos.

96

Tabela 1 Efeitos da administração (ip) aguda ou em doses repetidas de HEC ou DZP

no teste de campo aberto em camundongos

Grupo (mg/kg) Atividade

Locomotora Rearing Grooming

Agudo

Controle 56,11±7,25 26,22±5,47 2,55±0,66

HEC 5 52,70±5,61 28,11±4,20 3,00±0,39

HEC 10 58,70±5,20 15,00±1,49 6,37±1,16a

HEC 20 44,67±4,12 16,33±2,44 1,27±0,30

HEC 40 51,90±3,10 22,20±1,64 2,30±0,47

DZP-2 24,20±1,71a 4,10±0,76a 1,00±0,36

Doses Repetidas

Controle 35,60±3,15 22,00±1,57 2,20±0,48

HEC 20 47,60±4,56 7,40±0,76a 2,20±0,35

HEC 40 44,60±2,29 8,22±1,25a 2,77±0,36

DZP-1 20,73±2,90a 1,08±0,45a 1,77±0,27

Valores representam média±EPM do número de cruzamentos, rearing, grooming. n = 8-12 animais/grupo. acomparado com controle. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

97

Labirinto em Cruz Elevado

No teste de labirinto em cruz elevado (Figura 2A), a administração aguda da HEC,

nas doses de 10, 20 ou 40 mg/kg, causou aumento significativo no número de entradas nos

braços abertos (NEBA) - HEC 10 mg/kg: (5,62±0,96), HEC 20 (5,72±0,84), HEC 40

(5,80±0,61) – comparado ao controle (1,88±0,20). Efeito semelhante foi observado no tempo

de permanência (Figura 2B) nos braços abertos (TPBA) - HEC 20 (79,78±7,29), HEC 40

(66,70±6,30) - em relação ao grupo controle (27,22±5,25). Como esperado, o DZP, usado

como controle positivo, aumentou o NEBA (9,55±0,70) e o TPBA (116,7±11,75) quando

comparado ao controle. O FLU somente foi capaz de reverter este aumento nos animais

tratados com DZP.

Referente aos braços fechados no Labirinto em Cruz elevado (Figura 2C), HEC

somente na dose de 20 mg/kg (6,27±0,82) diminuiu o número de entradas em braços fechados

(NEBF) quando comparado ao controle (10,70±0,84). Quanto ao tempo de permanência

(Figura 2D) em braços fechados (TPBF), HEC nas duas maiores doses – HEC 20

(118,7±7,21) ou HEC 40 (120,6±6,68) - apresentou diminuição significativa neste parâmetro

em relação ao controle (208,5±20,91).

As associações FLU-2,5 + HEC 20 ou 40 mg/kg não alteraram os parâmetros

avaliados no teste do labirinto em cruz elevado, quando estes grupos foram comparados aos

grupos da HEC 20 ou 40, respectivamente. Contudo, o tratamento com FLU reverteu o efeito

do DZP, como esperado.

98

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC

20

HEC

40

DZP-1

FLU

DZP-1

+FLU

HEC 2

0+FLU

HEC 4

0+FLU

0

5

10

15

a

(A)

a a a

b

NE

BA

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

DZP

-1FLU

DZP

-1+F

LU

HEC 2

0+FLU

HEC 4

0+FLU

0

50

100

150

a

(B)

b

aa

TP

BA

(s)

Contr

ole

HEC

5

HEC

10

HEC

20

HEC

40

DZP-1

FLU

DZP-1

+FLU

HEC

20+

FLU

HEC

40+

FLU

0

5

10

15

(C)

a

a

b

NE

BF

Contr

ole

HEC

5

HEC

10

HEC

20

HEC

40

DZP

-1FLU

DZP

-1+F

LU

HEC

20+

FLU

HEC

40+

FLU

0

50

100

150

200

250

a

(D)

a a

b

TP

BF

(s)

Figura 2 – Efeitos da administração (ip) aguda da HEC nas doses de 5, 10, 20 ou 40 mg/kg no labirinto em cruz elevado em camundongos. A=número de entradas nos braços abertos (NEBA); B=tempo de permanência nos braços abertos (TPBA); C=número de entradas nos braços fechados (NEBF); D=tempo de permanência os braços fechados (TPBF). Cada barra representa média ± EPM, 8-11 animais por grupo. acomparado com controle; bcomparado com DZP. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

99

Referente ao labirinto em cruz elevado (Tabela 2), a administração em doses repetidas

da HEC (20 ou 40 mg/kg) causou aumento no NEBA quando comparado ao grupo controle.

No entanto, não houve alteração nos outros parâmetros do teste de labirinto em cruz elevado.

O DZP, usado como controle positivo, aumentou o NEBA e o TPBA. Houve ainda redução

no NEBF com o grupo tratado durante 7 dias com DZP.

Tabela 2 Efeitos da administração em doses repetidas (ip) da HEC 20 ou 40 mg/kg, DZP 1 mg/kg no labirinto em cruz elevado em camundongos.

Grupo (mg/kg) NEBA TPBA NEBF TPBF

Controle 1,88±0,42 38,88±8,64 8,00±0,53 127,4±7,13

HEC 20 4,80±0,59a 64,78±5,69 8,30±0,80 122,1±12,95

HEC 40 4,11±0,30a 54,78±3,09 8,40±0,70 149,0±7,38

DZP-1 4,57±0,99a 74,89±14,17a 4,16±0,89a 162,1±22,99

Valores representam média±EPM do número de entradas nos braços abertos (NEBA) e fechados (NEBF) e tempo de permanência (s) nos braços abertos (TPBA) e fechados (TPBF). n = 7-12 animais/grupo. acomparado com controle. Para todas as análises, p<0.05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

100

Placa Perfurada

No teste de placa perfurada (Tabela 3), após a administração aguda de HEC 20 ou 40

mg/kg ou DZP 1 mg/kg, foi observado um significante aumento do número de vezes que o

animal colocou a cabeça no orifício da placa (head dips) comparado ao controle.

Para pesquisar a participação de mecanismos gabaérgicos no mecanismo de ação da

HEC em relação ao seu efeito ansiolítico, utilizamos o flumazenil, o DZP e a própria HEC por

via intraperitoneal administrados isoladamente ou associados. Os resultados demonstraram

que o FLU somente reverteu o aumentou no número de head dips no grupo tratado

agudamente com DZP.

Neste modelo experimental, a administração em doses repetidas da HEC foi capaz de

aumentar o número de head dips somente na maior dose (40 mg/kg) em relação ao grupo

controle. O tratamento por sete dias com o DZP, controle positivo, também aumentou o

número de explorações aos orifícios da placa compado ao controle.

101

Tabela 3 Efeito da administração aguda (ip) ou em doses repetidas da HEC ou DZP no teste de placa perfurada em camundongos.

Grupo (mg/kg) Número de head dips

Agudo

Controle 7,52±0,79

HEC 20 25,89±3,74a

HEC 40 26,13±2,13a

DZP-1 60,38±4,37a

FLU 6.09±0.68

DZP+FLU 3,70±0,71b

FLU+HEC 20 21,29±5,63

FLU+HEC 40 25,67±5,67

Doses Repetidas

Controle 17,20±1,34

HEC 20 18,33±2,38

HEC 40 28,78±4,76a

DZP-1 28,00±2,05a

Valores representam média±EPM do número de head dips. n = 6-19 animais/grupo. acomparado com controle; bcomparado com DZP 1 mg/kg. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

102


Os dados da Tabela 4 demonstram que todas as doses de HEC causou redução no

tempo de imobilidade no teste da suspensão da cauda em camundongos, em relação ao grupo

controle em ambos os tratamentos (agudo ou em doses repetidas). A imipramina (IMI)

sozinha, administrada agudamente ou em doses repetidas, diminuiu o tempo de imobilidade

comparado ao grupo de controle. Reserpina (RES), como esperado, aumentou o tempo de

imobilidade e, assim, foi utilizada como um modelo agudo de depressão. Hecogenina

administrada agudamente (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foi capaz de reverter o efeito depressor da

reserpina.

103

Tabela 4 Efeito da administração aguda ou em doses repetidas (ip) da HEC sobre o tempo de imobilidade (s) no teste de suspensão de cauda em camundongos.

Grupo (mg/kg) Tempo de imobilidade (s)

Agudo


HEC 5 62,80±6,61a

HEC 10 66,31±7,71a

HEC 20 66,53±8,52a

HEC 40 66,87±4,92a

IMI 10 30,50±5,59a

RES 2 154,3±10,27a

RES 2+ HEC 5 79,70±11,57b

RES 2+ HEC 10 87,00±8,28 b

RES 2+ HEC 20 101,2±13,25b

RES 2+ HEC 40 91,22±6,78b

Doses repetidas


HEC 20 51,56±7,19a

HEC 40 65,13±10,36a

IMI 10 17,17±5,30a

Valores representam média±EPM do tempo de imobilidade (s). acomparado com controle; bcomparado com reserpina. n = 6-15 animais/grupo. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

104

DISCUSSÃO

As hipóteses etiopatológicas das doenças mentais originaram-se a partir de estudos em

animais sobre os efeitos de drogas no sistema nervoso central. Os modelos animais, embora

apresentem a limitação de não se poder reproduzir fidedignamente as características dos

transtornos humanos, são responsáveis, em grande parte, pelo que se sabe atualmente sobre as

ações dos psicofármacos em diversas etapas dos processos de transmissão sináptica

(GONRENSTEIN; SCAVONE, 1999). No presente trabalho, os efeitos comportamentais da

HEC, uma sapogenina esteroidal, foram investigados em modelos animais clássicos das ações

no SNC como Labirinto em Cruz Elevado, campo aberto, placa perfurada e suspensão da

cauda.

Os transtornos de ansiedade são as doenças mentais mais comuns em todo o mundo e

tornou-se uma área muito importante de interesse de pesquisa em psicofarmacologia

(BADGUJAR; SURANA, 2010). A procura por novas ferramentas terapêuticas para o

tratamento de doenças como a ansiedade, cujos efeitos colaterais estejam ausentes ou em

menor intensidade do que seu equivalente sintético, é uma das metas de toda a pesquisa pré-

clínica e clínica da atualidade (TABACH, 2011).

