SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE

RICOMBINANTIRICOMBINANTI

-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, -PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita). insulina, ormone crescita).

-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI).-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (ENZIMI).

-PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA -PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI. MONOCLONALI.

-REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA. -REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.

A cosa possono servire le proteine ricombinanti?A cosa possono servire le proteine ricombinanti?

SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI SISTEMI DI ESPRESSIONE EUCARIOTICI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE

RICOMBINANTIRICOMBINANTI

QUANDOQUANDO? – Quando le proteine sintetizzate ? – Quando le proteine sintetizzate nei procarioti sono nei procarioti sono instabiliinstabili o perdono la loro o perdono la loro attività biologicaattività biologica..

PERCHE’?PERCHE’? – Perché dopo la purificazione le – Perché dopo la purificazione le proteine ricombinanti sono prive di proteine ricombinanti sono prive di contaminanticontaminanti (composti batterici tossici o (composti batterici tossici o pirogeni).pirogeni).

- Perché una serie di - Perché una serie di modificazionimodificazioni sono sono possibili a livello post-traduzionale:possibili a livello post-traduzionale:

Corretta formazione di Corretta formazione di ponti di solfuroponti di solfuro

Tagli proteoliticiTagli proteolitici della forma precursore della forma precursore

GlicosilazioneGlicosilazione (stabilità) (stabilità)

FosforilazioneFosforilazione, , acetilazioneacetilazione, , carbossilazionecarbossilazione etc… (attività biologica) etc… (attività biologica)

GENERICO VETTORE DI ESPRESSIONE GENERICO VETTORE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO: EUCARIOTICO:

CARATTERISTICHE PRINCIPALICARATTERISTICHE PRINCIPALI

UNITA’ DI TRASCRIZIONEUNITA’ DI TRASCRIZIONEEUCARIOTICAEUCARIOTICA

MARCATOREMARCATORE SELEZIONABILESELEZIONABILE

EUCARIOTICAEUCARIOTICA

SISTEMI DI SISTEMI DI TRASFORMAZIONE/TRASFEZIONI DI TRASFORMAZIONE/TRASFEZIONI DI

CELLULE EUCARIOTICHECELLULE EUCARIOTICHE

LIEVITO:LIEVITO:

- FORMAZIONE DI PROTOPLASTIFORMAZIONE DI PROTOPLASTI

- TRASFORMAZIONE CON ACETATO DI TRASFORMAZIONE CON ACETATO DI LITIOLITIO

- ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONE

CELLULE ANIMALI:CELLULE ANIMALI:

- INCUBAZIONE CON DNA INCUBAZIONE CON DNA COPRECIPITATO CON FOSFATO DI COPRECIPITATO CON FOSFATO DI CALCIO O DEAE-DESTRANOCALCIO O DEAE-DESTRANO

- ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONE

- VEICOLAZIONE DI DNA DA PARTE DI UN VEICOLAZIONE DI DNA DA PARTE DI UN VIRUSVIRUS

SISTEMI DI ESPRESSIONE SISTEMI DI ESPRESSIONE BASATU SU BASATU SU S. cerevisiaeS. cerevisiae

VANTAGGI VANTAGGI - Eucariote unicellulareEucariote unicellulare- Ben nota la genetica e Ben nota la genetica e

la fisiologiala fisiologia- Crescita rapidaCrescita rapida- Identificati promotori Identificati promotori

forti, plasmidici (forti, plasmidici (m) m) naturalinaturali

- Modificazioni post-Modificazioni post-traduzionalitraduzionali

- Secerne poche Secerne poche proteineproteine

- GRAS organism GRAS organism (Generally (Generally Recognized As Recognized As Safe) dalla Food and Safe) dalla Food and Drug Administration Drug Administration degli Stati Unitidegli Stati Uniti

PROTEINE RICOMBINANTI PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTE IN PRODOTTE IN S. cerevisiaeS. cerevisiae

VETTORI BASATI SU VETTORI BASATI SU S. cerevisiaeS. cerevisiae

1.1. VETTORI PLASMIDICI O EPISOMALIVETTORI PLASMIDICI O EPISOMALI ADOPERATI DIFFUSAMENTE PER ADOPERATI DIFFUSAMENTE PER

PRODURRE PROTEINE ETEROLOGHEPRODURRE PROTEINE ETEROLOGHE INSTABILI IN CONDIZIONI DI CRESCITA IN INSTABILI IN CONDIZIONI DI CRESCITA IN

LARGA SCALA (> 10L)LARGA SCALA (> 10L) RIMEDI:RIMEDI:- ALTERAZIONE CONDIZIONI DI CRESCITA - ALTERAZIONE CONDIZIONI DI CRESCITA

AUMENTO DELLA STABILITA’AUMENTO DELLA STABILITA’

2.2. VETTORI DI INTEGRAZIONEVETTORI DI INTEGRAZIONE POCO DIFFUSI PER BASSA RESA POCO DIFFUSI PER BASSA RESA

PROTEICAPROTEICA

3.3. CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC)(YAC)

CLONAGGIO DI LUNGHI SEGMENTI CLONAGGIO DI LUNGHI SEGMENTI DI DNA (100 Kb)DI DNA (100 Kb)

