Ricerche sul metabolismo degli acidi grassi : comportamento dei lipidi epatici di ratto trattato

con acido w•metilpantotenico.

Nota D - Analisi gas-cromatografica delle frazioni lipidiche

ALBERTO FIDANZA (•). Gumo CA V IN A, GABRIELLA MORETII e ALBERTO MOLLICA

Laboratori di Biologia

(l

Riassunto. - A completamento di precedenti ricerche si riportano i risultati dello studio delle frazioni lipidiche ottenute dai lipidi totali di fe­gato di ratto, trattato con dieta carente di acido pantotenico e addizionata di acido w-metilpantotenico.

Il frazionamento è stato eseguito mediante cromatografia su strato sottile; le frazioni ottenute, fosfolipidi, di- e tri-gliceridi, colesterolo libero ed esterificato, sono st ate analizzate quantitativamente con metodi colo­rimetrici e gli acidi grassi liberi per microtit olazione.

Gli acidi grassi delle frazioni fosfolipidi, trigliceridi ed esteri del cole­sterolo sono stati studiati mediante analisi gas-cromatografica. Le varia­zioni più intetessanti nella composizione percentuale degli acidi grassi si sono avute per la frazione fosfolipidi: è stato osservato un aumento per gli acidi palmitico e linoleico e una diminu zione per gli acidi stearico e arachi­donico. Questo conferma quanto t rovato dagli AA. in precedenti ricerche: nella carenza di acido pantotenico le modificazioni della composizione degli acidi grassi dei lipidi epatici, in particolare dei fosfolipidi, rispecchiano una diminuzione dei processi di allungamento e di insaturazione delle catene carboniose.

Summary. (R esearches on .fatty acid metabolism: observations on liver lipids of pantothenic acid deficiem rats treated with w-methylpantothenic acid. II · Gas-chromatosraphic analysis of.lipid f ractions). - Following upon pre· vious experiments (FIDANZA, CoNSTABLE & WILSON, 1964; FIDANZA et al.,

(•) Istituto di Fisiologia Generale dell'Univer!itll, Roma. ·

Antl. Isl. Super. Sanità (1967 ) 3, 157-16i .

.... .

158 ESPER IF.N7.E F. RICERCH E

1966), tbc lipid fractions havc heen studietl in liver uf rats feti with panlo­thenic acid deficient diet, supplcmentcd with w-methylpantodwnic acid .

Of two groups of 30 animals, the former was fed with the special Jict, thf latter with a contro! dict, using the pair feeding tccbniqul' .

After 25-30 days' trc,atmcnt, thc animals wcre kcpt without food for 12 hours and then killcd, thcir livers were remuved and total li ver lipid;; cxtracted with the chloroform-mcthanol procedure of FoLCI-I, LEES & SLOANE-STANLEY (1957).

Thc separation of thc variuus lipid componenls was accomplished bv thin-layer chromatography on sili.ca gel G, solvent system hexanc (h.p . 65°C), ethyl ether, acetic acid 70:30: l.

Colorimetric determinations of cholestcrul, di- and tri-glyccridcs, phu­spholipids and a microtitulation of thf free fatty acids werc pPrformed on tbc cluatcs from the TLC platcs. The fatty acid methyl esters werc obtained by means of tbc mcthod of STOFFEL, Cnu & AHRENS (1959) applicd to ali­quots of phospholipids, triglycerides and cholesterol esters, and the gas­chromatographic analysis was thus donc .

A significant lowcring of thc totallipids, causcd by lowcring of tbc trigly­ccridc fraction (T a h le 2), was ohtaincd (42.4 7 ± l.ll mg/g fresh tissuc instcad of 52.73 ± 2.84); concerning thc fatty acids, a significant increasc of palmitic and linoleic acids and a significant decrease of stearic and arachidonic acids werc ohscrved, mainly in the phospholipid fraction (Table 3). This finding might represcnt a reduced activity of tbc m ctabolic processes involvcd in tbc transformation of palmi tic into stearic aci d and of linoleic into arachidonic acid (fatty acid chain elongation and fatty acid chain unsaturation) .

In nostre precedenti ricerche (FIDANZA, CoNSTABLE & \VILSON, 1964: FIDANZA et al., 1966), è stato osservato che nel ratto carente di a cido panto­tenico si verificano modificazioni significati~ della distribuzione degli acidi grassi c dci lipidi epatici e plasmatici, giungendo alla conclusione che l'acido pantotenico è importante per il mantenimento della normale distribuzione degli acidi grassi nei li p idi del fegato e del plasma.

Lo studio dell'influenza dell' acido pantotcnico sui processi di biosintesi degli acidi grassi nel ratto in vivo è reso complesso dal fatto che l' acido panto­tenico, sotto forma di coenzima A, è indispensabile per la generalità dci pro­cessi di anabòlismo e di catabolismo degli acidi grassi.

Abbiamo pertanto stabilito di sottoporre allo studio gruppi di animali alimentati con dieta contenente il 10 % di lipidi, sotto forma di olio di mais, allo scopo di osservare le possibili influenze dell'acido pantotenico sui pro­cessi di allungamento della catena carboniosa degli acidi grassi (HANAHAN & DITTMER, 1960; LYNEN, 1961; WAKIL, 1961) c su quelli di formazione degli

Ann. l sl. Super. Sanitò. ( I\Hi7 ) 3 , l57·1fi•l.

FIDANZA, CAVINA, MORETI'l E MOLLICA 159

acidi grassi polinsaturi, che, come è noto (MEAD, 1961; KLENX, 1961; STEIN­BERG et al., 1956), sembrano avvenire per _successive insaturazioni ed allun­gamenti.

PARTE SPERIMENTALE.

Le esperienze sono state eseguit~ su 60 ratti albini maschi di ceppo Sprague Dawley, allo svezzamento. Gli animali sono stati divisi in due gruppi di 30 animaJi ciascuno : a· primo gruppo è stato alimentato con una dieta semisintetica carente di acido pantotenico, addizionata dello 0,1 % di acido w-metilpantotenico. t noto che la somministrazione di questa sostanza pro· voca una tipica sindrome carenziale pantoteniéa nell'uomo e nell'animale da esperimento (BEAN & HooCES, 1954; PuoELXEVICS &" RooERUX; 1960). Il secondo gruppo di animali è stato pair fed rispetto al primo èon una dieta semisintetica completa. La composizione della dieta, riportata nella Tab. l~ è identica a quella già usata in JlOStre precedenti ricerche (FIDANZA, CoN-

TABELLA l.

Compoalzlone delle diete

l Dieta A

l Dieta B

Ingredienti (r .. tti pair l~ (ratti carenti)

% %

l Cll!leina devitaminizzala 18 18

Saccarosio 62,8 62,7

Olio di mais • - 10 10

Cistina . 0,2 0,2

1\liacela salina (Osbome e Mendel) 4 4

Miacela vitaminica : - . a) completa •• 5 -b) priva di acido pantotenico - 5

Acido w-metilpantotenico - 0,1

• La composizione in acidi grllllsi dell'olio di mais è la seguente: Acidi grll!lsi (No di atomi di C : No dei doppi legami)

16:0 18:0 18:1 18:2 20:0 20:1 + 18:3 % (Espressa come percentuale degli acidi grll!lsi totali)

12,2 3,1 31,5 50,8 0,9 1,5

• • La miscela vitaminica completa contiene le seguenti vitamine per 100 g di dieta : tiamina cloridrato mg l; riboflavina mg 2; piridosaina cloridrato mg l ; calcio pantotenato mg 4; acido p-amminobellJloico mg IO; nicotinammide mg IO; inositolo mg 10;. acido folico mg 0,2 ; biotina mg 0,12 ; vit. B11 mg 0,005 ; acido ascorbico mg lO ; menad.ione sodio bisolfito mg l ; oc-tocoferolo acetato mg 5; colina cloridrato mg 200 ; vit. A U. I. 1000; vit. D1 U. I. 100; lllCcarosio q. b. a 5 g.

