Progetto Interregionale OLVIVA Bari, 6-7 Novembre 2008 Luciana BALDONI Istituto di Genetica...

Progetto Interregionale OLVIVABari, 6-7 Novembre 2008

Luciana BALDONI

Istituto di Genetica Vegetale, PerugiaIstituto di Genetica Vegetale, Perugia

PROGETTO INTERREGIONALE OLVIVA:ANALISI DELLE ATTIVITA’ IN CORSO E RISULTATI RAGGIUNTI

AZIONE 1: 'Caratterizzazione molecolare e morfologica'

Fase di monitoraggio 24 maggio 2007- 7 Settembre 2008

Analisi morfologica

Discriminazione delle varietà attraverso l’uso di un set definito e comune di descrittori morfologici stabili per tutte le cultivar

SCHEDA DI RILEVAZIONE DEI DATI MORFOLOGICI

Obiettivi di OLVIVA

Analisi molecolare

Identificazione delle varietà

Soluzione dei casi di sinonimia

Discriminazione di cloni e varieta’-popolazioni

Azione 1. Analisi morfologica e molecolare

Definizione e applicazione di un metodo di fingerprinting applicabile a livello nazionale per la certificazione genetica del materiale di propagazioneattraverso tecnologie biomolecolari


Costituzione di una rete di laboratori

Individuazione delle 200 varietà di interesse vivaistico per le regioni coinvolte nel Progetto

Raccolta dei campioni da fonte qualificata (collezioni regionali e/o di istituzioni pubbliche di ricerca)

Analisi molecolare e morfologica

Validazione dei dati

Sviluppo di una piattaforma diagnostica per il riconoscimento rapido dell’identità delle varietà di olivo più importanti

Realizzazione e gestione di un data-base comune

Attività programmate


Cultivar da analizzare per ciascuna regione

Regione Numero di varietà

Liguria 8

Toscana 20

Umbria 10

Marche 8

Lazio 20

Campania 20

Molise 8

Basilicata 10

Puglia 40

Calabria 22

Sicilia 24

Sardegna 10

TOTALE 200


Varietà di ciascuna regione

SVILUPPO DEGLI STRUMENTI DI CERTIFICAZIONE GENETICASVILUPPO DEGLI STRUMENTI DI CERTIFICAZIONE GENETICA

Laboratori di analisi molecolare

Raccolta di campioni di foglie da 2 alberi/varietà

Analisi con un set comune di 18 SSR

Verifica della ripetibilità dei risultati tra laboratori mediante RING TEST

Validazione dei dati complessivi

Laboratori di analisi morfologica

Raccolta di campioni di foglie dagli stessi alberi

Analisi dei parametri morfologici secondo la scheda di rilevazione

Raccolta di immagini digitalizzate da campioni rappresentativi di frutti e foglie


Set di marcatori SSR selezionati

1 DCA-18

2 UDO-43

3 DCA-16

4 DCA-09

5 GAPU-103

6 DCA-04

7 DCA-17

8 DCA-03

9 DCA-07

10 GAPU-101

11 DCA-14

12 EMO-90

13 DCA-15

14 DCA-05

15 DCA-13

16 GAPU-45

17 EMO-L

18 GAPU-71B

I marcatori SSR sono stati sottoposti ad una selezione preliminare basata sui seguenti criteri:

Potere di discriminazione (qualità dei segnali, assenza di bande multiple o alleli nulli, basso stuttering)

Segregazione indipendente

Informazioni di sequenza


Cultivar Liguria – P2 – SSSA-Pisa

1. CASTELNOVINA2. LAVAGNINA3. LICCIONE4. MERLINA5. MORTINA6. PIGNOLA7. RAZZOLA8. TAGGIASCA

16 campioni (2 x 8 cv) analizzati con 18 loci SSR

Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 8 cultivar liguri per la compilazione delle schede elaiografiche


Campo collezione: Campo Catalogo Regione Liguria – La Spezia

Forniti 5 campioni x Ring Test reciproco al CNR-IGV Perugia.

Cultivar Toscana P6 – Università Siena

1. AMERICANO 2. COLOMBINO3. CORREGGIOLO 4. CUORICINO5. GIOGOLINO6. GRAPPOLO7. GREMIGNOLO DI B.8. GROSSOLANA9. LECCIO DEL CORNO10. MADREMIGNOLA11. MIGNOLO12. OLIVASTRA13. ORNELLAIA14. PENDAGLIOLO15. PIANGENTE16. QUERCETANA17. ROSSELLINO18. SAN DONATO19. SAN FRANCESCO20. SCARLINESE

Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi.