ALTAMENTE STABILIALTAMENTE STABILI

UTILIZZI DEL SISTEMA YACUTILIZZI DEL SISTEMA YAC

MAPPATURA FISICA DNA GENOMICOMAPPATURA FISICA DNA GENOMICO

ANALISI DI GRANDI UNITA’ ANALISI DI GRANDI UNITA’ TRASCRIZIONALITRASCRIZIONALI

PREPARAZIONE E SCREENING DI PREPARAZIONE E SCREENING DI GENOTECHE GENOTECHE

COMPONENTI ESSENZIALI DEL COMPONENTI ESSENZIALI DEL SISTEMA YACSISTEMA YAC

MARCATORE SELEZIONABILE DI MARCATORE SELEZIONABILE DI E. coliE. coli (AMP(AMPRR))

ORIGINE DI REPLICAZIONE IN ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E. coliE. coli (ori (oriEE)) CENTROMERI CENTROMERI ((CENCEN)), TELOMERI , TELOMERI ((TT)), E , E

SEQUENZE A REPLICAZIONE AUTONOMA SEQUENZE A REPLICAZIONE AUTONOMA ((ARSARS))

MARCATORI DI DI SELEZIONE MARCATORI DI DI SELEZIONE AUXOTROFICA COME AUXOTROFICA COME TRP1TRP1 E E URA3URA3 PER PER SELEZIONARE IN LIEVITOSELEZIONARE IN LIEVITO

SITI DI RESTRIZIONE UNICISITI DI RESTRIZIONE UNICI

SISTEMA DI CLONAZIONE YACSISTEMA DI CLONAZIONE YAC

IL COSTRUTTO IL COSTRUTTO FINALE RECA FINALE RECA

DNA CLONATO E DNA CLONATO E SI PUO’ SI PUO’

MANTENERE MANTENERE STABILE IN UNA STABILE IN UNA

CELLULA DI CELLULA DI LIEVITO OSPITE LIEVITO OSPITE

Ura-Ura- E E Trp-Trp-

ESPRESSIONE DEL GENE ETEROLOGO ESPRESSIONE DEL GENE ETEROLOGO DELLA DELLA SUPEROSSIDOSUPEROSSIDO DISMUTASI DISMUTASI

UMANAUMANA IN IN S. cerevisiaeS. cerevisiae

Cu/Zn SODCu/Zn SOD COMBINA L’OCOMBINA L’O--

2 2 CON HCON H22 H H22OO22

PRODUZIONE DI ANIONE SUPEROSSIDOPRODUZIONE DI ANIONE SUPEROSSIDO

- INFIAMMAZIONE- INFIAMMAZIONE

- RIPERFUSIONE D’ORGANO- RIPERFUSIONE D’ORGANO

POTENZIALE AGENTE TERAPEUTICO:POTENZIALE AGENTE TERAPEUTICO:- OSTEOARTRITE, ARTRITE REUMATOIDE, OSTEOARTRITE, ARTRITE REUMATOIDE,

SCLERODERMA, SPONDILITE ANCHILOSANTESCLERODERMA, SPONDILITE ANCHILOSANTE

CLONAZIONE DEL cDNA PER Cu/Zn CLONAZIONE DEL cDNA PER Cu/Zn DISMUTASI UMANA IN LIEVITODISMUTASI UMANA IN LIEVITO

Trasformazione Trasformazione di un ceppo di di un ceppo di lievito LEU2-lievito LEU2-

Crescita in LEU-Crescita in LEU-

Espressione Espressione costitutiva di costitutiva di Cu/Zn-SOD Cu/Zn-SOD acetilata in ALA acetilata in ALA all’N-terminaleall’N-terminale

ESPRESSIONE DI PROTEINE ESPRESSIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI IN RICOMBINANTI IN S. cerevisiaeS. cerevisiae

LIMITILIMITI

1.1. PERDITA DEL PLASMIDEPERDITA DEL PLASMIDE

2.2. IPERGLICOSILAZIONE DELLA PROTEINA IPERGLICOSILAZIONE DELLA PROTEINA ETEROLOGA ALTERAZIONE ETEROLOGA ALTERAZIONE ATTIVITA’ BIOLOGICA E ATTIVITA’ BIOLOGICA E IMMUNOGENICITA’IMMUNOGENICITA’

3.3. NO SECREZIONE PROTEICA NO SECREZIONE PROTEICA

RIMEDIRIMEDI

- LIEVITI ALTERNATIVI:LIEVITI ALTERNATIVI: Kluyverommyces lactisKluyverommyces lactis Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe Yarrowia lipoliticaYarrowia lipolitica Pichia pastorisPichia pastoris Hansenula polymorphaHansenula polymorpha

