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Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscana

Dott.ssa Roberta NuvoloniDip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA


Dott.ssa Roberta Nuvoloni - Dip. Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti di OA

PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI PROBLEMATICHE IGIENICO-SANITARIE LEGATE AI PRODOTTI DELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURADELLA PESCA E ALL'ACQUACOLTURA

Variabilità delle popolazioni microbiche in relazione a:- diverse realtà ambientali, stagione- composizione chimica dei tessuti- fase del ciclo riproduttivo

1) MICROFLORA INIZIALE : associata al pesce in vita, rispecchia quella ambientale.

Sulle branchie: Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Moraxella spp.;

Nell'intestino: Vibrio spp., Alcaligenes spp., Flavobacterium spp..

CBT cute e branchie: 102-104 acque fredde 103-106 acque calde




2)MICROFLORA SAPROFITICA: influenzata soprattutto dalla temperatura, mesofila o psicrofila.

3)BATTERI PATOGENI E TOSSIGENI: sui pesci in vita o contaminanti durante le fasi di lavorazione in condizioni igieniche inidonee: C. botulinum nelle conserve, Vibrionaceae e L. monocytogenes nei prodotti pronti per il consumo.



Evoluzione del profilo microbiologico di orate Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare conservate sotto ghiaccioallevate in mare conservate sotto ghiaccio

Progetto di ricerca di interesse nazionale PRIN 2004

Nuvoloni R., Pedonese F., D’Ascenzi C., Orlandi M., Gerardo B., Rindi S.



Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccio


•Valutare:Valutare:l’evoluzione nel tempo delle microflore l’evoluzione nel tempo delle microflore

associate ad orate allevate in mare, conservate associate ad orate allevate in mare, conservate per 21 giorni sotto ghiaccioper 21 giorni sotto ghiaccio

presenza di batteri potenzialmente patogenipresenza di batteri potenzialmente patogeni

7 campionamenti presso lo stabilimento “Spezzina 7 campionamenti presso lo stabilimento “Spezzina Itticoltura s.r.l.” di La SpeziaItticoltura s.r.l.” di La Spezia





3 orate analizzate subito dopo la pesca, le rimanenti 3 orate analizzate subito dopo la pesca, le rimanenti conservate sotto ghiaccio a 2conservate sotto ghiaccio a 2±2°C ed ±2°C ed analizzate dopoanalizzate dopo 3, 3, 7, 10, 14, 17 e 21 7, 10, 14, 17 e 21 giornigiorni

Per ognuno dei pesci in esame prelevati sterilmente:Per ognuno dei pesci in esame prelevati sterilmente:•Campione di cute antero-dorsaleCampione di cute antero-dorsale•Campione di muscolo stessa sede anatomicaCampione di muscolo stessa sede anatomica•Pool degli archi branchialiPool degli archi branchiali





Carica batterica totale (Plate Count Agar) 30°C per 72 oreCarica batterica totale (Plate Count Agar) 30°C per 72 ore

Batteri produttori (HBatteri produttori (H22S+) e non produttori (HS+) e non produttori (H22S-) di idrogeno S-) di idrogeno solforato (Hsolforato (H22S) (Iron Agar) 25°C per 48-120 oreS) (Iron Agar) 25°C per 48-120 ore

PseudomonasPseudomonas spp. (Pseu Agar Base+CFC) 25°C per 48 ore spp. (Pseu Agar Base+CFC) 25°C per 48 ore

AeromonasAeromonas spp. (Aero Medium Base+ Ampicillin Selective spp. (Aero Medium Base+ Ampicillin Selective Supplement) 37° per 48 oreSupplement) 37° per 48 ore

Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes (ISO 11290-1/DAM 1(ISO 11290-1/DAM 1 ))

VibrioVibrio spp. (MPN 37°C per 24 ore, TCBS2% a 37°C per 24 ore) spp. (MPN 37°C per 24 ore, TCBS2% a 37°C per 24 ore)

Profilo microbiologico di prodotti dell’itticoltura toscanaEvoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare Evoluzione del profilo microbiologico di orate allevate in mare

conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccioCUTECUTE•CBT CBT presente ad un livello iniziale di 3 Log presente ad un livello iniziale di 3 Log →→ 8,05 Log ufc/g al 21° giorno 8,05 Log ufc/g al 21° giorno•Valori analoghi o leggermente superiori per Valori analoghi o leggermente superiori per PseudomonasPseudomonas spp. spp.•Range analogo in H2S- Range analogo in H2S- •H2S+ quantità minime al giorno 0 H2S+ quantità minime al giorno 0 →→aumentano di 6 Log aumentano di 6 Log •AeromonasAeromonas spp. continua ad aumentare spp. continua ad aumentare →→incrementi ridotti incrementi ridotti

CUTE 0 gg. 3 gg. 7 gg. 10 gg. 14 gg. 17 gg. 21 gg.