Sabe-se que para que novos ansiolíticos sejam desenvolvidos, é importante que se

façam testes em animais. O modelo do LCE assenta-se no comportamento exploratório

espontâneo de roedores em um ambiente com dois níveis de maior (braços abertos) ou menor

(braços fechados com paredes) característica aversiva. Esse fato gera inicialmente um conflito

aproximação-esquiva aos braços abertos, resultado da tendência exploratória do roedor e do

medo/novidade (CAROBREZ, 2003). Diversas plantas aumentam a exploração dos braços

abertos no teste de labirinto em cruz elevado e são utilizadas para diminuir a ansiedade na

medicina popular (BADGUJAR; SURANA, 2010).

Os nossos resultados mostraram que HEC 20 ou 40 mg/kg, após administração aguda,

foi capaz de aumentar significativamente os parâmetros (NEBA e TPBA) no teste de

Labirinto em Cruz Elevado, em comparação com o grupo controle. Resultados semelhantes

foram também observados com o grupo tratado com o DZP, uma dose ansiolítica (1 mg/kg), o

que sugere um efeito ansiolítico de HEC (ARAGÃO et al., 2006; MELO et al., 2006).

A fim de elucidar o mecanismo do efeito ansiolítico de HEC foi utilizado o FLU, um

antagonista dos receptores GABAérgicos das drogas benzodiazepínicas. Os nossos resultados

mostraram que o efeito de HEC não foi revertido pela administração de flumazenil. Por outro

lado, o efeito do DZP foi antagonizado pelo flumazenil. Isso sugere que o efeito ansiolítico da

HEC não envolve receptores GABAérgicos. Na clínica, o FLU é o único antagonista dos

receptores benzodiazepínicos (BDZs), onde sua ação consiste em bloquear algumas das ações

105

dos BDZs, porém não antagoniza os efeitos de outros sedativos-hipnóticos no SNC

(KLEINGEIST et al., 1998).

Para o estudo com doses repetidas, foram selecionadas as doses que apresentaram uma

melhor resposta ansiolítica no tratamento agudo. No protocolo experimental, a HEC (20 ou 40

mg/kg), após tratamento de sete dias, também causou aumento no NEBA quando comparado

ao controle.

O efeito ansiolítico da HEC, avaliado no teste do labirinto em cruz elevado, foi

confirmado no teste de placa perfurada. Um aumento no número de explorações aos orifícios

implica numa maior atividade exploratória ou uma ação ansiolítica (CRAWLEY, 1985; FILE;

PELLOW, 1985). Neste teste, foi observado um aumento no número de explorações aos

orifícios da placa nos animais que receberam HEC nas maiores doses tanto no tratamento

agudo ou em doses repetidas. Efeito semelhante foi apresentado pelos animais tratados

agudamente ou em doses repetidas com o DZP.

Os dados da literatura demonstraram que os medicamentos que modificam a atividade

motora geral podem dar resultados falso-positivo/negativo no labirinto em Cruz Elevado

(MELO et al., 2006). Desta forma, os efeitos da HEC foram estudados no teste de campo

aberto. O teste de campo aberto permite uma avaliação das atividades depressoras ou

estimulantes de um determinado composto (ARCHER et al., 1973).

No presente estudo, HEC não alterou a atividade locomotora dos animais, em todas as

doses e em ambos os tratamentos, não apresentando efeito sedativo no campo aberto. DZP,

utilizado como controle positivo, causou uma diminuição na atividade locomotora dos

animais indicando ação depressora do SNC. Isso mostra que a atividade ansiolítica da HEC

não está relacionada com a atividade motora. No estudo de Gama et al., (2013), a

administração de acetato de hecogenina (40 mg/kg) não afetou o desempenho motor de ratos

no teste Rota rod, sugerindo que a HEC não exerce bloqueio neuromuscular periférico.

Em outro estudo realizado no nosso laboratório (SANTOS JÚNIOR et al., 2012), a

administração aguda de hecogenina, no modelo de indução de sono, não potencializou a ação

do pentobarbital de sódio (40 mg/kg, ip) na latência do sono. Isto confirma que HEC não tem

atividade depressora central.

Nossos resultados demonstraram que HEC não causou alteração no grooming nas duas

maiores doses após o tratamento agudo ou em doses repetidas. O comportamento de

autolimpeza ou grooming geralmente é aumentado na ansiedade ou presença de medo em

roedores e é um índice de adaptação emocional a uma situação de tensão (KAMETANI,

1988).

106

Drogas ansiolíticas como o DZP diminuem o rearing no teste de campo aberto (DE-

SOUZA et al., 2006). HEC, administrada em doses repetidas, diminuiu este parâmetro.

É bem demonstrado que drogas com atividade antidepressiva diminuem o tempo de

imobilidade do animal nos modelos de suspensão de causa e nado forçado. Ambos são

conhecidos como testes de desespero comportamental. Embora esses dois testes sejam

utilizados com a mesma finalidade, o teste de suspensão de cauda é mais sensível e seu

resultado não pode ser confundido com o estresse causado por uma possível hipotermia que

pode ocorrer no caso do teste de nado forçado (CRYAN et al., 2005).

Nestes modelos, os animais adotam uma postura de imobilidade após um período

inicial de agitação. A imobilidade observada se assemelha ao estado de anedonia apresentado

por pacientes depressivos durante o curso da doença (DE-SOUZA et al., 2006). Os dados do

teste de suspensão de cauda sugeriram que HEC, em todas as doses estudadas, causou um

efeito antidepressivo, uma vez que uma diminuição no tempo de imobilidade dos animais foi

observado após o tratamento agudo. A imipramina, um antidepressivo clássico, mostrou uma

diminuição no tempo de imobilidade do animal, que está de acordo com estudos,

demonstrando a sensibilidade desses ensaios a várias classes de drogas antidepressivas

(PORSOLT et al., 1978).

Hecogenina foi capaz de reverter o efeito depressor da reserpina, um inibidor

conhecido do transportador vesicular da catecolamina noradrenalina (que facilita o

armazenamento vesicular). Um processo semelhante ocorre em locais de armazenamento de

5-HT, o que pode, finalmente, resultar numa diminuição de aminas biogênicas (ARAGÃO et

al., 2006), provocando vários efeitos mensuráveis (hipotermia, bradicardia, diminuição da

atividade motora e outros), que são reduzidas por antidepressivos (RANG et al., 2007). Estes

resultados mostraram que o tratamento agudo da HEC tem efeitos antidepressivos podendo

esta ação ocorrer por vias serotoninérgicas e noradrenérgicas.

De maneira semelhante ao tratamento agudo, a administração em doses repetidas da

HEC (20 ou 40 mg/kg) causou efeito antidepressivo nos camundongos. Entretanto, este efeito

não foi superior aquele observado com a imipramina.

Autores (GONRENSTEIN; SCAVONE, 1999) explicam que as alterações metabólicas

e funcionais, observadas inicialmente nos tratamentos agudos de animais, na maioria das

vezes não só não persistem após administração repetida, como são substituídas por alterações

que podem, de fato, ser opostas às observadas agudamente. Assim, consideramos que a

administração de doses repetidas de HEC permitiu uma avaliação verdadeira sobre os efeitos

ansiolíticos e antidepressivos da molécula, tendo em vista que o tratamento da ansiedade ou

depressão é realizado cronicamente.

107

O presente estudo mostrou que a administração de hecogenina (20 ou 40 mg/kg)

apresentou efeitos ansiolíticos nos testes do Labirinto em Cruz Elevado e Placa Perfurada e

este efeito não foi relacionado aos receptores benzodiazepínicos. Este efeito também foi

desprovido de efeito sedativo significativo, tal como avaliado pelo teste de campo aberto.

Parâmetros observados no teste de suspensão da cauda apoiam a idéia de que HEC

possivelmente apresenta atividade antidepressiva sobre o SNC, onde os mecanismos

noradrenérgicos provavelmente desempenham um papel. É interessante notar que este é um

estudo pioneiro sobre a ação no SNC de HEC e será importante para futuros estudos sobre a

molécula.

108

REFERÊNCIAS

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109

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110

Artigo 3

Determinação da concentração de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e

corpo estriado de camundongos tratados agudamente com hecogenina

111

Determinação da concentração de aminoácidos no córtex pré-frontal, hipocampo e

corpo estriado de camundongos tratados agudamente com hecogenina

Rita Neuma D. C. de Abreua,b, José M. Barbosa Filhoc, Augusto Lopes Soutoc, Edna Maria

Camelo Chavesd, Glauce Socorro de Barros Vianad, Maria Goretti R. de Queirozd, Lissiana

Magna Vasconcelos Aguiard, Silvânia M. M. Vasconcelosd






RESUMO: Objetivou-se verificar a concentração de aminoácidos excitatórios e inibitórios no

córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE) de camundongos após a

administração aguda de hecogenina (HEC), isolada de Agave sisalana Perrine. Camundongos

machos Swiss, pesando de 25-35g, foram tratados com Tween 80 4% (controle), HEC 5, 10,

20 ou 40mg/kg, via intraperitoneal - ip. Para a determinação das concentrações de

aminoácidos, utilizou-se o equipamento de High Performance Liquid Chromatography com

detector de fluorescência. No CPF, de camundongos tratados com HEC, o aminoácido

excitatório glutamato (GLU) aumentou nas doses de 10, 20 ou 40mg/kg. Enquanto os

inibitórios ácido gama-aminobutírico (GABA) e Taurina (TAU) aumentaram nas doses de 20

ou 40mg/kg. No HC, em camundongos tratados com HEC, mostrou que esta molécula não

alterou o GABA. Nesta área, houve aumento de aspartato (ASP), GLU, glicina (GLI) e TAU

apenas na maior dose de HEC. No CE, ocorreu o aumento do ASP, GLU e TAU após as doses

de 20 ou 40 mg/kg de HEC. As concentrações de GLI e GABA aumentaram na maior dose de

HEC (40 mg/kg) nesta área cerebral. Os resultados sugerem que a HEC, nas maiores doses,

aumenta os níveis de aminoácidos excitatórios e inibitórios em áreas cerebrais.