Ann. Isl. S uper. Sanil<l (1967 ) 3, 157- 164..

J fltl E~PERIENZ" F. IIICE ilC IH.

STABLE & WJ LSON, 1964 ; FIDANZ ,\ el al., l 96h). 11 tra ttanw nlu 8i t' ~" ' o li o

per circa 30 gio rni durant!' i quali è s ta ta st·guita la c11n·a d i accre!:'Cimt·nto pondcralt• ed è st a to riiPvat o il consumo d t·lla dieta, che II Pi p rim i JH•riodi è st ato d i 6-7 g al giorno p t>r singolo animai•· t'successivamente di circa 3-4 1:!· Quando i r atti t Pn ut i a di Pta carente addizionata con a cido (ù·metilpan tu­tem ico m ostravan o i caratteristi ci segni dell'a vitam inosi P le cun T di crt•scita presentavano il tipico andamento d isce;ndt·n te, gli animali d igiuni da 12 or •· son o stati sacrificati e sui ft·gati , rapida mente prelevati , sono stat e t•srgui t t· le analisi in programma ; qut•stt• sono state· eseguite su gli organi provenienti da due animali riuniti in pool.

I lipid i epatici sono stati estratti con il nwtodo di FoJ,c ll , Ln:s & IJOANE­STA NLEY (1957) (cloroformio-meta nolo 2: l, omogcnizzazione iu Blendor per 5') f' det erminati gravimet ricamt-ntt·. La cictcrminazion e delle frazion i lipidiche e le analisi gas-cromatogra f-i che degli est eri metil ici deg li acid i grassi son o st a t e est·guitc applicando una mt•todica da noi p recedcntemcnt•· studiata (CAVINA el al., 1965), basata su una scparazion t• crom atogra fica su strato sottil<·, che consente di analizza re quantità di 3-30 mg circa di lipid i, secondo la composizione·. La cromatografia è sta ta est:guita su last re di silica gel G Merck di 20 X 20 cm , di spessori' 0 ,5 mm usando come sol vente P-sano ­etere etilico - acido acetico 70:30: 1 ; la ri vclaziotw veni va ottenuta spru z­zando la lastra con una soluzione d i diclorofluorcsccina a llo 0,2 % in eta nolo. Sugli cluati del cromatogramma è st a t a (~seguita la dt•terminazionl' colori­m etrica del colest erolo c dei suoi est eri (HANEL & DAM , 1965) , dei tri- t' di­gliceridi (V AN HAN DEL & Zu .vERSMITH, 1957; V AN H AN DEL, l 961 ), dei fosfo ­lipidi (BARTLETT, 1959, modi fica to da MARI NETTI, 1962); gli acidi grassi liberi sono stati dosati pt!T microtitolazione (DOLE, l 956).

La composizionr p ercentu a l1· degli acidi grassi deJI,. principali frazioni separate per cromatogra fia su st r a to sottile è st ata determinata per ana lisi gas-cromatografica degli est eri metilici, preparati secondo STOFFEL, Cu u & AnRENS (1959), eseguendo due analisi almeno per cam pione . La prc•cision1· e l ' accuratezza del m etodo sono state verificat e in pr<·cedenza con misccl•· di est eri m etilici d i a cidi grassi sta ndard. Sono stati impiegati pt>r l'an alisi gas-cromat ogr afica : dictilenglicol succinato poli t•st cre (DEGS) come fase stazionaria al 20 % su Chromosorb W silanizzato 60-80 m t>sh ; colonna di acciaio da l /8.' di diametro, lunga 2 metri ; gas d i trasporto azoto con porta ta di 30 ml al minuto; t emperatura della colonna 190° C ; r ivela tore a ionizza­ziom· cl i fiamma.

RIS l iLTATI

I dat i della T ab. 2 riassumono <' completano ' ! li l'Ili pn ct·rl l'ntenwn te· pubblicati (FIDANZA et al., 1966) . . Essi m ettono in t>videnza ch 1• nei r atti carenti si osser va una d iminuzione significat iva dei lipidi to ta li ch t• da 52,73

A 11 11 . IRI. l:; ttpr l' . l:;uuilù (lllfi7) 3 , 15 i· llil.

FIDA l.A, CAVINA, MORETT1 E )IQI,LICA 16 1

f ABf. LLA 2.

Costituenti del llpldl epatici In mg per g di tessuto fresco; In parentesi l valori percentuali.

Le medie e le rispettive deviazioni s tandard sono state calcolate su 6 • pool "·

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Lipicli totali . l 52 . n 2, 84 r ~5 .47 - 1, 11° 0

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Trigli!'eridi

Di~~:lireridi .

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Co lest e rolo esterificato 1 o, ~6 - 0 ,24 (0,87 o, ~3) l 11,30 .t. 11,05 (O, 65 • O. 12)

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mg (H' r grammo 1li tPssuto frl'sco scl'n tlono a 45,47 mg ; l' analisi delle frazioni

lipidiche mostra cij.- IJUt'SLa diminuzione avvit•ne principalmt"nte a carico clPlla frazione trigliceridi, che da 6,67 scendP a 2,55 mgfg, mentre le altn· frazioni rt•stano praticamt•nte invariate . La climinu:r.iont! del contl'nuto asso ­

luto in trigli cl'ridi si accompagna ad una diminuzione significativa dd conte­nuto pPrcentuale di questa fraziont>, mentre il contenuto percentuali' in fosfo­lipicli r in co iPstf'r olo librro aumenta significativamente.

Pl'r quanto riguarda i rligljcNicli, gli c•strri riPI co les terolo-" gli acidi grassi liberi , che nrl loro insit>me rappresentano poco più dell ' l % Ùf'i lipidi <' patit>i , è c·videntP cht> l' assenza rli significative difft>rJ•nzf' fra i due gruppi eli ratti può l'ssrre attribuita a lla d iscrt•ta vari abilità dc>i risultati ottenuti nel clo­

sa~giu tli fJ1H'SLr frazio ni minori .

La composizione percentuale in acidi gra si de lle varie frazioni lipidicht· è riportata nt>lla Tab. 3. Nf'i ratti carenti, la t~omposizione ddla fraziont• dt•i

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f' lDANZA, CAVINA, MORETTI E MOLLICA 163

fosfolipidi, ove prevalgono i lipidi polinsatrui, è carattprizzata da un aumento dell'acido palmitico (16: 0), da una diminuzione dell' acido stcarico (18:0), da un aumento dell'acido linoleioo (18: 2) e da una diminuzione dell'acido arachidonico (20 :4); tali modificazioni sono tutte statisticamente significative. Nella composizione percentuale dei trigliceridi e degli esteri del colesterolo prevalgono l'acido palmitico e l'acido oleico (18: 1), mentre l'acido stearico è presente in modeste quantità: nei ratti carenti non si osserva pertanto la diminuzione della concentrazione in acido stearico c l'aumento in acido pal­mitico, mentre è significativo l'accumulo di acido linoleico, che è l'acido grasso introdotto in maggiore quantità con la dieta (Tab. 1).