CBT 3,55±0,19 3,81±0,27 4,85±0,79 5,68±0,92 7,19±0,35 7,56±0,35 8,05±0,26

H2S+ 1,63±0,99 2,28±1,17 4,29±1,00 5,54±1,10 6,11±1,76 7,14±0,87 7,11±0,98

H2S- 3,13±0,76 3,36±0,84 4,59±0,92 6,01±0,87 7,14±0,54 7,67±0,22 7,96±0,39

Pseudomonas spp.

3,46±0,69 3,76±0,79 5,35±0,92 6,60±0,49 7,73±0,40 8,24±0,40 8,30±0,53

Aeromonas spp.

2,14±0,56 2,23±0,69 2,64±0,63 3,53±0,92 4,35±0,47 4,77±0,56 4,82±0,79


conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccioBRANCHIEBRANCHIE•Andamento simile a quello della cuteAndamento simile a quello della cute•CBT raggiunge 8,11 Log ufc/gCBT raggiunge 8,11 Log ufc/g•PseudomonasPseudomonas spp. valori maggiori alla CBT spp. valori maggiori alla CBT•H2S- andamento analogo a CBTH2S- andamento analogo a CBT•H2S+ valori inizialmente bassi H2S+ valori inizialmente bassi →→aumenta di 6 Logaumenta di 6 Log•AeromonasAeromonas spp. valori iniziali leggermente superiori a quelli della cute spp. valori iniziali leggermente superiori a quelli della cute →→5,57 5,57 Log ufc/gLog ufc/g

BRANCHIE 0 gg. 3 gg. 7 gg. 10 gg. 14 gg. 17 gg. 21 gg.

CBT 3,65±0,28 4,06±0,61 4,93±0,44 5,82±0,87 7,07±1,04 7,51±0,83 8,11±0,85

H2S+ 1,97±1,06 2,86±0,77 4,90±0,90 5,98±1,65 6,86±2,16 7,09±1,99 7,19±0,82

H2S- 3,14±0,66 3,60±0,69 4,75±0,65 5,89±0,85 6,83±0,76 7,35±1,00 7,99±0,91

Pseudomonas spp.

3,54±0,34 4,12±0,44 5,70±0,71 6,93±0,54 7,67±0,87 8,30±1,05 8,29±0,81

Aeromonas spp.

2,77±1,00 2,97±0,86 3,44±0,67 4,14±1,10 4,77±0,75 5,27±0,59 5,57±0,40


conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccioMUSCOLOMUSCOLO•Muscolo parametro giudicato fondamentale per la determinazione dell’evoluzione Muscolo parametro giudicato fondamentale per la determinazione dell’evoluzione dello spoilage in rapporto alla shelf-lifedello spoilage in rapporto alla shelf-life•CBT inferiore a quella corrispondente di cute e branchie CBT inferiore a quella corrispondente di cute e branchie → → 6,04 Log ufc/g il 21° 6,04 Log ufc/g il 21° giornogiorno•PseudomonasPseudomonas spp. : sviluppo simile o superiore a CBT spp. : sviluppo simile o superiore a CBT•H2S- e H2S+ : andamento simile a cute e branchie ma valori inferiori H2S- e H2S+ : andamento simile a cute e branchie ma valori inferiori •AeromonasAeromonas spp.: presenti in quantità di diversi Log inferiori rispetto alle spp.: presenti in quantità di diversi Log inferiori rispetto allealtre categorie microbichealtre categorie microbiche

MUSCOLO 0 gg. 3 gg. 7 gg. 10 gg. 14 gg. 17 gg. 21 gg.

CBT 0,90±0,65 1,65±0,77 3,18±0,71 4,12±1,93 4,97±0,46 5,72±0,74 6,04±0,84

H2S+ 0,32±0,57 0,71±0,58 2,46±1,00 3,77±1,20 4,53±1,32 5,53±1,11 5,60±1,06

H2S- 0,72±0,61 1,27±0,46 2,37±1,46 4,11±1,17 4,98±0,58 5,72±0,73 5,95±0,82

Pseudomonas spp.

1,10±0,26 1,51±0,46 3,12±1,47 4,43±0,60 5,72±1,05 5,99±0,84 6,15±0,82

Aeromonas spp. 1,16±0,34 1,11±0,22 1,27±0,41 1,45±0,41 1,85±0,67 3,03±0,55 2,78±1,09


conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccio

• ICSFM: limite di accettabilità per i pesci freschi è 107 ufc/g

• Chang et al.: limite di accettabilità nel muscolo 106 ufc/g

• Campioni invernali (T° acque: 10,5-11°C):in cute e muscolo cariche batteriche generalmente più

basse nelle fasi finali di conservazione.