Palavras-chave: Aminoácidos; sistema nervoso central; hecogenina.

112

INTRODUÇÃO

A. sisalana, popularmente conhecida como sisal, é uma planta originada do México,

fazendo parte da família Agavaceae. É bem adaptada à região semi-árida do Nordeste do

Brasil (SANTOS et al., 2009). No suco das folhas de Agave é encontrado sapogenina

esteroidal. No caso da A. sisalana, as sapogeninas (porção não glicosídica de uma saponina)

encontradas são: a tigogenina, a diosgenina e a hecogenina, registrando-se maior percentual

para esta última (PIZARRO et al., 1999).

O reconhecimento da ação farmacológica da hecogenina (HEC) no sistema nervoso

central (SNC) deve servir de estímulo para outras investigações. Uma avaliação recente sobre

o efeito antinociceptivo do acetato de hecogenina, usando expressão de Fos como um

marcador de ativação neuronal, sugeriu que a molécula induz a ativação da substância

cinzenta periaquedutal (GAMA et al., 2013). A administração aguda da HEC (5 ou 10 mg/kg,

ip) mostrou ação neuroprotetora relacionada a diminuição da peroxidação lipídica em áreas do

cérebro de camundongos (SAMPAIO et al., 2012). Em outro estudo, HEC demonstrou um

efeito antidepressivo e ansiolítico (LIMA et al., 2012).

Vários neurotrasmissores no SNC são aminoácidos tais como o Aspartato (ASP),

Glutamato (GLU), Glicina (GLI), Taurina (TAU) e o Ácido gama-aminobutírico (GABA).

Esses aminoácidos estão envolvidos em muitos processos fisiológicos importantes, desde o

desenvolvimento da formação das sinapses à aprendizagem e memória. O glutamato (GLU) é

o neurotransmissor excitatório predominante no SNC de mamíferos. Uma estimativa bruta é

que mais de 50% de todas as sinapses são glutamatérgicas (ALMEIDA, 2006). Outro

importante aminoácido no SNC é o GABA. Foi estimado que o GABA atua como transmissor

em cerca de 30% de todas as sinapses (RANG et al., 2012). A taurina, ou ácido 2-

aminoetanosulfônico, é um dos aminoácidos livres mais abundantes em diferentes tecidos,

sendo essencial para o funcionamento do sistema nervoso central dos mamíferos, atuando na

osmorregulação, estabilização e manutenção da integridade da membrana neuronal, e na

neuroproteção e controle da homeostasia do cálcio (SARANSAARI; OJA, 2007).

Visando expandir nossos estudos sobre a ação da HEC, o objetivo do presente trabalho

foi verificar a concentração de aminoácidos excitatórios (ASP e GLU) e inibitórios (GLI,

TAU e GABA) no córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE) de

camundongos após a administração aguda de HEC e, assim, identificar seu possível

mecanismo de ação a nível do SNC.

113

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal






álcool etílico (etanol) 95% em um aparelho de Soxhlet por 24 horas. O solvente foi removido

sob pressão reduzida e o resíduo foi hidrolisado sob refluxo por quatro horas com 1,5 litros de

ácido hidroclórico etanólico 2N. A mistura reacional foi coletada e filtrada. A fração ácida

insolúvel foi lavada com água, solução de carbonato de sódio e água, até neutralizar. Depois

de seco, o resíduo ácido insolúvel foi extraído com hexano em um aparelho Soxleht por 12

horas. O extrato hexânico foi levado à um refrigerador por 24 horas. Após este período, um

precipitado foi formado. O precipitado foi filtrado e depois recristalizado em acetona,

formando 1g de hecogenina (0,02%), m.p. 256-258°C (lit.1 258 – 260°C). A hecogenina

encontrada é idêntica a uma amostra autêntica (co-TLC e mixed m.p.). 1H- e 13C-NMR (500 e

125 MHz) o espectro da hecogenina está de acordo com a literatura previamente citada

(AGRAWAL et al., 1985; JAFFER et al., 1983). O acetato de hecogenina foi obtido por

reação de acetilação da hecogenina com uma mistura de anidrido acético/piridina (KIM et al.,

2001). O sobrenadante foi concentrado e o resíduo foi submetido à cromatografia em coluna e




114

Animais


Biotério da Universidade Federal do Ceará (UFC). O projeto aprovado pelo Comitê de Ética

em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC (Nº protocolo 44/2010).

Reagentes e drogas

Tween 80 4 % foi obtido de Vetec Química Farm. Ltda (Rio de Janeiro, Brasil).

Enquanto o Aspartato, Glutamato, Glicina, Taurina e o GABA, foram adquiridos da Sigma

Chem. Co. (St. Louis, MO, USA).

Protocolo de tratamento para Dosagem de Aminoácidos

Os animais foram tratados Tween 80 4 % (controle), HEC 5, 10, 20 ou 40 mg/kg.

Todos os grupos foram tratados por via intraperitonial (ip). Trinta minutos após a

administração dos compostos, os animais foram sacrificados por rápida decapitação e o CPF,

HC e CE foram dissecados, congelados e armazenados a -70 ºC até serem utilizados para os

ensaios, seguindo a metodologia de Pereira et al. (2009).

Dosagem de Aminoácidos

Para a determinação das concentrações de aminoácidos, utilizou-se o equipamento de

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) com detector de fluorescência. Os

tecidos cerebrais foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30s e centrifugados por

15 minutos em centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. O sobrenadante foi separado e filtrado

por meio de uma membrana (millipore - 0,2 µm) e, posteriormente, associado a uma solução

de derivatização pré-coluna, para obtenção de fluorescência, em uma proporção de 1:1. Um

minuto depois do início dessa associação uma alíquota de 20 µl foi retirada e injetada no

equipamento de HPLC para a análise química.

Para a análise dos aminoácidos, uma coluna CLC-ODS (M) com comprimento de 15

cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 m, da Shimadzu-Japão foi utilizada. A fase

móvel foi utilizada em gradiente com duas fases: A- NaH2PO4 (50mM) e metanol (20%, v/v)

em pH 5,5; B- Metanol puro (100 %). Aspartato (ASP), Glutamato (GLU), Glicina (GLI),

Taurina (TAU) e GABA foram detectados com uso de um detector de fluorescência (Modelo

RF-535 da Shimadzu, Japão) com comprimento de ondas de EX-Wavelength (370 nm) e EM-

Wavelength (450 nm). Os cromatogramas foram registrados e quantificados por um

computador usando um software da Shimadzu. A quantidade dos aminoácidos foi calculada

115

por comparação da altura dos picos obtidos com a média dos padrões e os resultados

expressos em µmol/g de tecido.







116

RESULTADOS

Referente aos aminoácidos excitatórios no CPF (Figura 1A), a concentração de ASP

aumentou nesta área cerebral após a administração aguda de HEC nas duas maiores doses

(HEC 20: 67,22±10,42; HEC 40: 106,8±12,52) quando comparado com o controle

(21,95±7,29). Efeito semelhante foi observado nas concentrações de GLU nas doses de 10,

20 ou 40 mg/kg (HEC 10: 79,25±14,10; HEC 20: 133,1±7,68; HEC 40: 197,9±12,04)

comparado ao controle (19,61±3,80).

Em relação aos aminoácidos inibitórios no CPF (Figura 1B), após a administração

de HEC, a concentração de GLI aumentou nas doses de 20 (77,03±19,44) ou 40 mg/kg

(61,31±5,44) quando comparado ao controle (24,22±3,12). Efeito semelhante foi observado

nas concentrações de TAU (HEC 20: 452,3±101,0; HEC 40: 733,4±26,24) e GABA (HEC

20: 174,7±46,62; HEC 40: 204,2±8,97) quando comparado ao grupo controle

(TAU=141,4±23,78; GABA= 33,10±5,03).

117

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

0

50

100

150

200

250ASP

GLU

a

a,b,ca,b

a,b,c

a,b,c,d

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µµ µµm

ol/

g d

e t

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HEC 5

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0

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e

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0

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trol

e

HEC 5

HEC 1

0

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0

200

400

600

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a,b,c

a,b,c,d

a,b,

c

a,b,c

B)

a

µµ µµm

ol/

g d

e t

ecid

o

Figura 1. Efeitos da HEC na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e inibitórios (B) em CPF de camundongos. Controle (Tween 80 4 %) ou HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foram administrados 30 minutos (ip) antes do experimento. Dados em µmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n =4-11). a,b,c,d quando comparado aos grupos controle, HEC 5, HEC 10 ou HEC 20, respectivamente. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

118

Os resultados da Figura 2A mostram a concentração dos aminoácidos excitatórios no

HC, após administrações de HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, ip) ou veículo sobre as

concentrações de aminoácidos (µmol/g de tecido) em camundongos. Nesta área cerebral, as

concentrações de ASP e GLU foram aumentadas na maior dose de HEC (ASP=244,8±81,21;

GLU=86,10±32,51) quando comparado aos grupos controles (ASP= 40,86±10,32; GLU=

31,04±5,35).

Efeito semelhante foi observado nessa área cerebral (Figura 2B) após a administração

de HEC, em altas doses, nas concentrações dos aminoácidos inibitórios GLI (51,88±17,84) e

TAU (341.1±110.9) quando comparado ao grupo controle (GLI= 11,94±2,35;

TAU=122,8±19,18). As concentrações de GABA não foram alteradas no HC dos animais

tratados com HEC quando comparado com o controle.

