Progetto realizzato da:Bassoli Cinzia, Calia Angela, Caronni Valentina, Cordò Valentina, Lo Presti Francesca, Marcandelli Alberto, Brambilla Marta, Cassani Alessandra, Clavenna Riccardo, Colombo Laura, Del Mastro Elena, Guerrieri Luca, Morandi Francesca, Morandi Luca, Prati Marco, Redon Max, Rinaldi Federica, Romei Agostino.

Metodo Wizard Minipreps DNA Purification

Estrarre il DNA plasmidico purificato, partendo da una coltura di Escherichia Coli (battere presente anche nella flora intestinale umana) precedentemente trasformato.

E. Coli

Plasmide contenente il gene per la resistenza all’ Ampicillina

11/04/23

1) Trasferire la coltura batterica

in una provetta e

centrifugare a

temperatura

ambiente.

2) Scartare il surnatante, capovolgendo la provetta su carta assorbente.

3) Aggiungere nella provetta la Cell Resuspension Solution (una soluzione che serve a riportare le cellule a pH ottimale per salvaguardare il DNA durante la lisi) , che contiene:

•Ribonucleasi A = degradazione RNA

•EDTA = blocco reazioni enzimatiche

4) Aggiungere Cell Lysis Solution, che contiene un forte detergente che rende il pH delle cellule fortemente basico e determina la rottura della parete cellulare e la denaturazione del DNA cromosomiale, grazie alla presenza di SDS ( Sodio dodecil solfato) che rompe i legami non covalenti. Agitare.

6) Aggiungere la Neutralization Solution a base di potassio acetato che tende a neutralizzare il pH.

L'atomo di idrogeno (H) del gruppo carbossilico (−COOH) può essere donato come ione H+ , comportandosi così da acido. Posto in una soluzione basica, tende a neutralizzare il pH

Centrifugare.

5) Aggiungere una soluzione di proteasi alcalina, catalizzatore dell’idrolisi delle proteine.

Durante la centrifuga il DNA genomico denaturato ed i detriti cellulari precipitano.

7) Trasferire tutto il surnatante in una colonnina Wizard e centrifugare: il DNA plasmidico passa attraverso la colonnina Wizard e rimane attaccato alla membrana, mentre il resto attraversa il filtro, finendo sul fondo della provetta.

8) Aggiungere la Washing Solution che serve per lavare la membrana a cui si è legato il DNA e a ripulirla da eventuali impurità. Centrifugare e scartare l’eluato.

9)Trasferire la colonnina nella provetta e aggiungere TrisHCl pH 8 oppure acqua deionizzata a temperatura ambiente.

In questo passaggio il DNA viene eluito, rimanendo in soluzione e non precipita.

A QUESTO PUNTO IL DNA è PRONTO PER ESSERE ANALIZZATO IN ELETTROFORESI.

10) Incubare a temperatura ambiente per fardiffondere il tampone nella membranae staccare il DNA.

Strumenti utilizzati

Micropipette

Luca, la cappa sterile ed i terribili puntali

Incubatore

Colonnina Wizard

Valentina&Amica Provetta

Francesca&MissCentrifuga

Un ringraziamento speciale alla fondazione Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, per avere offerto a noi questa opportunità di interagire con il mondo della ricerca e con l’attività di laboratorio.

Si ringrazia, inoltre, l’ITCS “Primo Levi” per averci permesso di usufruire dei laboratori e per l’aiuto e l’assistenza dei professori.

Ed infine, grazie alla nostra scuola L.S. “G. Falcone e P. Borsellino” ed alle insegnanti Elena Bissolotti e Marzia Calci, che ci hanno avvicinato a questo nuovo mondo e che hanno creduto in noi.