CONCLUSIONI

~ interessante il confronto fra t.dati qui riferiti e quelli precedentemente ottenuti in uno studio sulla composizione percentuale in acidi grassi dei li­pidi totali di ratti normali e di ratti carenti in acido pantotenico (FIDANZA

et al., 1966). In questi ultimi si era osservato un aumento significativo di acido palmitico, una diminuzione significativa dell'acido stearico e un aumento, pure significativo, dell'acido linoleico; l'acido arachidonico viceversa pre­sentava una lieve e non significativa diminuzione. Le presenti osservazioni sulla composizione in acidi grassi dei fosfolipidi confermano questi dati c li completano in quanto mettono in evidenza una significativa diminuzione di acido aracb.idonico. Nel loro insieme questi dati sostengono quanto è stato precedentemente osservato (FIDANZA, CoNSTABLE & WtLSON, 1964) ed in­dicano che, nei ratti carenti, la conversione dell'acido palmitico in stearico c drll'acido linoleico in arachidonico è ridotta. In effetti, questa dimi­nuita con versione risulta evidente dal rapporto C1 to : t/~o:4 , che nei ratti Ji controllo è di 0,64 mentre aumenta a 0,87 nei ratti carenti (FIDANZA

et al., 1966).

Tenendo conto che la condizione studiata nelle nostre esperienze è !ltata la carenza di acido pantotenico, ed essendo da tempo note le relazioni lra acido pantotenico, coenzima A e metabolismo dei lipidi, si può concludere che que ta condizione, ottenuta anche con la somministrazione dell'anti­metabolita acido w-metilpantotenico, produce significative modificazioni della composizione degli acidi grassi dei lipidi epatici che rispecchiano una diminuzione dei processi di allungamento c di insaturazione delle catene carboniose. Questa ricerca è stata limitata ai lipidi epatici: ricerche più ampie potranno prendere in considerazione il bilancio tra introduzione, djstri­buzione cd escrezione dci lipidi. Degna di nota è l'osservazione qui fatta che

fosfolipidi sono quelli che più estesamente vengono modificati.

29 novembre 1966.

· ""' · 161. Supu. Sanilt~ (1967) 3, 15 7· 164 .

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Il coefficiente di estinzione millimolare della cianometemoglobina di Rana esculenta e di Axolotl messicano

ANNA M. SALVATI, LEONARDO TENTORI e GIROLAMO VIVALDJ

Laboratori tli Biologia

Riassunto. - · Allo scopo di raggiungere una maggiore uniformità nei risultati delle analisi ematologiche e>e di avere la possibiJità di paragonarli suJ piano internazionale, la Società Europea di Ematologia ha fondato lo lntcrnational Committee for Standardization in H ematology {l.C.S.H.). In particolare per quello che riguarda il dosaggio della emoglobina, lo I.C.S.H. ha deciso di raccomandare l'adozione del metodo spettrofotometrico della cianometemoglobina e dopo un'ampia discussione svoltasi nel corso di tre

successivi simposi ha proposto di adottare il valore di e:~~ = 44,0 quale

coefficiente di es tir.zione millimolare della cianometemoglobina umana a ).. = 540 miJ.. Gli AA. hanno partecipato alla discussione con due precedenti lavori confermando sperimentalmente il dato sia con il metodo della de­terminazione del ferro, sia con il metodo della det erminazione dell'azoto in soluzioni di cianometemoglobina umana purificate mediante cromatografia su carbossimetil cellulosa .

Nel presente lavoro è stato determinato per mezzo dell'analisi del con· tenuto di ferro l' analogo coefficiente di estinzione millimolare a À = 540 miJ. per la cianometemoglobina di rana (Rana esculenta L.) e di Axolotl messi· cano (Ambystoma tigrinum nella fase neotcnica) anche esse purificat e per cromatografia su carbossimetil cellulosa.

I risultati ottenuti sono stati paragonati fra loro e con i dati relativi alla cianometemoglobina umana dedotti dai precedenti lavori applicando il t es t << t n di Student per la valutazione della significatività della differenza fra due medie.

Con questo metodo è stato possibile dimostrare che non esistono diffe­renze significative fra i coefficienti di estinzione millimolare a À = 540 miJ. delle emoglobine umane, di rana e di Axolotl, come era teoricamente pre· vedibile dato che l' assorbimento a 540 miJ. è dovuto all'eme che è identico in tutte le emoglobine conosciute. Pertanto è lecito usare il valore Ji

. lnn. l sl . Super. Sanità (1967) 3. 165- 174.

~SI'ERIE:'IIZE ~; HI C:E HI: II I

m M ~ 540 44,0 fWr la dc•tt·rminaziont· SfH'ltrofotomt'lrica dt•llc· emo~luLinc d i

r ana c· di Axolot l.

Summary. (/)etermination of tht• mil/imola r extinetion coejjiciPIII uf

ltnniglobin c_yanidP oj .Hana I'Scttl l'nta and oj Axolotl mexicanum) . - Thc· E uro pc•an Soci1·ty of Hcmatol ogy ha s founded tht· International Cornmittt·t· l'or Standardization in H t> rnatology (J.C.S.H .) in ordc•r to achit-H intl'rna­tional comparability of rt'sults of h1·matologica l analyH·s.

111 particular with rt'~ pt·ct tu ht·moglohin dt'tl'rmina ti o n tht· aLo' t' mcntioii«>Ù cummitlet• bus rlecid t•tl lo n ·emnmc·nfl thc· ~ ~~~·ctrophntumPtri c

lwmigloLineyanidt • mt·thod. In tht· courst· of thrt' t' scic>ntifif• Symposia on hemoglobinometry held

in Lishon (1963), S tock.holm (1964), and Strasburg (1965), an l'xha us tiH· tliscussion took plac(' 0 11 thl' millimolar cxtin ction codfieit·nt of human

lu•mi~lubineyanidt• . A1>- a Tl'Sult tbc· I.C.S.H. has propost·Ò tlw fig ure· ~ ~~ =

= 44 .0 as tht• millimolar c•xtinctiun codficient of human hc·migloLineyanidt• a t À = 540 m p .. T hl' con t rihu ti o n of t ht· Au thors to tht· discussion has !t-ti to thl' puhlication of twu prt·vious papt'rS in whieh tht· valut· propost•Ù bas lwt'll confirmeù eitlwr h y iron or nitrogcn dt•t t•rminatio n in sulution!' of humatl hemi~luhirwyanidt• a ftt•r purifit:atiun of tltt• t·rnoprotl'in hy l'a rlwxy­Ult'thyl cellulost· duomatogravhy.