119

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

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0

0

100

200

300

400ASP

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a,b,c,d

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HEC 5

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400

500

TAU

GABA

GLI

B)

a

a

µµ µµm

ol/

g d

e t

ecid

o

Figura 2. Efeitos da HEC na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e inibitórios (B) em HC de camundongos. Controle (Tween 80 4 %) ou HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foram administrados 30 minutos (ip) antes do experimento. Dados em µmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n =3-9). a,b,c,d quando comparado aos grupos controle, HEC 5, HEC 10 ou HEC 20, respectivamente. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

120

Sobre os aminoácidos excitatórios no CE (Figura 3A), a administração aguda de 20

ou 40 mg/kg de HEC aumentou a concentração de ASP (HEC 20: 63,43±10,70; HEC 40:

210,0±22,83) comparado ao controle (16,22±1,98). Efeito semelhante foi observado na

concentração de GLU (HEC 20: 215,4±22,22; HEC 40: 227,2±30,53) quando comparado ao

grupo controle (32,62±2,76).

Quanto aos aminoácidos inibitórios (Figura 3B), HEC causou aumento na

concentração de GLI e GABA no CE dos camundongos após a administração da molécula na

dose de 40 mg/kg (GLI=85,33±12,75; GABA=194,2±31,03) quando comparado ao grupo

controle (GLI=29,74±2,65; GABA= 70,74±7,61). Efeito semelhante foi observado com TAU,

porém esse aumento foi observado tanto na dose de 20 (TAU=450,5±68,69) quanto na de 40

mg/kg (TAU=812,1±109,2) comparada ao controle (TAU=157,4±25,16).

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Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

Contr

ole

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

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0

0

100

200

300ASP

GLU

a

a,b,c,d

A)

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µµ µµm

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Contr

ole

HEC 5

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HEC 5

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GABA

GLI

B)

a,b,c,d

a

a,b,c,d

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µµ µµm

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g d

e t

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o

Figura 3. Efeitos da HEC na concentração de aminoácidos excitatórios (A) e inibitórios (B) em CE de camundongos. Controle (Tween 80 4 %) ou HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foram administrados 30 minutos (ip) antes do experimento. Dados em µmol/g de tecido são apresentados como média ± EPM (n =4-13). a,b,c,d quando comparado aos grupos controle, HEC 5, HEC 10 ou HEC 20, respectivamente. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

122

DISCUSSÃO

A avaliação das alterações provocadas por moléculas isoladas de plantas nas

concentrações de aminoácidos excitatórios e inibitórios do SNC tem despertado o interesse

dos pesquisadores nos últimos anos (ARAGÃO et al., 2006; CHAVES, 2012; PEREIRA et

al., 2009). Nestas pesquisas, foram estudadas áreas cerebrais tais como córtex pré-frontal,

hipocampo e corpo estriado que recebem informações de todas as modalidades sensitivas,

assim como sobre estados motivacionais e emocionais (AFIFI; BERGMAN, 2007).

Nossos resultados demonstraram que a administração aguda de HEC, nas duas

maiores doses, aumentou as concentrações dos principais aminoácidos GLU e GABA no

córtex pré-frontal. No corpo estriado, efeito semelhante foi observado apenas quando a maior

dose de HEC foi administrada. No HC, outra área estudada, as concentrações do GABA não

foram alteradas após a administração de nenhuma dose de HEC. Nesta área, as concentrações

de GLU foram aumentadas apenas na maior dose de HEC.

Um estudo prévio do nosso grupo (LIMA et al., 2012) sugeriu que a HEC não

apresenta um mecanismo de ação similar aos benzodiazepínicos ou não age no sítio de ação

dessa classe de fármacos pois os efeitos ansiolíticos da HEC, nos testes compostamentais, não

foram revertidos com o uso do flumazenil, um antagonista GABAérgico. Ressaltamos ainda

que no estudo de Lima et al (2012), a dose de 20 mg/kg de HEC causou também efeito

ansiolítico nos testes comportamentais. No entanto, esta dose não causou aumento na

concentração de GABA no HC e CE dos animais.

O GABA serve como transmissor de cerca de 30% das sinapses no SNC. Este

aminoácido é particularmente abundante (cerca de 10 µmol/g de tecido) no sistema

nigroestriado, porém ocorre em concentrações menores (2-5 µmol/g) em toda a substância

cinzenta (ARAGÃO et al., 2006; RANG et al., 2012). O glutamato tem um efeito modulatório

sobre o sistema gabaérgico em que um aumento de glutamato endógeno no córtex pré-frontal

está relacionado com concentrações aumentadas de GABA extracelular (DEL ARCO;

MORA, 1999). Outro autor (CAROBREZ, 2003) esclarece que o GLU pode ser encontrado

em vesículas sinápticas para ser liberado de maneira dependente de Ca++ ou como precursor

do GABA em sinapses inibitórias. Os estudos de ligação (binding) fármaco-receptor mostram

que os receptores de GLU são mais abundantes no córtex, nos núcleos da base e nas vias

sensitivas (RANG et al., 2012).

Hecogenina, apenas nas maiores doses, causou aumento de ASP nas áreas cerebrais

estudadas. Chaves (2012) explica que o entendimento do mecanismo da modulação mútua

entre os aminoácidos é complexo, pois envolve muitas vezes mais de um sistema. O ASP tem

relação com o GLU, atuando como um agonista relativamente seletivo de receptores

123

glutamatérgicos NMDA extra-sinápticos (BRADFORD; NALDER, 2004). Miyamoto et al.,

(2001), esclarece que a função dos receptores glutamatérgicos NMDA parece estar

relacionado à atividade serotoninérgica. Portanto, dados obtidos em testes comportamentais

mostraram que HEC tem efeitos ansiolíticos e antidepressivos (LIMA et al., 2012), sendo que

o efeito excitatório do glutamato pode estar sendo modulado pela atividade serotoninérgica.

O Glutamato tem ação modulatória realizada por outros neurotransmissores. Sabe-se

que, além do glutamato, a ativação dos receptores NMDA exige glicina. O GLU, ligando-se

com alta afinidade na subunidade NR2 em associação com a glicina (GLI), ligada na

subunidade NR1, promoveriam a entrada de Ca++ e Na+, contribuindo para a excitabilidade da

célula (CAROBREZ, 2003).

Portanto, a GLI junto com o GLU atua como um co-agonista de receptores NMDA,

facilitando ação da atividade excitatória dos receptores glutamatérgicos, em contraste com a

atividade inibitória da glicina (ALMEIDA, 2006), que, quando receptores de glicina são

ativados, o ânion cloreto entra no neurônio através de receptores ionotrópicos, causando um

potencial pós-sináptico inibitório (RANG et al., 2012). GLI apresenta ainda ações

antiinflamatórias, citoprotetoras e imunomoduladoras (PEREIRA et al., 2009).

Nesta pesquisa, a administração de HEC nas doses de 5 ou 10 mg/kg não alterou a

concentração de GLI nas três áreas cerebrais estudadas. Em outra pesquisa (ALMEIDA et al.,

2012) realizada em nosso laboratório foi demonstrado que as doses de 5 ou 10 mg/kg de HEC

(ip) não causaram proteção das convulsões induzidas com estricnina, esta droga age

principalmente na medula espinal e bloqueia tanto a resposta inibitória sináptica quanto à

resposta à glicina. Assim, este estudo sugeriu que estas doses menores de HEC não aumentam

GLI. No entanto, foi observado que a HEC, nas maiores doses, age nesse sistema,

aumentando as concentrações de GLI no CPF, HC e CE.

A taurina é o aminoácido livre mais abundante no cérebro, depois de GLU. Apesar de

taurina desempenhar um papel importante no desenvolvimento neural, osmorregulação e

proteção neural, as suas funções na neurotransmissão e modulação permanecem mal

compreendidos. A ausência de evidência molecular de um receptor específico e de um

antagonista específico para taurina torna difícil diferenciar os seus efeitos da GLI e do GABA.

Em muitos casos, os transportadores de TAU são encontrados em neurônios glutamatérgicos,

sugerindo que a taurina e glutamato podem ser liberados a partir dos mesmos neurônios

(BULLEY; SHEN, 2010). Portanto, o aumento de TAU nas áreas cerebrais estudadas, após a

administração aguda de HEC, pode ser parcialmente justificado pelo aumento do GLU.

124

Taurina tem várias funções protetoras contra a toxicidade do glutamato no cérebro

(BULLEY; SHEN, 2010) como, por exemplo, nas situações de isquemia cerebral e lesão

medular em que os neurônios são susceptíveis a toxicidade do glutamato (BENTON; ROSS;

MILLER, 2001).

Conforme explicitado, HEC apresentou efeito ansiolítico nos testes de labirinto em

cruz elevado e na placa perfurada (LIMA et al., 2012) e este efeito pode estar relacionado ao

aumento nas concentrações de aminoácidos como a TAU em áreas cerebrais.

Estudos farmacológicos revelaram que a microinjeção de TAU produziu uma

diminuição inicial na atividade neuronal, reduzindo o comportamento de ansiedade no teste de

labirinto em cruz elevado (MCCOOL; CHAPPELL, 2007). Outro estudo delineado por

Pereira et al (2009) mostrou que o diazepam (1 mg/kg), dose ansiolítica, administrado

agudamente causou aumento na concentração de TAU no CPF e HC de camundongos. Cabe

citar ainda o estudo de Chaves (2012) quando foi demonstrado que um composto vegetal com

ação ansiolítica foi capaz de aumentar a concentração de TAU no CPF, HC e CE dos animais.

Por meio da dosagem da concentração dos aminoácidos no CPF, HC e CE, após a

administração aguda de HEC, foi possível concluir que a HEC, nas maiores doses, age no

SNC aumentando GLU que tem um efeito modulatório sobre ASP, GLI e TAU.