Limite microbiologico di accettabilità : 14°- 17° giorno di Limite microbiologico di accettabilità : 14°- 17° giorno di conservazione conservazione

PseudomonasPseudomonas spp. spp. Appare essere la categoria microbica Appare essere la categoria microbica

dominante, raggiungendo valori simili o dominante, raggiungendo valori simili o addirittura più elevati dei corrispondenti addirittura più elevati dei corrispondenti valori di CBTvalori di CBT

In accordo con Koutsoumanis e Nychas (1999) In accordo con Koutsoumanis e Nychas (1999) che identificano che identificano PseudomonasPseudomonas spp. come spp. come principale agente degradativo in orata e bogaprincipale agente degradativo in orata e boga


conservate sotto ghiaccioconservate sotto ghiaccioH2S +

Larga parte della microflora, aumenta di 6 log in cute e branchie e di 5 nel muscolo durante il periodo di conservazione

Possono subire l’azione competitiva di altri microrganismi come Pseudomonas spp. (Koutsoumanis et al., 1999) valori iniziali bassi



Aeromonas spp.Tra i batteri alteranti del pesce durante la

conservazione in ghiaccio svolge un ruolo anche se di entità più limitata rispetto a Pseudomonas spp. e H2S +

Non importanti solo nello spoilage Patogenesi non completamente chiara.Valori oltre 5 log nelle branchie a 21 gg di

conservazione.

All’identificazione genotipica: A.hydrophila, A.caviae



Vibrio spp.Scarsa presenza di vibrioni alofiliPresente in quantità abbastanza elevate

all’inizio del periodo di conservazione, diminuisce progressivamente fino al 21° giorno

All’identificazione genotipica: V.(Listonella) anguillarum, V. harveyi, V.rotiferianus, V.diazotrophicus, V. ordalii




Il genere Aeromonas•Bastoncelli diritti, mobili o immobili, non sporigeni, Bastoncelli diritti, mobili o immobili, non sporigeni, Gram negativi, con dimensioni di 0,3-1,0 x 1,0-3,5 Gram negativi, con dimensioni di 0,3-1,0 x 1,0-3,5 μm, anaerobi facoltativi, ossidasi positiviμm, anaerobi facoltativi, ossidasi positivi•Famiglia Famiglia AeromonadaceaeAeromonadaceae•Habitat: ubiquitario e autoctono in tutti gli ambienti Habitat: ubiquitario e autoctono in tutti gli ambienti acquatici acquatici •Specie patogene e ambientaliSpecie patogene e ambientali




Il genere Aeromonas•6 specie su 18 considerate 6 specie su 18 considerate patogenepatogene•fattori di virulenza come fattori di virulenza come emolisine, citotossine, emolisine, citotossine, enterotossine, proteasi, enterotossine, proteasi, leucocidine, fosfolipasi, leucocidine, fosfolipasi, endotossine, fimbrie endotossine, fimbrie •psicrofilia psicrofilia → → capacità di capacità di resistere e moltiplicarsi alle resistere e moltiplicarsi alle basse temperature, soprattutto basse temperature, soprattutto A. hydrophilaA. hydrophila

A. hydrophilaA. caviae

A. veronii biovar sobria

A. veronii biovar veronii

A. jandaei

A. schuberti




•l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha inserito l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha inserito AeromonasAeromonas nell’elenco degli agenti enteropatogeni nell’elenco degli agenti enteropatogeni emergenti (anni ’80)emergenti (anni ’80)•setticemia primaria e secondaria in soggetti setticemia primaria e secondaria in soggetti immunocompromessi, immunocompromessi, •serie infezioni localizzate in individui sani serie infezioni localizzate in individui sani •forme di peritonite, meningite, infezioni oculari ed forme di peritonite, meningite, infezioni oculari ed osseeossee•manifestazione più comune: la gastroenterite manifestazione più comune: la gastroenterite •meccanismi di patogenesi complessi e multi-meccanismi di patogenesi complessi e multi-fattorialifattoriali




Il genereIl genere Vibrio Vibrio•comprende 70 specie.comprende 70 specie.•Bacilli Gram negativi, diritti o curvi; Bacilli Gram negativi, diritti o curvi; •dimensioni: 0,5-0,8x1,4-2,6 µm;dimensioni: 0,5-0,8x1,4-2,6 µm;•aerobi-anaerobi facoltativi;aerobi-anaerobi facoltativi;•asporigeni;asporigeni;•mobili per flagello polare;mobili per flagello polare;•metabolismo ossidativo/fermentativo;metabolismo ossidativo/fermentativo;•ossidasi-positivi,eccetto ossidasi-positivi,eccetto V. metschnikoviiV. metschnikovii;;•crescita stimolata da NaCl, indispensabile per crescita stimolata da NaCl, indispensabile per V. V. vulnificusvulnificus e e V. parahaemolyticusV. parahaemolyticus allo 0,3%; allo 0,3%;•sviluppo tra 10° e 30°C; NaCl variabile da 5% a sviluppo tra 10° e 30°C; NaCl variabile da 5% a 30%.30%.