The pn·sc·nt pap1•r rcpurts thc dt'lt·rrninatiun uf th t· millirnular t'Xtinction codfi cit·nl at À - 540 ffi !J. performt•d by mt>am; of iron oontt•nt anulysis in tlw lwmiglobincyunidt• Lotlt of frug (Ha.na escuh•nt.a L.) a nd of Axolotl mt·­xicanurn (Ambystoma tigrinum in tbc rwotlwni <: pha!'t') purifit·d Ly carhoxy­rnc-thyl cellulosl' chromatography as wt·ll.

'l'lw significun ct· uf the ùifl'crcnct• cxperimt'utally Ùt'lee.tt'Ù betwecn tht · mi ILi molar cxtinction coefTì cients of h t· miglobin cyanide of frog anti of Axolotl ltas bct'n tcsted b y computation of Studcnt's 11 t "· Tht samt· test has beeu pcrformcù in ordt·r to t'Valuate tlw significanct· of th t• difl'crcnccs bt·t Wt't' n tlw t•xtinction codlicient of t•ach of tltt• abovt· mt•ntiotlt'Ù ht•moglohin s ami that of human ht:miglobincyaniùc as J cùuced by thc da ta publisht'd in a previous paper aud report cd bere in Tabll' 2. It has thus Lcen proveù that no significa n t dilft' rences r·xists among thc millimolar t:xtin ction codTìcicnts al À = 540 mp. o f human , frog and Axolotl hcmiglobincyanidt• as it was t o Lt· t•xpc·cted sincc tht· absorbance of this derivative a t 540 ffi!J. dcpcnds on tht· l'tn t· group which is identica! hy dcfinition in ali thc known hem oglobim;.

Thc Authors tlu·n·fon· propose Lo a cccpt tht• va lu t• ~ ~'t~ = 44.0 for

the spectrophotometrit• dc tcrmina tion of frog nrHl Axolot l lwmoglohins h tlw m t'l l w d of l~t ·m i glohi r~t:yauidr.

SALVATI, TENTORI E VIVALDI 167

JNTRODUZIONE

Il dosaggio spettrofotometrico dell'emoglobina come derivato r iano­meta è il metodo più largamente usato in laboratorio poichè attualmente viene considerato quello che assicura la migliore riproducibilità dei risultati. Tale metodo è stato infatti raccomandato dall'1< Expert Panel '' della National Academy of Sciences, dal National Research Council negli Stati Uniti e dall' lnternational Committee for the Standardization in H ematology (I.C.S.H.) clelia Società Europea di Ematologia.

I motivi di questa preferenza sono molteplici :

- Le soluzioni di cianometemoglobina (HiCN) seguono strettamente la legge di Beer a À = 540 m(.L, perciò è possibile ottenere una curva di cali­brazione con una sola soluzione standard.

- Lo spettro della HiCN presenta un massimo di assorbimento a C>

À = 540 m(J..

- Tutti i comuni derivati dell'emoglobina possono essere facil­mente e quantitativamente trasformati nel derivato cianometa.

- La HiCN infine è un composto molto stabile nel tempo, le sue caratteristiche non variano fra pH 6,0 e 9,5 e difficilmente si verifica cre­scita batterica nelle sue soluzioni.

Tuttavia vivaci discussioni si sono accese intorno alla definizione del valore esatto del coefficiente di estinzione l /4 millimolare dell'emoglobina umana (e:•) .

Determinazioni sperimentali eseguite in diversi laboratori con metodi cliversi (analisi del ferro, analisi volumetrica del CO e dell ' 0 2 legati, deter­minazione spettrofotometrica del piridinemocromogeno) hanno infatti for­nito valori compresi fra e:• = 10,7 e e: • = 11,7 (DE BoROVICZENY, 1964) per il coefficiente di estinzione 1/4 millimolare.

Secondo ricerche molto accurate condotte da ZIJLSTRA & VAN KAMPEN (1960) e VAN KAMPEN & ZIJLSTRA (1961) in base ad una numerosa serie di dati, è st ato osservato che la determinazione del ferro fra i metodi suddetti presenta l'errore standard più basso c dà valori della concentrazione dell'emo­globina maggiori del 2 % circa risp etto a quelli calcolati in base alla capacità eli legame con CO ed 0 2•

Nei nostri Laboratori è stata eseguita una serie di det erminazioni del coefficiente di estinzione della HiCN mediante analisi del ferro e dell'azoto su campioni di emoglobina umana adulta purificata su colonna di carbos­simetil cellulosa (SALVATI, TENTORI & VrvAJ,DI, 1965 ; TENTORI, VrvALDr & SALVATI, 1966). È stato calcolato un valore medio del coefficiente di estin­zione 1/4 millimolare deJl'emoglobina umana a À = 540 m!l

e:• = 10,95 ± 0,03 (errore standard della media) in buon accordo con il valore di

e:• = J 1,00

Ann. /Hl. S~t,ur. Sauilà ( 196 7 ) 3 , lfi ti-1 74 .

11111 ESI'E III ENZE E III CEII CII E

proposto da ZIJLSTHA & VAN KAMr'EN (J 9GO) c ua VAN KAMPEN & ZIJLST HA

(1961). Nrl corso ui tre· simposi organizzati in occasiom· dc·i Congressi irHf'r­nazionali ùi ematologia degli anni 1963. 1964t• 1965, l' Intcrnationa l Commitlt•t· for tlw Standardization in H ematology ha provvt>dutu ad una accurata va­lutazione· dci dati ed è giunto alla dt'cisione di proporre pro, ·visoriamentt· il valort' di e: • = 11,0 quale' coefficiente di cstinzionl' l /4 millimolarc· della HiCl'ì umana eorris pondt•ntt• ad un codfr cil'ntt· di t•stinziont• millimolart·

(<: ~~) di 44 .

È noto chf' lt· caral"t(·ri sti cht' de'Ilo s pt'tlro di assorbimento ne'l vi sibilt· dPIIt· emoproteinP sono dipendenti dalle• caratt('risticht· d('ll ' t'mt· (LEMBEilC & LEGGE , 194·9), eioè dalla struttura (lt•llt· catt·nc lat('rali di t•sso t• dallu stato di val('nza del ferro, mentre sono indipendenti dalla struttura ddla globina la quale d ' altra part t· d t•tt•rmiHa lt· earattf'ri!'ticht· di'Ilo spettro di assorbimt•nto nt'll' ultra violetto.

Secondo lt• rict·rclw fino arl oggi condotte sulla biochimica comparata tlclle emoproteine, tutti i vcrtebrati e molti invertebrati presentano mio­globine t·d emoglobine con lo St<'sso gruppo prostNico, la protoporfirina IX legata ad un atomo di ferro , che· prcndt· il nome· di protofc·rrol'mt· cd è ca­pact· di combinarsi revcrsibilmentt· con l'ossigeno.

L'unica c·cccziorw osst·rvata è rapprest•ntata dalla Clorocruorin a della Spirographis spallanzani il cui gruppo l'm <' presenta differenti ea t erw latt· ­rali (LEMBEHG & LEGGE, 1949). Gli spettri di assorbimento rwl v isibile dellt · f'moglobinf' t' loro derivati hanno quindi un aspetto in variabile indipcnden t t• dallt· caratteristiche della globina ed inoltre• l' intensità flf•lle bande JWr emo­glohint· tli s pt·cic divcrst· raramente pn·senta variazioni signifi cative· (LEM­BEHG & LEGGE, 1949). Tuttavia lo spettro df'lla ossiemoglobina può prcst•n­tart· piecoli spostamenti nellt• bande di assorbimcmto (LEMBEHG & LEGGE, 1949; N EEDHAM, ] 966) in rapporto a diffen:nze di affinità pt>r l'ossigeno dovute· alla struttura specifica della globina.