125

REFERÊNCIAS

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127

Artigo 4

Determinação da concentração de monoaminas no corpo estriado de camundongos

tratados agudamente com hecogenina

128

Determinação da concentração de monoaminas no corpo estriado de camundongos

tratados agudamente com hecogenina

Rita Neuma D. C. de Abreua,b, Aline Miranda Sousab, José M. Barbosa Filhoc, Augusto Lopes

Soutoc, Silvânia M. M. Vasconcelosd






RESUMO: Objetivou-se verificar a concentração das monoaminas (dopamina (DA),

norepinefrina (NA), serotonina (5-HT)), e seus metabólitos (ácido 3,4-hidroxifenil (DOPAC),

ácido homovanílico (HVA) e 5 ácido hydroxiindolacético (5-HIAA)) no corpo estriado de

camundondos após administração aguda de hecogenina (HEC), isolada de Agave sisalana

Perrine. Camundongos machos Swiss, pesando de 25-35 g, foram tratados com Tween 80 4%

(controle), HEC 5, 10, 20 ou 40mg/kg, via intraperitoneal - ip. Para a determinação das

concentrações de monoaminas, utilizou-se o equipamento de High Performance Liquid

Chromatography com detector de fluorescência. Nenhuma alteração nas concentrações de DA

foi observada após tratamento agudo de HEC nas doses estudadas. Entretanto, HEC nas

maiores doses, causou uma redução nas concentrações de DOPAC e HVA quando comparado

aos seus controles. A administração de HEC nas doses de 20 ou 40 mg/kg aumentou as

concentrações de NA, quando comparado ao controle. Quanto as concentrações de serotonina

e 5-HIAA, a HEC somente causou um aumento dessa monoamina e de seu metabólito na

maior dose estudada. O aumento nas concentrações das monoaminas estriatais pode ser

sugerir um possível mecanismo de ação do efeito antidepressivo da hecogenina.

Palavras-chave: Monoaminas; sistema nervoso central; hecogenina.

129

INTRODUÇÃO

As doenças neuropsiquiátricas têm aumentado em conseqüência do aumento da

população idosa, o que acarreta um grande problema social. Acredita-se que as monoaminas

estejam envolvidas na patogenia de muitas doenças mentais. Ressalta-se a hipótese das

monoaminas, a qual deduziu que a depressão devia estar associada à diminuição da

transmissão sináptica funcional dependente de aminas (GOLAN et al., 2010; MELO et al.,

2011).

O mecanismo de ação de grande parte dos antidepressivos clássicos é por meio da

inibição da recaptação das monoaminas, pelo bloqueio do sítio específico dos transportadores

monoaminérgicos, ou por inibição da enzima monoaminoxidase, responsável pela degradação

das monoaminas (GUIARD; MANSARI; BLIER, 2009; KATZUNG, 2007).

Estudos têm demonstrado que compostos de origem vegetal causam mudanças no

comportamento animal com potencial antidepressivo (LIMA et al., 2010; VENÂNCIO, 2009)

por alterarem a concentração das monoaminas em áreas cerebrais. Esses compostos vegetais

são promissores como alvos terapêuticos para doenças no SNC, como a depressão e a

ansiedade.

Foi iniciado, no laboratório de Neuropsicofarmacologia da UFC, estudo sobre a ação

da hecogenina, uma sapogenina esteroidal isolada de Agave sisalana Perrine, no sistema

nervoso central de camundongos (ALMEIDA et al., 2012; SAMPAIO et al., 2012;

VASCONCELOS et al., 2010). Em modelos para verificar a atividade antidepressiva de

drogas, a hecogenina apresentou efeito antidepressivo. Portanto, decidiu-se confirmar este

efeito por meio da determinação da concentração de monoaminas no corpo estriado de

camundongos.

O objetivo do presente estudo foi verificar a concentração das monoaminas (dopamina

(DA), norepinefrina (NA), serotonina (5-HT)), e seus metabólitos (ácido 3,4-hidroxifenil

(DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 5 ácido hydroxiindolacético (5-HIAA)) no corpo

estriado de camundondos após administração aguda de hecogenina.

130

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal






















131

Animais




Protocolo de tratamento

Os animais foram tratados Tween 80 4 % (controle), HEC 5, 10, 20 ou 40 mg/kg.

Todos os grupos foram tratados por via intraperitonial (ip). Trinta minutos após a

administração dos compostos, os animais foram sacrificados por rápida decapitação e o CE de

cada animal foi dissecado, congelado e armazenado a -70 ºC até ser utilizado para os ensaios.

Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos

O CE foi utilizado para preparar homogenatos a 10%. Os tecidos cerebrais foram

sonicados em ácido perclórico (HCLO4) por 30 s e centrifugados por 15 minutos em

centrífuga refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µl do sobrenadante foi, então,

injetada no equipamento de HPLC com detecção eletroquímica, para a análise química.

Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de 25

cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 µm, da Shimadzu-Japão, foi utilizada. A fase

móvel utilizada foi composta por tampão ácido cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido

octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS), como reagente formador do par iônico, acetonitrila 4

% v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v. Dopamina (DA), DOPAC (Ácido diidroxifenilacético

(DOPAC), Ácido homovanílico (HVA), Serotonina (5-HT), Ácido 5-hidroxiindolacético (5-

HIAA) e Noradrenalina (NE) foram eletronicamente detectados usando um detector

amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em um eletrodo de

carbono vítreo fixado em 0,85 V relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl. Os padrões

foram preparados em uma concentração final de 4 ng de NE, DA, 5-HT, DOPAC, HVA e 5-

HIAA (Sigma, MO, EUA). A partir da altura ou área dos picos desses padrões, as amostras

foram calculadas no programa Microsolf Excel em um computar PC e os resultados expressos

em ng/g de tecido.

132







133

RESULTADOS

As concentrações de monoaminas e seus metabólitos em corpo estriado de

camundongos após a administração aguda de hecogenina (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, ip) estão

apresentados nas Figuras 1 e 2.

Nenhuma alteração nas concentrações de dopamina foi observada após tratamento

agudo de HEC nas doses estudadas. Entretanto, HEC, nas maiores doses, causou uma redução

nas concentrações de DOPAC (HEC 20=268,1±61,56; HEC 40=780,3±113,5) e HVA (HEC

20=218,5±38,04; HEC 40=111,2±24,30) quando comparado aos seus controles

(DOPAC=1565±266,9; HVA=600,8±76,61). Efeito semelhante foi observado nas

concentrações de HVA entre os grupos de HEC (40 mg/kg) quando comparado aos grupos

tratados com HEC de 5 ou 10 mg/kg (HEC5=554,2±74,09; HEC 10=488,3±102,4).

134

Controle

HEC 5

HEC 10

HEC 20

HEC 40

Controle

HEC 5

HEC 10

HEC 20

HEC 40

Controle

HEC 5

HEC 10

HEC 20

HEC 40

0

500

1000

1500

2000

DOPAC

HVA

DA

a

a

a,b

a,b,cn

g/g

de

teci

do

Figura 1 – Efeito da administração aguda da hecogenina (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, i.p.) nas concentrações de DA, DOPAC e HVA (ng/g de tecido) em corpo estriado de camundongos. Os valores foram expressos como média±EPM (n =5-9). Controle (Tween 80 4 %) ou HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foram administrados 30 minutos (ip) antes do experimento. a,b,cquando comparado aos grupos controle, HEC 5 ou HEC 10, respectivamente. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc). Dopamina (DA); ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

135

A administração de HEC (Figura 2), nas doses de 20 ou 40 mg/kg, aumentou as

concentrações de noradrenalina (HEC 20=3102±343,4; HEC 40=2636±489,8), quando

comparado ao controle (708,1±157,0) . Quanto as concentrações de serotonina e 5-HIAA, a

HEC somente causou um aumento dessa monoamina e de seu metabólito na maior dose

estudada (5-HT=1752±359,1; 5-HIAA=2732±315,1) quando comparada aos grupos controles

(5-HT=365,7±66,64; 5-HIAA=311,5±43,23).

136

Con

trol

e

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

Con

trol

e

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

Con

trol

e

HEC 5

HEC 1

0

HEC 2

0

HEC 4

0

0

1000

2000

3000

4000

5-HT

5-HIAA

NAa,b,ca,b,c

a,b

a,b,c,d

ng

/g d

e t

ecid

o

Figura 2 – Efeito da administração aguda da hecogenina (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, i.p.) nas concentrações de NA, 5-HT e 5-HIAA (ng/g de tecido) em corpo estriado de camundongos. Os valores foram expressos como média±EPM (n =3-12). Controle (Tween 80 4 %) ou HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) foram administrados 30 minutos (ip) antes do experimento. a,b,c,dquando comparado aos grupos controle, HEC 5, HEC 10 ou HEC 20, respectivamente. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc). Noradrenalina (NA), serotonina (5-HT) e ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) foram detectados eletroquimicamente através da técnica de HPLC.

137

DISCUSSÃO

As concentrações de dopamina, serotonina e noradrenalina e metabólitos foram

estudados no CE de camundongos após a administração aguda de HEC. Esses resultados

demonstraram que a HEC apresentou um aumento nas concetrações de NE e 5-HT, porém

sem aumentar DA.

A dopamina é encontrada em quantidades mais abundandes no corpo estriado,

ocorrendo também em altas concentrações em certas partes do sistema límbico e hipotálamo.

A dopamina é, em grande parte, capturada após a sua liberação das terminações nervosas por

um transportador específico de dopamina. É metabolizada pela MAO e catecol-O-

metiltransferase (COMT), sendo os principais produtos o ácido diidroxifenilacético (DOPAC)

e o ácido homovanílico (HVA, o derivado metoxi do DOPAC) (RENARD et al., 2003;

RANG et al, 2012). Os efeitos conseqüentes à diminuição na função do sistema

dopaminérgico são, reconhecidamente, demência e depressão, enquanto uma ativação desse

sistema conduz à psicose, ansiedade, confusão e agressão (ARAÚJO et al., 2006).

O conteúdo de DA no corpo estriado de camundongos não sofreu nenhuma alteração

após a administração HEC nas quatro doses estudadas, o que é consistente com a ausência de

mudança da atividade locomotora evidenciada no campo aberto em pesquisas prévias

realizadas em nosso laboratório. Por outro lado, os níveis de DOPAC e de HVA diminuiram

de maneira significativa após a administração de HEC nas maiores doses.