Pichia pastorisPichia pastoris

LIEVITO METANOLTROFICOLIEVITO METANOLTROFICO

COLTIVABILE FACILMENTE ED COLTIVABILE FACILMENTE ED ECONOMICAMENTE IN BIOREATTORI ECONOMICAMENTE IN BIOREATTORI DI GRANDI DIMENSIONIDI GRANDI DIMENSIONI

COSTRUZIONE DI COSTRUZIONE DI VETTORI DI VETTORI DI INTEGRAZIONEINTEGRAZIONE PER EVITARE LA PER EVITARE LA PERDITA DEL PLASMIDEPERDITA DEL PLASMIDE

VETTORE DI ESPRESSIONE CHE SI INTEGRA VETTORE DI ESPRESSIONE CHE SI INTEGRA IN IN P. pastorisP. pastoris PER PRODUZIONE DI HBsAg PER PRODUZIONE DI HBsAg

(scopo vaccino)(scopo vaccino)

GENE AOX1GENE AOX1: ALCOL : ALCOL OSSIDASI E OSSIDASI E REGOLATO DAL REGOLATO DAL METANOLOMETANOLO

orioriEE:: DERIVANTE DA DERIVANTE DA pBR322pBR322

INTEGRAZIONE DI UNA PARTE DEL VETTORE INTEGRAZIONE DI UNA PARTE DEL VETTORE DI ESPRESSIONE NEL GENE 1 DELL’ALCOL DI ESPRESSIONE NEL GENE 1 DELL’ALCOL

OSSIDASI DI OSSIDASI DI P. pastorisP. pastoris

TRASFORMAZIONE TRASFORMAZIONE DI UN CEPPO DI DI UN CEPPO DI P. pastorisP. pastoris HIS4HIS4--

RISULTATIRISULTATI

IN PRESENZA DI IN PRESENZA DI METANOLOMETANOLO IL IL CLONE RECANTE L’UNITA’ CLONE RECANTE L’UNITA’ INTEGRATA DI DNA SINTETIZZA INTEGRATA DI DNA SINTETIZZA GRANDI QUANTITA’ DI HBsAgGRANDI QUANTITA’ DI HBsAg

ASSEMBLGGIO DEL PRODOTTO ASSEMBLGGIO DEL PRODOTTO PROTEICO PROTEICO ANTICORPI ANTI-ANTICORPI ANTI-HBVHBV

PRODUZIONE DI PROTEINE PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI MEDIANTE IL SISTEMA RICOMBINANTI MEDIANTE IL SISTEMA

DI ESPRESSIONE DI DI ESPRESSIONE DI BaculovirusBaculovirus

AcMNPV:AcMNPV: VIRUS DELLA POLIEDROSI VIRUS DELLA POLIEDROSI NUCLEARE MULTIPLA DI NUCLEARE MULTIPLA DI Autographa Autographa californicacalifornica

LINEA CELLULARE:LINEA CELLULARE: Spodoptera Spodoptera frugiperdafrugiperda

- - SI ESPRIME MOLTO BENE IL SI ESPRIME MOLTO BENE IL PROMOTORE DELLA POLIEDRINAPROMOTORE DELLA POLIEDRINA

PRODUZIONE DI Baculovirus PRODUZIONE DI Baculovirus RICOMBINANTERICOMBINANTE

STEP ISTEP ITRANSFER VECTOR CONSTRUCTION TRANSFER VECTOR CONSTRUCTION E. coliE. coli -BASED PLASMID -BASED PLASMID

PROPAGATIONPROPAGATION

STEP IISTEP II

TRANSFECTION OF CELLS WITH TRANSFECTION OF CELLS WITH AcMNPV DNA + TRANSFER VECTORAcMNPV DNA + TRANSFER VECTOR

• LOSS OF POLYHEDRIN GENE

• ZONE OF CELL LYSIS

• ISOLATION OF VIRUS

““VISUALIZZAZIONE” DELLE VISUALIZZAZIONE” DELLE PLACCHE SENZA OCCLUSIONE:PLACCHE SENZA OCCLUSIONE:

IBRIDAZIONE DEL DNAIBRIDAZIONE DEL DNA

PCR ASSAYPCR ASSAY

GENE GENE lacZlacZ DI DI E. coliE. coli SOTTO IL SOTTO IL CONTROLLO DI UN PROMOTORE DEL CONTROLLO DI UN PROMOTORE DEL BACULOVIRUSBACULOVIRUS

STEP IIISTEP III

INFEZIONE DELLE CELLULE DI INSETTO INFEZIONE DELLE CELLULE DI INSETTO CON BACULOVIRUS RICOMBINANTECON BACULOVIRUS RICOMBINANTE

STEP IVSTEP IV

RACCOLTA DELLA PROTEINA RACCOLTA DELLA PROTEINA ETEROLOGA DOPO 4 O 5 GIORNIETEROLOGA DOPO 4 O 5 GIORNI

ALCUNE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI ALCUNE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTE UTILIZZANDO IL SISTEMA DEL PRODOTTE UTILIZZANDO IL SISTEMA DEL

VETTORE DI ESPRESSIONE DI BACULOVIRUSVETTORE DI ESPRESSIONE DI BACULOVIRUS