P er quello che riguarda in parti colare il derivato cianometa della emo­globina è stato documentato che il suo comportamento spcttrofotometrico non dipende mai dalle caratteristiche della globina . REMMEil (1 9G4) ha osser­vato che lo spettro non subisce variazioni anche quando la globina è quasi eompletamente denaturata. DRADKIN (1965) ha esaminato i derivati cia­nometa di differ enti emoproteine . I coefficienti di estinzione molare, calco­lati tutti con lo stesso metodo , risultano uguali per le cianomctc•moglobirtl' e cianometamioglobint' di uomo, normali e patologiche, di cavallo, di catw, e di maiale, mentre presentano diff'erenze dt·l 2-5 % per derivati cianom('ta d ('l citocromo C c· di altri composti cminici .

Da quanto è stato esposto sembrerebbe possibilt· detl'rminar<• con il mctotlu della cianom('temoglobina,. cd usando sc:mprt• lo stt·sso cof•fficicntt·

Atu~o 1 .~1 . 814/Jt'l' , .Sat~ittì ( I Ufii) 3, J(i!,· li ·l .

r

SAT.VATI, TENTORI E VIVALDI l69

Ji estinzione, le emoglobine di specie animali diverse, purché abbiano lo

stesso gruppo eme. Nella presente nota vengono esposti i risultati di uno studio compara­

tivo sugli spettri nel visibile Jei derivati ossi e cianometa delle emoglobine cli alcuni anfibi e vengono riportati per le stesse emoproteine i valori del coefficiente di es tinzione rnillimolare del derivato cianometa a 540 m!J. de­terminato su alcuni campioni da diverse preparazioni.

MATERIAU E METODI

Preparazione dei campioni di emoglobina. - Sono state usate rane di sesso maschile della specie Rana esculenta L., e Axolotl adulti dei due sessi, della lunghezza Ji circa 25 cm, appartenenti alla specie Ambystoma tigrinum nello stadio neotenico detto Axolotl messicano. D sangue prelevato veniva lavato ed emolizzato come è descritto in precedenti lavori (TENTORI et al., 1965 a; b); l'emoglobina natiVa veniva purificata mediante cromatografia su colonna di carbossimetil cdlulosa. Su colonne di 2 X 10 cm equilibrate con tampone fosfati 0,01 M pH 6,6 verùvano deposti 300 mg circa di emo­globina nativa nello stesso tampone di equilibrio. Le ·proteine non emoglo­biniche venivano completamente eliminate lasciando passare sulla colonna circa 200 mi di tampone 0,01 M a pH 6,6. Si eluiva quindi l'emoglobina con tampone fosfati 0,2 M a pH 8,5. La soluzione ottenuta veniva dcsalifi­cata mediante gel-filtraggio su colonne di Bio Gel P~. La temperatura era mantenuta per tutto il procedimento a 2 - 4°C. Le soluzioni acquose ottenute, eontenenti 1,5 - 2,5% di Hh, venivano clivise in a liquote per le determinazioni spettrofotomctriche e le analisi del ferro, al più presto possibile, onde evitare inomogeneità delle soluzioni causata da denaturazione e precipitazione della proteina; le determinazioni spettrofotometriche vc·nivano eseguite subito dopo.

Spettrofotometria. - Le aliquote per la determinazione dell'assorbimento a .540 m(J. della HiCN venivano diluite con un reattivo contenente K 3Fe (CN)6

in ecces!'lo rispetto all'emoglobina presente, KH2P04 per tamponare le soluzioni a pH 7 circa e KCN (200 mg K 3Fe (CN)r., 50 mg KCN, 140 mg KH2P04 in l l H 20). L'emoglobina nativa in queste condizioni si trasforma istantaneamente in HiCN. La densità ottica (D.O .) a 540 m(J. veniva deter· minata con nno sv ettrofotometro Beckman modello D.U. Gli spettri d i assorbimento sono stati controllati fra 750 e 450 ID!J. su soluzioni di emo­globina nativa (preferibilmente Hb02 prima che fosse intervenuta parziale lrasformazione in metemoglobina) e cianomt>temoglobina con uno spettro­fotometro registratore Cary Mod. 15.

Analisi del ferro. - La determinazione del contenuto di ferro è stata Pseguita secondo il metodo elaborato da MASON & ADARRAGA ELIZARAN

Ann. J .. t. Super. Scmilà (1967) 3. 165·17<1.

1711 ES I'EHIE I\"ZE E RI CE II CIH.

(1963). I campion i di emoglobina vcnrvano digeriti co11 una miscela di acido

solforico, nitrico t' pPrclorico ; il ferro veniYa determinato s pcttrofotomt·­

tri camente col metodo del r:xr:x' dipiridilt·. La cunct·ntraziom· della t•muglo­

hirr a nei campioni è stata calcolata in hast• a l loro co o tPnu t o di ferro tt•nt·ntlo prt•st·nll' d11· una molt•cola di Prnoglobina contit·nt· 4 atomi di ftTro.

Analisi statistiw .. - Il calcolo dt•lla covarianza ,. quello d ella significati­Yità delle difi't•rt·nzt· dt•i codficiPnti di n ·wession t· è· stato esq~uito st•eondo !t- formul t• riport.alt· da EMMEN S ( 194B).

RIS ULTATI E DI SCI!SSJO :\E

Lt· emoglobiJtt• di Hana P.w:ulnlla t' di Axolotl mt•ssicaHo pn•sentano lo · Stl'sse carattt·ristiehe spettrofotomt•triche nt·l visihilt• deli'Pmoglobina umana. La cianomPtcmoglobina degli anfibi studiati presenta una sola hantla di

assorbimt•n t o a 540 In !J.; per l t· ri spctli v t· ossicmuglobint• è possibile osst•r­vart• un h·ggero spostamf'nto dt>lle dut' hande di assorbimento di circa 2 m !:L Vt!r so lt• lunghezze d ' onda più basse riSJWtto alla posrzrom· t],.JI, . corris pon­tlo•nti ],antlt· tl t•lla ossit·rnoglohina umana (Fig. ·1, 2 , 3).

1.0·

0 .0 . l

0.9 l l l l

0,8 l l l l l

0.7 l l l l

0.6 l

' ' ' 0.5 ' ' ' O .l.

0,]

0.?

0.1

1.60

' \

- ,---,--500 S.'. Q 580

-- HbO,

---- HiCN

' ' ' ' ' ' ',_ ~ ... ---.-------,-

6/0 660

ÀmjJ

' 7GO

Fi11:. l . - S p.-ttri di a ssorl.Jimento

d ell' Hl> umu11u fra 4SII

(' 700 1111.1.

Queste piccole difl'er cnzc dello s pettro di assorbimento flella o ssiemo­globina Ji animali divt•rsi sono dd r esto già state osser va t e t' mt·ssc! in rap-

r

SALVATI , TENTORI E VlVALDI 171

porto con la differente affinità per l'ossigeno conseguente a differenza nella globina (LEMBERG & LEGGE, 1949). .