Dados na literatura mostram um aumento nos níveis de DA e acompanhado de um

aumento de DOPAC decorrente do estresse induzido pelo nado forçado em animais

(RENARD et al., 2003). Em nossos resultados foi observado que a hecogenina também

diminuiu esse metabólito (DOPAC) em corpo estriado, mostrando provavelmente, um efeito

antidepressivo da molécula a nível de Sistema Nervoso Central, desde que, o teste de

suspensão de cauda apresentou este efeito em animais tratados com hecogenina.

Hecogenina, nas duas maiores doses, aumentou a concentração de noradrenalina no

CE dos camundongos. Sabe-se da participação do sistema noradrenérgico na fisiopatologia da

depressão, e esta visão é consistente com efeitos dos antidepressivos em animais. Não há

evidência consistente sobre o mecanismo específico, mas está claro que a alteração da

atividade dos neurônios noradrenérgicos está envolvida na ação de drogas antidepressivas

(VENÂNCIO, 2009).

É bem estabelecido que a depressão está relacionada a redução de noradrenalina e

serotonina e que inibidores seletivos da recaptação de noradrenalina e ou serotonina

melhoram a depressão (GOLAN et al., 2010; KATZUNG, 2007).

138

Os dados demonstraram que a concentração de serotonina foi aumentada com a maior

dose de HEC. No entanto, houve aumento do seu metabólito (5-HIAA) nesta mesma dose de

HEC. A serotonina (5-HT) desempenha um importante papel no sistema nervoso, com

diversas funções, como a liberação de alguns hormônios, regulação do sono, temperatura

corporal, apetite, humor, atividade motora e funções cognitivas. Como a formação de 5-HIAA

é responsável por quase 100% do metabolismo da 5-HT no cérebro, a taxa de renovação da

serotonina é estimada ao se determinar a taxa de elevação do 5-HIAA (FEIJO, BERTOLUCI

e REIS, 2011). Segundo Venâncio et al (2009) a redução das concentrações de monoaminas,

bem como de seus metabólitos no CPF, HC e CE de camundongos sugere atividade

depressora de compostos vegetais determinada após a análise dos modelos animais

comportamentais de depressão.

Os dados apresentados permitiram concluir que HEC aumentou as concentrações de

NE e 5-HT, sugerindo que seu efeito antidepressivo pode estar diretamente ligado ao

aumento dessas monoaminas no CE de camundongos.

139

REFERÊNCIAS AGRAWAL, P.K.; JAIN, D.C.; GUPTA, R.K.; THAKUR, R.S. Carbon-13 NMR spectroscopy of steroidal sapogenins and steroidal saponins. Phytochemistry, 24, 2479-2496, 1985. ALMEIDA, A.B. et al. Efeito da hecogenina no modelo de indução de convulsão em camundongos. In: XXII Simpósio de plantas medicinais do Brasil. 2012, Bento Gonçalves, RS. Anais do XXII Simpósio de plantas medicinais do Brasil. Rio Grande do Sul, 2012. FEIJO, F de M.; BERTOLUCI, M. C.; REIS, C. Serotonina e controle hipotalâmico da fome: uma revisão. Rev. Assoc. Med. Bras. v.57, n.1, p. 74-77, 2011. GOLAN, D. E. et al. Princípios de Farmacologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010. GUIARD, B. P.; MANSARI, M. E.; BLIER, P. Prospect of a Dopamine Contribution in the Next Generation of Antidepressant Drugs: The Triple Reuptake Inhibitors. Current Drug Targets, 10, 1069-1084, 2009. JAFFER, J.A.; CRABB, T.A.; TURNER, C. H.; Blunden, G. Hydroxy group substituent effects on HNMR chemical shifs in the structural elucidation of spirostanes. Journal of Magnetic Resonance, 21, p. 576-579, 1983. KATZUNG, B.G. Farmacologia básica e clínica. 10 ed. São Paulo: McGraw-Hill, 2007. KIM, J.Y.; KOO, H.M.; KIM, D.S. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11, p. 2405-2408, 2001. LIMA, R.; LIMA, N.; CHAVES, E.; LEAL, L.; PATROCÍNIO, M.; LOBATO, R.; RAMOS, M.; SOUSA, F.C.F.; CARVALHO, K.; VASCONCELOS, S. Central Nervous System Activity of Acute Administration of Latex Proteins from Calotropis procera in Mice. Journal of Complementary and Integrative Medicine, 7, p. 1-9, 2010. MELO, F. H. C. et al. Antidepressant-like effect of carvacrol (5-Isopropyl-2-methylphenol) in mice: involvement of dopaminergic system. Fundamental & Clinical Pharmacology, 25, p. 362–367, 2011. RENARD, C.E.; DAILLY, E.; DAVID, D.J.P.; HASCOET, M.; BOURIN, M. Monoamine metabolism changes following the mouse forced swimming test but not the tail suspension test. Fundamental & Clinical Pharmacology. 17, 449–455, 2003. SANTOS, Í. M. de S.; FREITAS, R. L. M. de; SALDANHA, G. B.; TOMÉ, A. da R.; JORDAN, J.; FREITAS, R.M. de. Alterations on monoamines concentration in rat hippocampus produced by lipoic acid. Arq Neuropsiquiatr; v. 68, n. 3, p. 362-366, 2010. VASCONCELOS, G.S.; BARBOSA-FILHO, E.S.; BARBOSA-FILHO, J.M.; VASCONCELOS, S. M. M.; HONÓRIO JÚNIOR, J.E.R .; ABREU, R. N. D. C. Avaliação da hecogenina no controle da peroxidação lipídica no sistema nervoso central de camundongos. In: XXI SPMB (Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil), Paraíba. XXI SPMB, 2010.

140

Artigo 5

Ação da hecogenina, isolada de Agave sisalana Perrine, sobre os parâmetros do estresse

oxidativo no cérebro de camundongos

141

Ação da hecogenina, isolada de Agave sisalana Perrine, sobre os parâmetros do estresse

oxidativo no cérebro de camundongos

Rita Neuma Dantas Cavalcante de Abreua,b, José Maria Barbosa Filhoc, Euclides Sales

Barbosa Filhob, Naiara Coelho Ximenesd, Nicole Brito Cortez Limae, Caren Nádia Soares de

Sousad, José Eduardo Ribeiro Honório Júniord, Danielle Silveira Macêdod, Silvânia Maria

Mendes Vasconcelosd






RESUMO: Objetivou-se estudar os efeitos da hecogenina (HEC), isolada de Agave sisalana

Perrine, sobre os parâmetros do estresse oxidativo no sistema nervoso central (SNC) de

camundongos. Foram utilizados camundongos Swiss, pesando de 25-35g. Os efeitos da

administração aguda de HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg, via intraperitoneal - ip) ou em doses

repetidas por sete dias (20 ou 40 mg/kg, ip) foram avaliados pelos testes: avaliação da

peroxidação lípidica, atividade da catalase e concentração de nitrito. Para isto, as áreas

cerebrais córtex Pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo estriado (CE) foram dissecadas.

Referente aos efeitos da administração aguda da HEC sobre a peroxidação lipídica, observou-

se uma diminuição no CPF, HC e CE em todas as doses, comparado com os grupos controles.

A administração em doses repetidas da HEC (20 ou 40 mg/kg) não causou alterações

relacionadas a peroxidação lipídica no CPF, HC e CE em comparação com os controles. HEC,

administrada agudamente ou em doses repetidas, não causou alterações na atividade da

catalase, nas três áreas cerebrais, em comparação com os controles. Nas duas maiores doses,

HEC causou diminuição na concentração de nitrito no CPF, HC e CE comparado ao controle.

A molécula não causou estresse oxidativo ao SNC, demonstrando neuroproteção relacionada

a diminuição da peroxidação lípidica e concentração de nitrito após a administração aguda.

Palavras-chave: Sistema Nervoso Central; Hecogenina; Antioxidantes.

142

INTRODUÇÃO

A. sisalana, popularmente conhecida como sisal, é uma planta originada do México,

fazendo parte da família Agavaceae. É bem adaptada à região semi-árida do Nordeste do

Brasil (SANTOS et al., 2009). Embora a A. sisalana tenha demonstrado atividades como

antifúngica (PIRES; PURCHIO, 1991), anti-helmíntica (DOMINGUES et al., 2010),

antiinflamatória (DUNDER et al., 2010), antimicrobiana (SANTOS et al., 2009), antitumoral

(CORBIERE et al., 2003), gastroprotetora (CERQUEIRA et al., 2012), inseticida (PIZARRO

et al., 1999; SOUZA, 2009), entre outras propriedades, pouco de sabe sobre seus efeitos em

outros sistemas, como o sistema nervosa central (SNC). No suco das folhas de Agave é

encontrado sapogenina esteroidal. No caso da A. sisalana, as sapogeninas (porção não

glicosídica de uma saponina) encontradas são: a tigogenina, a diosgenina e a hecogenina,

registrando-se maior percentual para esta última (PIZARRO et al., 1999).

Um estudo recente (CERQUEIRA et al., 2012) apresentou a propriedade antioxidante

da hecogenina, isolada de A. sisalana, na gastroproteção em camundongos. Contudo, faltam

estudos para investigação dos efeitos antioxidantes da hecogenina no SNC.

Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ERO) e (ERN) são tradicionalmente

consideradas agentes tóxicos diretos em muitas patologias, como inflamações, doenças

cardiovasculares, neurodegenerativas, câncer e várias doenças de pele (AFANAS'EV, 2010).

ERO são moléculas contendo oxigênio que podem ser classificados como tendo radicais

(elétrons desemparelhados) ou não-radicais, e são conhecidos por serem altamente reativos,

facilmente oxidam moléculas estáveis. Em organismos aeróbios, a produção de ERO é um

processo fisiológico após o uso de oxigênio molecular na fosforilação oxidativa durante o

metabolismo mitocondrial. No entanto, enquanto que a produção moderada destas espécies é

esperada, a produção excessiva de ERO pode representar lesão neurológica grave, oxidando e

danificando alvos biológicos tais como o DNA, lípidos e proteínas, e alterando as principais

vias e sistemas de resposta celular (GOMEZ-PINILLA; NGUYEN, 2012).