Campo collezione ARSIA - Follonica

2 piante/cultivar (40 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR.

Cultivar Lazio – P10 – Università Tuscia, Viterbo

1. BROCANICA2. CANINO3. CELLAVECCHIA4. CORVA5. CROGNOLO6. MARINA7. MAURINO8. MONTANESE9. OLIVAGO10. OLIVASTRA

11. OLIVASTRO12. OLIVASTRONE13. OLIVONE DI VITERBO14. PENDOLINO15. RAJA SABINA16. REALE17. ROSCIOLA18. ROTONDA DI TIVOLI19. SALVIANA20. VALLANELLA

3 piante/cultivar (60 campioni + 5) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 10/18 loci SSR con 3 approcci: capillare, HRM e Beckman System.

Sulle stesse sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo.

Collezione Montopoli- ARSIAL


Cultivar Umbria – P3-CNR-IGV Perugia P4- Università Perugia

1. MORAIOLO2. DOLCE AGOGIA3. FRANTOIO4. LECCINO5. RAIA6. RAIO7. BORGIONA8. SAN FELICE9. NEBBIA (o BIANCHELLA)10. NOSTRALE DI RIGALI11. ROSCIOLA DI PANICALE12. TENDELLONE

1. PG01 ANT/152. PG02 BORGIONA clone 23. PG03 CMS/16A4. PG04 FRANTOIO 45. PG05 FRANTOIO 146. PG07 LECCINO 617. PG11 POCCIOLO clone 28. PG12 RAIA clone 19. PG14 TENDELLONE 1

2 pi

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Col

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A-O

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RA

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2 piante/cultivar (24 + 9 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR.


Progetto Interregionale OLVIVA

Bari, 6-7 Novembre 2008

Cultivar Marche – P3 - CNR-IGV PerugiaP5 - Università Ancona

1. RAGGIA

2. ASCOLANA TENERA

3. PIANTONE DI MOIANO

4. MIGNOLA

5. CARBO'

6. MIGNOLONE

7. SARGANELLA

8. CORONCINA

9. RAGGIOLA

10 PIANTONE DI FALERONE

2 piante/cultivar (20 campioni) sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 18 loci SSR.



Collezione ASSAM

1. ASCOLANA TENERA2. BELLA DI CERIGNOLA3. CAROLEA/OLIVONA4. CELLINA NARDÒ5. CERASELLA6. CIMA DI BITONTO7. CIMA DI MELFI8. CIMA DI MOLA9. CORATINA10. DOLCE DI CASSANO11. DONNA FRANCESCA12. DONNA GIULIETTA13. FRANGIVENTO14. FRANTOIANA15. FRANTOIO16. LECCINO17. MAIATICA18. MORAIOLO19. NOCELLARA20. NOCIARA21. NOLCA/NOCE22. OGLIAROLA23. OGLIAROLA BARESE24. OGLIAROLA GARGANICA25. OGLIAROLA LECCESE26. OLIVA ROSSA27. PASOLA28. PASOLA DI ANDRIA29. PENDOLINO30. PICHOLINE31. PROVENZALE32. RACIOPPA33. RACIOPPA LUCANA34. ROTONDELLA35. ROTONDELLA/CERASELLA36. SANT’ AGOSTINO37. SILLETTA38. SIMONE O SIMONA39. TERMITE DI BITETTO40. TOSCANINA

Cultivar Puglia – P17 Università BariP18 Università Bari

Campi collezione:

- Az. Didattico Sperimentale Valenzano – Università Bari- Campo di Pre-Moltiplicazione – Palagiano- Vivai Giannoccaro- Campi privati


2 piante/cultivar24/40 cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare con 13/18 loci SSR.

Sulle stesse piante sono stati rilevati i parametri morfologici e bio-metrici relativi all’albero e ai suoi organi: infiorescenza, foglia, frutto e nocciolo.