1.0

D. O.

0.9

0.8

07

1)6

0.5

O.k

n J

0.2

o l

1. 0

D. O

0.9

08

0.7

u.6

0,3

0.2

01

-- Hb02

---- HiCN

..- r r- r- r -,---,--,---,----. ..::;::::~=; 1,60 500 540 580 620

-- Hb02

---- HICN

\ \ \

' ' '

660 '/00 Àm}J

Fig. 2. - Spettri di assorbimento dell'Hb di Rana escu·

lenta fra 450 e 700 m!.J.

Fig. 3. - Spettri di assorbiment o dell'Hb di Axolotl mes­sicano fra 450 e 700 rnj.l.

La D .O. a 540 mf.L ed il contenuto di ferro sono stati determinati su 12 campioni di 4 diverse preparazioni di emoglobina per la Rana esculenta e

. lmt. ! st . Su~r. Sanità (1967) 3, 16.~ · 1 74.

1- .• ·- E'I'Lil ll '\1.1 ~. lliU· IICIII

t-11 1.) eampiuni d i :i prt·paraz ioni p e-r I'Axulotl 1111 ''-" ll'a no . l ri ... ultali uttt·nttl l

son u ripo rtati rw lla Tal.. 1. do' t• 'c·n~u11o indit·a ti eo11 ~ la D .O. d t· i nt llt ·

pioni t'con x il loro I'UIIl('lllllo di t•mnglobin a c· ;; prt·,;~o in millin1oli pt·r litro

T AIIII.I \ l .

Calcolo del coellicicnte di est inzione millimolarc a 540 n'IL ( <: •;:~1 ) dell a

cianomctemoglobina di " Rana esculenta w c di Axolotl messicano in hasc alla regressionc densità ottica (y)- millimo ta rita dell 'emoglobina (x)

Eu~t•~tll • llinu Il o /(1/U{I f'.~I'U/I'It/11 l•.lllll~lt· l• lllil cio . \~tdot l l llt •,..,.., lt'HII• i

r, ~ o 111 ·' l )o l xl 111:1 .\ ~ ,, 111:1 x:! . JWI

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Il. 1:i l 111 ,·1 11, :.71} t :\, :! li. :IK0J 1),11 o. :wx IJ •• I

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l' calt-olalo, rome· t' ,; taio di't tu, su lla ba~>~· dl'llt· dt· l~ · rrninaziolli di ft·rro.

Jhi dati otlt•nuti è s talu caleolata <'Oli i l mt'toclo <l1·i minimi •ruadrati l ;~

rt·tta di r1·gn·ssiunt· D.O. - cont•·nutn di t•rno~l o iJina 111 m u li pt ·r Jitru il

cui coc·fTi1:ienl•· a n go lar. · b mis ura il Cul·fTic ic·ntt· uwdio di · ·~ li11zio111' milli -

rnolan· d1·lla eianon1t'll' tlluglo hilla a 540 llJ (.L. rnl\1

e: s~ o · 'alori l'a ll'u la ti d i [,

· · mM :;:unu rr s pl'ltrvaml·ntt· :::340

4:.1. 1 (l

ml\1 globina di Uar111 t•!icttlt•lll ll l ' e: 540

pl'r l't ·mu~luhina d i Axol.,t l tn l'~f'> i Ca llo .

0,3ì (dt•\ iaziollt' ... taltdard) l"' r l't ·m u-

42,53 · 0,7.1 (dn iaziu nt · !'laru lard )

A un. lt:l . }:)u}'u· . . ...,o'""' ( l !Hii ) 3. l li:-· li l .

SALVATI, TENTORI E VIVALDI 173

In una precedente nota è stata riportata la determinazione del coeffi­ciente di estinzione 1/4 millimolare della cianometemoglobina umana ese­guita con la stessa tecnica descritta nel presente lavoro (SALVATI, TENTORI & VIVALDI, 1965). Nella Tab. 2 sono riportati tutti i dati della D.O. e del corrispondente contenuto di emoglobina, ottenuti nel corso clel suddetto

l

l

TABELLA 2.

Calcolo del coefficiente di estinzione mllllmolare a 540 ID[J. (e; ~=) della

clanometemogloblna umana in base alla regresslone densità ottica {y) - milllomolarltà dell'emoglobina {x)

y l x . lO• ! y l x . 1o•j y l x· 10• ! y l x· 10• l y l x. J03

l

(l

0,208 4,70 0,400 9,70 0,473 10,87 0,507 11,40 0,532 12,07

0,208 4,70 0,420 9,85 0,475 10,92 0,508 11,40 0,532 12,07

0,209 4,83 0,434 9,93 0,494 11,17 0,510 11,41 0,535 12,17

0,210 4,85 0,435 9,93 0,494 11,20 0,510 11,41 0,626 14,32

0,213 5,03 0,436 9,98 0,494 11,27 0,518 ll ,77 0,627 14,32

0,395 9,00 0,440 10,02 0,502 11,27 0,519 11,85 0,630 14, 45

0,395 9,07 0,471 10,74 0,504 11,27 0,525 Il ,B5 0,632 14,56

0,395 9,25 0, ,172 10,78 0,505 11,40 0,528 l l, RS 0,644 14, 56

0,397 9,62 0 ,473 10,83 0,507 11,40 0,532 12,07

b = 44,43 Sb = O,M8

m M e; !'540 = 44,43 ± 0,88

lavoro relativi a 44 campioni provenienti da 7 preparazioni diverse di emo­globina umana. Il coefficiente angolare della retta di regressione D.O.-conte­nuto di emoglobina espresso in millimoli per litro e quindi il coefficiente tli estinzione millimolare a 540 mfL della cianometemoglobina umana è ri-

sultato: e;~~ = 44,43 ± 0,88 (deviazione standard).

La significatività delle differenze riscontrate fra i coefficienti di estin­zione millimolare a 540 IDfL delle cianometemoglobine umana, di Rana escu­lenta, e di Axolotl messicano è risultata la seguente:

Emoglobina di Rana esculenta - Emoglobina di Axolotl messicano :

t = 0,73 per 25 g. d. l. 0,5 > P > 0,4

. l nn. ! st. &uper. Sanità ( 1967) 3, 165-174..

l i l t~ I' EII I EX7. 1·. l· RI CbiiCIII

Emog-lobina umana - l~mu~lohin a di 1-<anu t •.~ruh•n/u

l = l ,13 p t•r 54 g-. d . l. o.:1 ::::. ]' ' . 0,2

Emoglobina umana - Emog-lohina di Axolot l mt•ssican u

l = J,<~l pt·r .)7 g . d. l. 0.2 . P _- 0,1

L'al'st•n;,a di una difl't·rt·Hza sif!nilie:lti' a fra i nwllil'it ·Hti di n•tin;,iouo ·

millimo lan· a 51·0 m 11. de i dt·ri' ali cian urno·la rlt•llt· tro · emoglobiru· indiea c ho·

n f' lla detPrminazio nl' quantitali\a d el lo · l'rnog-lobint· di Anfihi eon il metodo do ·l­

la cianoml'1t•moglobi na è lt ·cit u usa n · lo s lt·sst• 'a loro· dt·l CtH'IIic i• ·nto· di •·slin7.io ·

llt ' millimolan· a 540 m 11. 1111i' t•rsalm!'nlt• aeel'Lta lo JH'r l'nllu~lohina um a n a.