As mitocôndrias são o principal local de produção de radicais livres gerando

aproximadamente 2-3 nmol de ânion superóxido O2•–/ min por mg de proteína, e, além disso,

a produção de peróxido de hidrogênio (WOJCIK; BURZYNSKA-PEDZIWIATR;

WOZNIAK, 2010). Mecanismos de defesa antioxidante, como a Glutationa (GSH), catalase,

superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e vitamina E, normalmente,

previnem ou limitam a produção de ERO e os danos aos tecidos (ARMAGAN; KANIT;

YALCIN, 2011).

143

O desequilíbrio entre a produção celular de radicais livres e à capacidade de defesa

antioxidante das células é conhecido como estresse oxidativo (GILGUN-SHERKI et al.,

2002). O cérebro é vulnerável a danos oxidativos, devido à sua relativa falta de enzimas

antioxidantes e a abundância de ambos os substratos oxidáveis e metais de transição

(URÍKOVÁ et al., 2006). Além disso, o SNC tem uma capacidade limitada de regeneração.

Estas características fazem com que o cérebro seja particularmente sensível aos danos

oxidativos (ARMAGAN; KANIT; YALCIN, 2011). No entanto, as áreas do cérebro tais

como o córtex frontal, hipocampo e corpo estriado podem ter uma resposta diferente ao

estresse oxidativo (AHMAD et al., 2012).

De acordo com esse envolvimento do estresse oxidativo em doenças do SNC, os

efeitos neuroprotetores de vários fitoquímicos têm sido associados com a sua capacidade de

reduzir os níveis de estresse oxidativo (SPECIALE et al., 2011). Pesquisas foram realizadas

no campo do neuropsicofarmacologia com compostos extraídos de plantas (HONÓRIO

JUNIOR et al., 2012; LIMA et al., 2012; PEREIRA et al., 2009; SOUSA et al., 2012). Entre

eles, os estudos sobre a ação de Agave sisalana Perrine e alguns de seus constituíntes, tais

como hecogenina, no SNC de camundongos, são destacadas (LIMA et al., 2012).

Objetivou-se avaliar o efeito da hecogenina (HEC), isolada de A. sisalana, sobre

parâmetros de estresse oxidativo em córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC) e corpo

estriado (CE) de camundongos após a administração aguda ou em doses repetidas.

144

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal






















145

Animais




Reagentes e drogas

A Vitamina E (DL = acetato de alfa-tocoferol) foi adquirida do laboratório Teuto,

Brasil e Tween 80 4% de Vetec Química Farm. Ltda (Rio de Janeiro, Brasil).

Protocolo de administração aguda

Os animais foram divididos em 6 grupos, recebendo HEC via ip nas doses de 5, 10,

20 ou 40 mg/kg; animais controle receberam Tween 80 4% ou vitamina E (400 mg/kg) pela

mesma via. Após 30 minutos de administração, os animais foram sacrificados e as áreas do

cérebro como CPF, HC e CE isoladas e homogeneizadas para avaliação da peroxidação

lípídica, atividade da catalase e determinação de Nitrito/Nitrato.

Administração em doses repetidas

Os animais foram assim agrupados: Controle – Tween 80 4 %; HEC 20 ou HEC 40

mg/kg. Cada grupo de animais foi tratado diariamente durante um período de 7 dias. Todas

as administrações foram realizadas por via ip. No sétimo dia de tratamento, após 30 minutos

da administração dos compostos citados, os animais foram sacrificados e as áreas do cérebro

(CPF, HC e CE) isoladas e homogeneizadas.

Avaliação da peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica foi analisada determinando-se a concentração de

malonildialdeído (MDA), uma das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), em

homogenatos (HUONG et al., 1998). Resumidamente, as amostras foram misturadas com

tampão fosfato 50 mM de potássio (pH 7,4), e 63 µL de homogenato foram misturados com

100 µL de ácido perclórico a 35%. As amostras foram então centrifugadas (3,350 g/10 min) e

150 µL dos sobrenadantes foram recuperados e misturada com 50 µL de ácido tiobarbitúrico a

1,2%. A mistura foi, então, colocada em banho de água e aquecida por 30 minutos em 95-

146

100°C. Depois que a solução foi resfriada, a absorbância foi medida em comprimento de onda

de 532 nm e os resultados expressos como µmol MDA/g de tecido.

Avaliação da atividade da catalase

A atividade da enzima catalase foi medida por meio do método que emprega a geração

H2O e O2 a partir do peróxido de hidrogênio (MAEHLY; CHANCE, 1954). A atividade da

enzima foi medida pelo grau desta reação. Uma alíquota das amostras (20 µl) foi adicionada a

980 µl de meio reativo (H2O2 15%, Tampão Tris-HCl 1 M; EDTA 5 mM pH 8,0; H2O Milli-

Q). As absorbâncias inicial e final foram gravadas a 230 nm após o 1º e 6º minuto,

respectivamente. Uma curva padrão foi estabelecida utilizando catalase pura (Sigma, MO,

USA) sob condições idênticas. Todas as amostras foram diluídas com 0,1 mmol/l de tampão

fosfato (pH 7.0) para provocar 50% de inibição da taxa de diluente. Os resultados foram

expressos em µM/min/µg de proteína.

Determinação de Nitrito/Nitrato

A concentração de nitrito foi determinada nos cérebros dos camundongos

homogeneizados imediatamente após a decapitação em todos os grupos. Após centrifugação

(800×g/10 min), o sobrenadante do homogenato foi coletado e a produção de Óxido Nítrico

(NO) foi determinada com base na reação Griess 50 (GREEN; TANNENBAUM;

GOLDMAN, 1981). Para tanto, 100µL do sobrenadante foi incubado com 100µL do reagente

de Griess (sulfanilamine em 1% H3PO4/0.1% N-(1-naftil) etilenodiamina-dicloridrato / 1%

H3PO4 / água destilada, 1:1:1:1) em temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi

medida em leitor de microplaca a 550nm. A curva padrão foi preparada com várias

concentrações de NaNO2 (variando de 0,75-100 µM) e os resultados expressos em µmol/g de

tecido.

Análise Estatística






147

RESULTADOS

Peroxidação Lipídica

A Tabela 1 mostra os efeitos da administração aguda (5, 10, 20 ou 40 mg/kg) ou em

doses repetidas (20 ou 40 mg/kg) da HEC sobre os níveis de TBARS (µmol MDA/g de

tecido) no córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado de camundongos. Também foi

demonstrado o efeito da vitamina E (400 mg/kg) como controle positivo.

No CPF, HC e CE, uma diminuição na concentração de malonildialdeído (MDA) foi

observada após o tratamento agudo com HEC, em todas as doses, quando comparado com os

grupos controles das três áreas cerebrais. A administração aguda de vitamina E diminuiu a

concentração de MDA nas três áreas cerebrais, em comparação com os controles.

No entanto, a administração em doses repetidas da HEC (20 ou 40 mg/kg), não causou

alterações significativas relacionadas a concentração de MDA no CPF, HC e CE em

comparação aos controles.

Tabela 1 Peroxidação Lipídica no CPF, HC e CE de camundongos tratados com hecogenina.

Grupo (mg/kg) CPF HC CE

Agudo

Controle 34,46±5,02 39,82±3,58 44,57±4,86

HEC 5 18,58±3,98a 25,13±2,80a 29,25±4,41a

HEC 10 14,23±1,84a 19,68±1,91a 15,26±1,96a

HEC 20 15,11±1,69a 17,21±2,21a 13,47±2,99a,b

HEC 40 9,94±1,91a 14,03±2,42a,b 9,32±2,63a,b

Vit E 19,24±2,39a 12,50±2,14a 12,22±2,01a

Doses Repetidas

Controle 163,9±6,95 139,6±5,94 128,6±5,17

HEC 20 135,9±13,98 150,4±8,36 137,0±10,54

HEC 40 147,7±10,10 155,5±7,00 166,2±12,65

Valores representam média±EPM; n = 5-12 animais por grupo. Administração aguda: Camundongos tratados com HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/kg); Controles: Tween 80 4% ou Vitamina E. Administração em doses repetidas: Camundongos tratados por 7 dias com HEC (20 ou 40 mg/Kg); Controle: Tween 80 4%. acomparado com controle; bcomparado com HEC 5. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

148

Atividade da Catalase

Conforme apresentado na Tabela 2, HEC, administrada agudamente ou em doses

repetidas, não causou alterações significativas na atividade da catalase (µM/min/µg proteína)

nas três áreas cerebrais estudadas em comparação com os controles. Por outro lado, a

administração aguda de vitamina E causou uma diminuição na atividade da catalase no CPF,

HC e CE em relação aos grupos controles.

Tabela 2 Atividade da Catalase (µM/min/µg proteína) no CPF, HC e CE de camundongos tratados com

hecogenina.


Agudo

Controle 4,16±0,53 4,58±0,34 4,64±0,54

HEC 5 3,65±0,18 4,21±0,45 4,01±0,38

HEC 10 3,40±0,30 4,03±0,32 4,29±0,25

HEC 20 4,80±1,04 4,65±0,58 6,14±0,59

HEC 40 4,52±0,92 2,87±0,49 3,33±0,46b

Vit E 1,30±0,11a 1,44±0,18a 1,20±0,09a

Doses Repetidas

Controle 3,08±0,36 5,31±1,10 5,21±0,75

HEC 20 6,05±1,10 5,44±1,32 7,31±0,96

HEC 40 4,70±0,78 3,45±0,44 4,34±0,40

Valores representam média±EPM; n = 4-12 animais por grupo. Administração aguda: Camundongos tratados com HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/Kg); Controles: Tween 80 4% ou Vitamina E. Administração em doses repetidas: Camundongos tratados por 7 dias com HEC (20 ou 40 mg/Kg); Controle: Tween 80 4%. acomparado com controle; bcomparado com HEC 20. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

149

Concentração de Nitrito

A administração aguda da HEC diminuiu a concentração de nitrito (µmol/g tecido) no

CPF, em todas as doses estudadas (5, 10, 20 ou 40 mg/kg), comparada ao grupo controle. Nas

doses de 20 ou 40 mg/kg, HEC, administrada agudamente ou em doses repetidas, causou

diminuição na concentração de nitrito no CPF, HC e CE em relação aos grupos controles. O

uso agudo de vitamina E, usada como controle positivo, diminuiu a concentração de nitrito

nas três áreas cerebrais estudadas quando comparado aos controles.