26 varietà2 piante/cultivar analizzate con i 18 loci SSR

Cultivar Calabria – P23 CRA-OLI RendeP22 Università di Reggio Calabria

Non sono state riscontrate differenze tra le due piante analizzate per ogni varietà, eccetto che per Imperiale, Nera di Cantinella e Tonda di Filogaso, nelle quali le due piante si differenziano tra loro per uno o due alleli.

La caratterizzazione morfologica è stata corredata da un’opportuna documentazione fotografica relativa ai principali caratteri morfologici di pianta, foglia, mignola, drupa ed endocarpo.

Forniti 5 campioni x Ring Test reciproco al CNR-IGV Perugia.

AGRISTIGNABORGESECAROLEACASSANESECICIARELLOCORNIOLADOLCE DI CERCHIARAGERACESEIMPERIALE

SANTOMAUROSINOPOLESETOMBARELLOTONDA DI FILADELFIATONDA DI FILOGASOTONDA DI STRONGOLITONDA DOLCETONDINAZINZIFARICA

MAFRANERA DI CANTINELLENOSTRANAOLIVELLA DI CERCHIARAOTTOBRATICAPENNULARAROMANELLAROSSANESE


Campo collezione di Mirto-Crosia (CS)

Cultivar Campania – P12 – Università Portici

Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 20 cultivar campane di olivo per la compilazione delle schede elaiografiche

11. SALELLA12. BIANCOLILLA13. CORNIA14. PAMPAGLIOSA15. RITONNELLA16. TENACELLA17. RUVEIA18. ASPRINIA19. FEMMINELLA20. OLIVA BIANCA

1. ROTONDELLA2. PISCIOTTANA3. ORTICE4. RAVECE5. TONDA6. CARPELLESE7. OGLIAROLA

CAMPANA8. ORTOLANA9. CAIAZZANA10.RACIOPPELLA

14/20 varietà sono state sottoposte all’analisi molecolare con 6/18 loci SSR


Campo collezione

Cultivar Molise – P13 – Università degli Studi del Molise

1. GENTILE DI LARINO2. OLIVA NERA DI COLLOTORTO3. AURINA4. ROSCIOLA DI ROTELLO5. CERASA DI MONTENERO6. SPERONE DI GALLO7. PAESANA BIANCA8. SALEGNA DI LARINO

Per ciascuna cultivar sono state scelte e contrassegnate le piante apparentemente migliori e si è proceduto al prelievo del materiale vegetale da sottoporre a caratterizzazione molecolare con 18 loci SSR

Dalle stesse piante madri delle principali cultivar di olivo molisane utilizzate per la caratterizzazione molecolare è stato prelevato materiale vegetale (foglie, frutti, fiori, ecc.) e sottoposto a caratterizzazione morfologica.


Campo collezione ARSIAM

Cultivar Basilicata – P14 Univerisità BasilicataP15 Univerisità Basilicata

Rilievi dei caratteri bio-morfologici di 10 cultivar lucane per la compilazione delle schede elaiografiche

20 campioni (2 x 10 cv) analizzati con 18 loci SSR

1. AUGELLINA2. CIMA DI MELFI3. CORNACCHIOLA4. FARESANA5. GHIANNARA6. MAIATICA7. OGLIAROLA DEL BRADANO8. OGLIAROLA DEL VULTURE9. SAMMARTINENGA10. SPINOSO


Campo collezione

Cultivar Sicilia – P24 – Università Palermo P25-CNR-IGV Palermo

24 cultivar analizzate con 15/18 loci SSR

2 piante adulte/cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare.


1. AITANA2. BIANCOLILLA3. BOTTONE DI GALLO4. BRANDOFINO5. CALATINA6. CAVALIERI7. CERASUOLA8. CRASTU9. ERBANO10. GIARRAFFA11. LUMIARO12. MINUTA

13. MORESCA14. NASITANA15. NERBA16. NOCELLARA DEL BELICE17. NOCELLARA ETNEA18. NOCELLARA MESSINESE19. OGLIAROLA MESINESE20. OLIVO DI MANDANICI21. PIRICUDDARA22. SANTAGATESE23. TONDA IBLEA24. VERDELLO


Campo collezione: ESA – Campo Carboi

Cultivar Sardegna – P3 CNR IGV Perugia P4 - Università Perugia

1. BOSANA

2. MANNA

3. NERA DI GONNOS

4. NERA DI VILLACIDRO

5. OGLIASTRINA

6. OLIEDDU

7. NERA DI OLIENA

8. PIBIREDDU

9. SEMIDANA

10. TONDA DI CAGLIARI

10 cultivar analizzate con 18 loci SSR

2 piante/cultivar sono state sottoposte a caratterizzazione genetico-molecolare.