In conclus iorw s i put. afl'erman· ch t· l'idt·nti t à dt·gl i spl'ltri di assor bi­

mPnto nel v is ibi lt• dt·i dt·ri va ti cia nomi'La rl..tlt- t·muglobi nt· umana, di ra na

,. di axolotl t' la non s ignificati,·ità de lle difl't·r •·n ;,t· t ru,·at• · spnimt·ntal iiH'nl •·

fra i loro cof' ffi cienti di rstinziurw mi ll imolan· a S40 m {l. conft'rmano quanto

l'ra s tato dimos t rato pl'r Il' t·moglohirw uman•· normali •· pa to logiclw, JWr

le nnogloLint· di ca' a llo , di c·ant· t' di eoni glio •· più iu ~··nt·ralt· oA'rono una

ultcrio rt· prova sperimcnt alt- eht• ),. caralteristieh•• dello S]H'll ru 111'1 \' is iLi) ,.

Òt"llt· t·moglobirw dipPndono t·sdusi , ·amt·nt• · dalrt•mt·.

Il l(l'lllll!iO 191oi.

1111\LIOC Ho\1-'1 \

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A1t11. 1.<1 . l>ttf)CI' . /:;u11ilà (I!Hi7 ) 3, lu~ ·li l .

Formazione di cloroplasti in culture di tessuti di Daucus carota in diverse condizioni ormonali.

GIUSEPPE ARANCIA, MILENA BANDIERA (*) e GIORGIO MORPURGO

Laboratori di Chimica Biologica, Centro Internazionale di Chimica Microbiologica e Laboratori di Fisica

Riassunto. - Culture di t essuti di Daucus carota, alla luce, divengono verdi, se coltivate in presenza M' opportune concentrazioni di auxine e chi· netine; se si sostituisce all'auxina e alla chinetina l'acido 2,4-dicloro-fenossi· acetico (2-4D} le cellule rimangono invece bianche.

L'esame delle sezioni cellulari al microscopio elettronico ha mostrato ehc in quelle coltivate in presenza di 2-4D lo sviluppo del cloroplasto si arresta allo stadio iniziale di proplastidio.

Summary. (Formation of chloroplasts in tissue culture of Daucus carota t n different hormonal conditions). - Cells of tissue culture of Daucus carota, in the presence of the light, become green when are grown in mcdium supplemen ted with auxine and kinetine in suitable concentration.

Cells grown on the same medium with 2,4-dichloropbenoxyacetic acid (2-4D} replacing auxine and kinetinc remain white.

The observation at the electron microscope of the section of the cells grown on 2-4D medium has shown that the development of the chloroplasts is arrest ed at the leve) of initials of proplastids.

The possible role played by auxines in the mechanism regulating the chloroplast formation is discussed .

I tessuti vegetali possono facilmente essere coltivati in vitro su terreni sintetici (per una rivista sull'ar gomento vedi ZEEVAART, 1966} in presenza Ji concentrazioni opportune di ormoni vegetali.

Il destino della cultura, cioè la possibilità che rimanga in condizione pressoché inditferenziata oppure che insorgono strutture organizzate ed

(*) Impresa di Radiobiologia applicata a problemi agricolo-alimentari del Con~iglio

Nazionale nelle Ricerche, Istituto di Genetica, Università di Roma.

_t rm. f st. Super. Sailil l'l. (1967) 3, 175-178 .

171• E~I'EIIII::NZE E 111 CE HCIII·.

evcntualmt·n le la pian la, di pendt• dalla natura t' Jallt· ri !S pt'tti' t' COJH't•n tra ­

zioni di auxine t' chin t'tirw. In linea ~t'nt'rale un 'alta concentrazione di auxi­

na tcndt· a determinart· una condiziont• di non-difli.·n ·nziamt•Jlto . l mi~liori f'fl'e tti a ques to seopo si ottt>ngono usando un"au x i1 :a ~;in tl'liea . (' at' ido 2.4-

dicloro-fenosHi -acl'licu (2-4D). Lt· eulture di tt•ss uti \'!'gt•t a li. a lla lut't' t' in

prt!senza di co n et•utra:~:ioni opportunt· di 2-4D, rc><tano allo stato indifl't'rt' ll· ziato ed inoltrt· nou diventano mai \t rdi. L ' incapacitù di fiJrmare la eloro­

filla è don1ta allt• condizioni ormonali dt·l mezw: infatti eultun· i11 eotJdi­zioni idcnticht·, s ullo s tt·sso mezzo hasalt•, iu pn•st·n za tli auxi11a t' ehinl'l ina divengono \'ert!i.

Nella prest'ntt· rict'rca si esaminano al microscopio det t ronit·o le cdlult· c resciute in pn•sf•nza di 2-4D, pe r dt'lt·rminan a clw s tad io sia bloccato lo sviluppo dt·i cloroplasti.

MATEHIALI 1·: i\11-:TUDI

Ceppi. - Nt· l corso ddlt· ricerca è s tato u tilizzato un l't'fliH' di Dauru .~ carota da noi stessi isolato, circa dut · anni fa , dalla radin·.

Mezzo di cultura. - È stato utilizzato il t erreno di M UHAS IIIGE & SKooc (1962) addizionato c: o n 2-4 D (O,l mgj J) oppure con acido indol-acetico (I A A) t' c:hinctina (6-furfuril-ammino-purina), f'll tramhi alla f'onct·n t raziont• 0 .1 m g l i .

Esamt• al microscopio rletlronico. - Pt'f la o><st· n az ione al microscopio elettronico sono state usatt· dut· t <>cnichc Ji fissazione: glu tara ldt·iùt· 2 % + Os04 l 1}0 t' glutaraldl'irlt• 2 % -t KMn04 2% diluiti nt' l lern·no stesso di cultura.

I tempi di fissaziont· sorlo s tati \'ariati a seconda Jel tipo di preparato in modo da ottt•ncn· i migliori risu ltati e sono indi cati rwllc didascalie dPilt · fìgure. La disidratazione è stata ottenuta con serit· cresc(•ntt• di alcooli ,.

l' inclusione è stata fatta in aralditc. Sc:.~ioni Jei preparati sono statt· t'l' t'· guitt' con un microtomo Portcr-Blum MT-1, coloratf• (tranne quando è s tata usata la fissazione con KMn04 ) co n il s ist ema di KAR ovs KY (l 961 ) cd osservate al mi croscopio elettronico Sit·mens-Elmis kop- .1.

HI SIJLTATT

L 'esame d ci preparati al microscopio elettronico ha mostrato ch e, rw ll t· cellule c resciute in presenza Ji 2-4D, si ha l'inibizione compl e ta dello svi­

luppo del cloroplasto. Nelle sezioni di cellule (Fig . . 1 r 2) non sono visibil i cloroplasti, bensì particdlt· delle dimensioni all'incirca dt·i mitocondri , t'ir­condatc da una doppia membrana, pri ve, nella maggior parte dei casi . di una qualsiasi struttura interna. .

.Aun. h;/. 8IIJJ(I', 8uullti ( IUU7) 3 , l i!'i- 1 7~ .