Tabela 3 Concentração de nitrito no CPF, HC e CE de camundongos com a administração de hecogenina.


Agudo

Controle 10,65±1,92 5,01±0,43 9,03±1,58

HEC 5 6,28±0,82a 4,97±0,37 6,42±1,05

HEC 10 5,44±0,61a 5,73±0,64 5,26±0,49

HEC 20 2,42±0,24a 2,54±0,28a,b,c 2,22±0,32a

HEC 40 2,45±0,35a 2,79±0,34a,b,c 1,75±0,24a

Vit E 1,73±0,15a 1,46±0,13a 1,26±0,09a

Doses Repetidas

Controle 5,40±1,06 4,63±1,08 6,89±1,91

HEC 20 2,14±0,22a 1,65±0,28a 2,03±0,35a

HEC 40 1,57±0,18a 1,65±0,20a 1,71±0,28a

Valores representam média±EPM; n = 6-12 animais por grupo. Administração aguda: Camundongos tratados com HEC (5, 10, 20 ou 40 mg/Kg); Controles: Tween 80 4% ou Vitamina E. Administração em doses repetidas: Camundongos tratados por 7 dias com HEC (20 ou 40 mg/Kg); Controle: Tween 80 4%. acomparado com controle; bcomparado com HEC 5; ccomparado com HEC 10. Para todas as análises, p<0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida por Tukey como teste post hoc).

150

DISCUSSÃO

As plantas produzem muitos efeitos antioxidantes para controlar o estresse oxidativo

causado pela luz solar e oxigênio, o que pode representar fontes de novos compostos com

atividade antioxidante (CHUAN-SUNG et al., 2009; URÍKOVÁ et al., 2006). Existem poucos

estudos sobre Agave sisalana Perrine relacionados a ação dos seus constituíntes como a

hecogenina no SNC. Assim, o presente estudo demonstra as ações de hecogenina sobre

parâmetros de estresse oxidativo em áreas cerebrais.

A elevada concentração de lípidos insaturados no cérebro e o metabolismo aeróbio

neste órgão, torna este tecido mais susceptível ao dano peroxidativo (ZERVOS et al., 2011).

Os hidroperóxidos são os produtos estáveis formados durante a peroxidação de lipídios

insaturados, como ácidos graxos e colesterol. O método TBARS é um dos mais utilizados

para estudos de peroxidação lipídica, e é baseado na reação do malondialdeído (MDA), um

produto final da oxidação dos lipídios, com o ácido tiobarbitúrico (ANDRADE JÚNIOR et

al., 2005). MDA foi, portanto, medido no presente estudo para avaliar indiretamente o

conteúdo de ERO.

Os nossos resultados mostraram que o tratamento agudo com HEC (5, 10, 20 ou 40

mg/kg), uma sapogenina esteroidal, pode contribuir para uma ação protetora ao SNC, devido

a uma diminuição da peroxidação lipídica nas três áreas do cérebro investigadas (CPF, HC e

CE).

Um estudo recente (CERQUEIRA et al., 2012) demonstrou que HEC, isolada a partir

de Agave sisalana, apresenta uma propriedade antioxidante tal como avaliado pela diminuição

da peroxidação lipídica no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol e indometacina.

Resultados de estudos confirmam a ação protetora de saponinas esteroidais no SNC

(CHUAN-SUNG et al., 2009; JADHAVA et al., 2013; TOHDA et al., 2012). Assim, referente

aos efeitos de sapogeninas esteroidais no SNC, um estudo demonstrou que o tratamento com

diosgenina exibiu melhora no desempenho da memória de reconhecimento de objetos em

modelos animais da doença de Alzheimer. Neste mesmo estudo com diosgenina, o tratamento

com a molécula reduziu significativamente placas amilóides e emaranhados neurofibrilares no

córtex cerebral e hipocampo (TOHDA et al., 2012).

Os efeitos neuroprotetores relacionados a diminuição da peroxidação lipídica de

compostos antioxidantes como o α-tocoferol (vitamina E) foram documentados em outros

estudos (MACÊDO et al., 2010; SAMPAIO, 2011). O grupo –OH fenólico do α-tocoferol

rapidamente sequestra radicais LOO•, resultando na formação de radicais tocoferil, os quais

têm uma capacidade muito menor de propagar a peroxidação lipídica (BARBOSA;

MEDEIROS; AUGUSTO, 2006).

151

Esperava-se que a administração em doses repetidas de HEC causasse também

neuroproteção. No entanto, não foi observada alteração na peroxidação lipídica nas três áreas

cerebrais. Ressalta-se que apesar da HEC, administrada em doses repetidas, não ter causado

proteção ao SNC, este tratamento não gerou estresse oxidativo. Sabe-se que os efeitos

neuroprotetores de vários fitoquímicos têm sido associados com a sua capacidade para reduzir

os níveis de estresse oxidativo. No entanto, a relação de resposta para muitos fitoquímicos

argumenta contra um mecanismo de ação antioxidante exclusivo, sugerindo vez que eles

podem estimular uma resposta adaptativa (SPECIALE et al., 2011).

Uma elevação na formação de radicais livres pode ser acompanhada por um aumento

compensatório imediato nas atividades das enzimas de eliminação de radicais livres

(BARROS et al., 2007). Catalase, uma enzima localizada em peroxissomas, catalisa a

conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular (WOJCIK;

BURZYNSKA-PEDZIWIATR; WOZNIAK, 2010). Estudos têm demonstrado que as drogas

pró-oxidantes causam um aumento na atividade da catalase (SILVA et al., 2010). Outros

dados da literatura têm mostrado que a administração de vitamina E foi capaz de inverter o

aumento da atividade da catalase com o uso de cetamina, uma droga pró-oxidante

(SAMPAIO, 2011).

No nosso estudo, a ausência de alterações significativas na atividade de catalase, nas

três áreas estudadas, após o tratamento com HEC, indica que não houve necessidade de

ativação dessa enzima, visto que a molécula em estudo não gerou estresse ao SNC.

O óxido nítrico (NO•) é um radical pouco reativo, essencial para a vasorregulação e

neurotransmissão, formado pelas enzimas NO sintases (NOS). Em excesso, NO• pode inibir a

citocromo oxidase, levando ao aumento de vazamento de elétrons e formação de superóxido

(O2•-). NO• pode reagir com O2

•- formando peroxinitrito (ONOO-). A geração de peroxinitrito

in vivo pode levar à oxidação e nitração de lipídios, DNA e proteínas (BARBOSA;

MEDEIROS; AUGUSTO, 2006). No cérebro, o NO é produzido pela NOS neuronal

(SALUM; PEREIRA; GUIMARAES, 2008). Também a eNOS e a iNOS estão presentes e são

importantes nas funções fisiológicas e estão envolvidas em várias patologias do SNC

(FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2000).

O hipocampo é uma das áreas de pesquisa mais promissoras da ação do NO no SNC

(FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2000). Apesar dos neurônios que contêm NOS

representarem apenas 1% das células neuroniais, a ramificação de seus axônios é tão extensa

que parece atingir a grande maioria das células cerebrais (SALUM; PEREIRA;

GUIMARAES, 2008).

152

No presente estudo, a administração de HEC (20 ou 40 mg/kg) foi capaz de reduzir a

concentração de nitrito no CPF, HC e CE. Em outro estudo com HEC, a dose de 90 mg/kg foi

utilizado para estudar a sua atividade gastroprotetora, revelando que a molécula reduziu

significativamente os níveis de nitrito, no modelo de lesão gástrica induzida por etanol

(CERQUEIRA et al., 2012). Na medida em que a determinação de nitrito no cérebro está em

questão, os estudos (MACÊDO et al., 2010; SANTOS et al, 2011; SAMPAIO, 2011)

confirmam que as substâncias anti-oxidantes como a vitamina E causam uma diminuição dos

níveis de nitrito.

Em conclusão, hecogenina não causou estresse oxidativo nas áreas cerebrais estudadas

e sugeriu ação neuroprotetora aguda sobre à peroxidação lipídica. Hecogenina, principalmente

nas maiores doses, causou diminuição na concentração de nitrito, sugerindo que a molécula

em estudo poderia reduzir alguns efeitos deletérios do NO ao SNC.

153

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6 CONCLUSÕES GERAIS

O estudo dos efeitos da administração da hecogenina em vários modelos

comportamentais e sobre as alterações neuroquímicas permitiu as seguintes conclusões:

• A hecogenina apresentou potencial ansiolítico com a vantagem de produzir menos

sedação que o diazepam, conforme evidenciado no modelo do campo aberto;

• Indicou efeito ansiolítico nos modelos de placa perfurada e labirinto em cruz elevado;

• O efeito ansiolítico da hecogenina não parece envolver a participação dos receptores

GABAérgicos;

• No modelo de suspensão de cauda, hecogenina apresentou efeito antidepressivo, que

foi confirmado com a determinação da concentração de monoaminas no corpo

estriado, supostamente envolvidas neste efeito;

• Por meio da dosagem da concentração dos aminoácidos no CPF, HC e CE, após a

administração aguda de HEC, foi possível concluir que a HEC, nas maiores doses, age

no SNC aumentando GLU que tem um efeito modulatório sobre ASP, GLI e TAU;

• Hecogenina não causou estresse oxidativo nas áreas cerebrais estudadas e demonstrou

ação neuroprotetora aguda sobre à peroxidação lipídica e, nas maiores doses, causou

diminuição na concentração de nitrito, sugerindo que a molécula em estudo poderia

reduzir alguns efeitos deletérios do NO ao SNC.

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