Campo collezione: AGRIS

• DNA delle varietà di ciascuna regione;

• DNA dei 5 campioni ‘anonimi’ previsti nel Ring Test e che il P3-CNR-IGV di Perugia ha inviato a tutti gli altri laboratori;

• DNA di 3 varietà (Frantoio, Leccino e Nociara) da utilizzare come riferimento comune.

Analisi molecolare


Ciascun laboratorio ha analizzato i seguenti campioni:

Sono stati realizzati i seguenti esperimenti:

• Amplificazione PCR

• Separazione degli amplificati tramite elettroforesi su gel di agarosio o su capillare

• Trasformazione dei dati grezzi forniti dagli strumenti nelle lunghezze reali degli alleli microsatellitari (binning)

• Esperimenti di RING TEST


I dati ottenuti dai 9 laboratori sui 5 campioni ‘ignoti’ distribuiti dal P3-CNR-IGV Perugia sono confluiti presso lo stesso laboratorio, che sta provvedendo a:

• Verificare che i risultati ottenuti dai diversi laboratori sui campioni del Ring Test corrispondano tra loro e, in caso negativo, verificarne le ragioni e procedere alle azioni di correzione;

• Verificare che le lunghezze degli alleli ottenute dai diversi laboratori per le varietà di riferimento siano tutte identiche tra loro;

• Verificare che tutti i laboratori abbiano ottenuto il previsto range di alleli.

Una volta svolto questo lavoro si potrà finalmente procedere ad elaborare congiuntamente i dati delle varietà di tutte le regioni coinvolte nel Progetto, per un’analisi complessiva dei casi di identità e di similarità.

Queste attività sono in corso di realizzazione durante questa ultima fase del progetto e saranno oggetto del prossimo rendiconto.

Ring Test


Lab. 1Lab. 2Lab. 3Lab. 4Lab. 5Lab. 6

244-254243-253243-253243-243242-252244-254

Allele miscalling

Lab. 1 Vede entrambi gli alleli

Lab. 2 Vede solo allele corto

Lab. 3 Vede solo allele lungo

Allele drop out

198-200

198-198

200-200

Lab. 1Lab. 2Lab. 3Lab. 4Lab. 5Lab. 6

160-204160-204185-204160-204160-204160-204

Wrong allele Allele misinterpretation

Errori comuni nell’identificazione degli alleli


Lo stesso allele viene arrotondato a valori che differiscono tra loro di 1 o 2 basi

Catalogo delle immagini

• Raccolta di campioni rappresentativi (almeno 50) di fiori, frutti e foglie

• Conferimento ad un unico laboratorio

• Acquisizione delle immagini digitalizzate in condizioni uniformi di luce, distanza focale, sfondo, ecc.

• Analisi computerizzata dei parametri morfometrici

• Pubblicazione cartacea e online delle immagini


Aprile 2008 - Avvio in serra delle prove di valutazione della resistenza alla tracheoverticilliosi delle varietà di olivo fornite come talee autoradicate da alcune Regioni partecipanti al Progetto.

BasilicataAugellina, Cima di Melfi, Faresana, Fasolina, Fasolona, Ghiannara, Maiatica di Ferrandina, Ogliarola del Bradano, Ogliarola del Vulture e Rotondella.

LiguriaMerlina e Razzola.

MoliseAurina, Cerasa di Montrenero, Gentile di Larino, Oliva Nera di Colletorto, Paesana Bianca, Rosciola di Rotello e Sperone di Gallo.

SiciliaAbunara, Biancolilla, Bottone di Gallo, Calatina, Cavalieri, Cerasuola, Erbano, Giarraffa, Minuta, Nasitana, Nerba, Nocellara del Belice, Olivo di Mandanici, Piricuddara e Vaddarica.

P16 - Dipartimento di Biologia e Patologia Vegetale – Università Bari


Gravità dei sintomi interni (Curva di progressione della malattia nel tempo e Imbrunimento vascolare) della verticilliosi su piante di olivo di due anni di età provenienti dalla Basilicata, Liguria, Molise e Sicilia


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