ARANCIA, BANDlERA E MORPURGO 177

Il cloroplasto quindi non inizierebbe neppure lo sviluppo, ma si arre­sterebbe allo stadio totalmente indifferenziato che M U HLETBALER & FREY­

WYSSLING {1959) chiamano « iniziale di proplastidio l>.

In molti casi è possibile distinguere queste s trutture dai mitocondri, sia per la mancanza di cristae interne, sia per la loro maggiore densità al microscopio e1ettronico; molto spesso tuttavia è praticamente impossibile distinguere tra forme iniziali dei proplastidi e mitocondri, p ercbè le cristae interne non sono sempre evidenti nei mitocondri cd anche pcrchè nei pro­plastidi si può avere qualche accenno di invaginazione de11a membrana.

Nelle Fig. 3, 4 e 5 si vede invece la struttura generale delle cellule e dei cloroplasti qualora il tessuto sia cresciuto su di un t erreno supplementato con auxina e chinetina, divenendo perciò verde.

Nella Fig. 3 si possono individuare numerosi cloroplasti nella fase di ò.ifferenziamento, tra il grande vacuolo centrale e la parete cellulare. Nelle

(l

Fig. 4 e 5 si vedono a maggiore ingrandimento i cloroplasti in cui sono già in formazione i caratteristici grani; nella Fig. 5 sono chiaramente distingui­bili anche i mitocondri.

Le Fig. 6 e 7 mostrano infine, per confronto, la sezione di una cellula ùi una fogliolina originatasi dal callus e, a maggiore ingrandimento, un cloro­plas to completamente sviluppato.

DISCUSSION E

I dati riportati dimostrano chiaramente che il normale sviluppo dei doroplasti nei tessuti in cultura è completamente bloccato quando le cellule sono cresciute in presenza dell'auxina sintetica 2-4D; in tali condizioni il cloroplasto non comincia il processo di sviluppo e nelle cellule si trovano solamente le forme iniziali dei proplastidi.

B evidentemente impossibile a questo stadio della ricerca tenta re d i comprendere per quali ragioni lo sviluppo del cloroplasto sia impedito dalla presenza del 2-4D, né per il momento sappiamo se l'assenza dei cloroplasti sia det erminata daiJa presenza della auxina o dalla mancanza della chine­tina; è tuttavia interessante notare che nelle culture di tessuti i cloroplasti differenziano n elle st esse condizioni ormonali che portano al differenziamento dPlla pianta, mentre non si formano in presenza di 2-4D che è un potente agente sdifferenziante .

Dobbiamo notare che i cloroplasti sono anche assenti nelle culture ·• anergies n, ottenute da GAUTHERET (1955), che si moltiplicano in assenza di fa ttori di crescita, ma devono probabilmente questa loro proprietà ad un più alto contenuto di auxine endogene (GA UTBERET, 1963) .

Vogliamo anche ricordare che, secondo le ricerche ùi SKOOG & MILLER

(L 957), nelle culture di t essuto di tabacco viene indotta la rizogen esi quando

:; . f111t. / si. S<t/)P.r. S anità ( 1967 ) 3 , 175·178 .

l /Il E~PEH I E:>IU E RI CEIIOII

lt· cd lult · s i trO\"ano a d una conct·ntr alliont• di auxma molto eln ala ri!'pt'llo alla conc.-ntrazionP di chinctinu.

Come è nolo, lt' radici, t'spostt· alla luct·, formano i cloroplasti con grand ..

ùiflicoltà e talvolta non li formano affatto (PowEt, L, 1925): i fattori clw det erminano tal t• comportamen tu sono totalmt•nlf' sconosciuti ( K IHK & TILNEY BASSETT, 1967) . Poiché il 2-4D può in realtà t'Ssen · eonsidt'nll o

un prodotto aò attività auxinica , ci si può chi t>den· se non siano proprio lt · auxint• (oppure il rapporto tra auxine ed a ltri fattori di c rp;;ci ta) a condizio­nare la possibilità delle r adici di forman· i cloroplasti.

11' aprili' 1967.

RIRLI OG RAFIA

GAUTIIEII ET, R . .1 ., l 95:1. Rrl'. Gen . ]Jnlatl., 62 . . i. GAUTRERET, R. J ., 1963. Cnmpt. Uwd., 256, 2071. KAR~OVSKY, J. , 1961. J. Bioph.vs. Hiochem . Cytol .. 11. 729. KIRK . J . T. O. & R. A. E. TIL'IEY BASSE'IT, 1967. The Plastid.~, their chemestry. structurr.

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AIIA'lCIA, IJANO II::JlA E .\IOIIPII JH;ù

FiJ.(. l . - Sezione rli !"eiJula <li tes~uto c·o ltivato : in pr<'S<'nzu .Ji!"i2-40.

Fif.!. 2.

r propla~ticlio ; \1 mitocnrulrin ; nn r lt>o; 'ìiJ nnrl~n lo.

Fis,azimtC: g lut araltlcid c ~ :;· l o~o, 7~'.

St' zione di f"clhda oli tt'"utn c·o lt ivaln in presenza di 2- ~D. \1 itornmlri ,. prnplastidi non ' """ faf· ilrll (·nt t• oli> l inguihili fra lorn . i\ nuelen; 'i l J mu·lr·oln ; P pro lwhi lnu·ntf' prnpla,l ioli. Fi ssaziotw: !!;lularaldl'idt• ~5 ' l (),.() 1 7.i ' .

11111. / s i . Sti/H'I". S11uilu t i !Jtij) 3. 17:; -J i&.

,\IIAO'If: IA . IIA" DIERA E )IORPl1 1H; O

s .. ~ion r di ('l' llulc err><riut(' in pr<>so·nza rli a u x ina ,. t•hin ctina. v vueuolo;

C t•lnroplas ti.

F i, , a z inur: :.dutaral,kidc l HO' l K \'l nO 1 l ~o ' .

. l ou. / .:1 .. ~ IIJH'I', Sftnilit ( IH6 i} 3 . 17;; . 1 7~

ARANCIA , IJANDIE R A E MORPl' HG O

Fi~. 1-. - C:loroplast o m v•a di sviluppo d i una cellula di tf'ssuto cresciu to "' pr esenza di auxina c chinetina. G = grano in formazione.

Fissazione : glu tara lclcidc l !l()' + OsO 1 60'.

Cloroplasti " milol·onclri in ccllnlc cr eseiute in pr t•senza <li auxina L'

e hinctina. c cloropl a~ti; vr mi lorondri .

Fissazione: g lu tara lclcicle 180' f- OsO 1 60' .

. l nn. /...;1 .• SnJU' I' . . -.,·unità ( ll.Hi7) 3, 17:) · 1 7~.

A RA NCIA , BANDI'ERA E MORPU RC.O

Sezione di cellula fogliare di Daucus carota in cui si dis linj!IIOnn t·hinramente i c loroplasti l'd i mitocondri. Fissazione: glularnldeide 180' + Os0 4 60'.

Fig. 7. - Cloroplasto di cellula fogliare a maggiore ingrandimento. Fissazione : glulara ldeide 180' + OsO 1 60' .

· ' ""· f s/ . .'i11per. Sauilir ( I!Jii 7) 3 , 1 7."• · 1 7~.