VIBRIONI PATOGENI:VIBRIONI PATOGENI:1)Vibrio cholerae: - - agente eziologico del coleraagente eziologico del colera- ingestione di acqua e alimenti contaminati- ingestione di acqua e alimenti contaminati- sintomatologia enterica molto - sintomatologia enterica molto gravegrave- 200 sierogruppi, antigeni O ed H (costanti)- 200 sierogruppi, antigeni O ed H (costanti)

- antigene non O1- antigene non O1: diarrea sporadica ed infezioni : diarrea sporadica ed infezioni extraintestinaliextraintestinali

- antigene O1- antigene O1 :ceppi produttori enterotossina colericaceppi produttori enterotossina colerica(classico, El Tor, O139)(classico, El Tor, O139)




VIBRIONI PATOGENI:VIBRIONI PATOGENI:2)Vibrio parahaemolyticus2)Vibrio parahaemolyticus:: - antigeni O, H, K - antigeni O, H, K - su Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar non fermenta - su Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar non fermenta glucosio, colonie verdiglucosio, colonie verdi- forme gastroenteriche per ingestione di prodotti poco - forme gastroenteriche per ingestione di prodotti poco cotti cotti o crudio crudi- D.I:105ufc/g- D.I:105ufc/g - ceppi Kanagawa positivi :Thermostable Direct - ceppi Kanagawa positivi :Thermostable Direct HemolysinHemolysin - ceppi Kanagawa negativi :TDH-Related Hemolysin- ceppi Kanagawa negativi :TDH-Related Hemolysin




VIBRIONI PATOGENI:VIBRIONI PATOGENI:

3)Vibrio vulnificus3)Vibrio vulnificus:: - produzione di citolisine, proteinasi, collagena- produzione di citolisine, proteinasi, collagena- infezione di ferite, setticemie - infezione di ferite, setticemie - talvolta forme gastroenteriche- talvolta forme gastroenteriche

4)Vibrio alginolyticus: - incerta patogenicità in forme gastroenteriche - talvolta responsabile di otiti ed infezioni di ferite




VIBRIONI AMBIENTALI:VIBRIONI AMBIENTALI:1)Vibrio harveyi:1)Vibrio harveyi: - in ambiente marino e di estuario.- in ambiente marino e di estuario.- crescita : NaCl dal 3 al 10%, tra 30°e 40- crescita : NaCl dal 3 al 10%, tra 30°e 40- gelatinasi positivo- gelatinasi positivo - patogeno per molto animali marini, epidemie ad - patogeno per molto animali marini, epidemie ad elevata mortalità in allevamenti di gamberielevata mortalità in allevamenti di gamberi

2)Vibrio (Listonella) anguillarum: - crescita tra 30° e 35°C- su TCBS colonie gialle- patogeno per i pesci, causa malattia setticemica




VIBRIONI AMBIENTALI:VIBRIONI AMBIENTALI:3)Vibrio ordalii3)Vibrio ordalii: :

-nello stesso gruppo di nello stesso gruppo di Vibrio (L) anguillarumVibrio (L) anguillarum -non cresce né a 30° né a 35°Cnon cresce né a 30° né a 35°C-non cresce in presenza di NaCl allo 0,2%non cresce in presenza di NaCl allo 0,2%-non cresce su TCBSnon cresce su TCBS



PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATEIN ORATE ALLEVATE


Nuvoloni R., Pedonese F., D’Ascenzi C., Forzale F., Gerardo B., Rindi S



PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATEPRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATEprogetto di ricerca di interesse nazionale (PRIN 2007)progetto di ricerca di interesse nazionale (PRIN 2007)

Cooperativa “ La Peschereccia s.r.l.” di Orbetello, Grosseto

Le orate sono pescate:Le orate sono pescate:• • con metodi tradizionalicon metodi tradizionali – nasse e bertovelli: – nasse e bertovelli:• • ““pesca da posta” pesca da posta” con tramagli e reti calate la sera;con tramagli e reti calate la sera;• • ““pesca ai lavorieri”, pesca ai lavorieri”, nei tre canali di comunicazione tra nei tre canali di comunicazione tra laguna e mare,sfrutta lo spostamento naturale del laguna e mare,sfrutta lo spostamento naturale del pesce;pesce;• • ““pesca delle valli venete”, pesca delle valli venete”, prevede la semina del pesce prevede la semina del pesce in laguna,quando ha raggiunto taglie adeguate, dopo in laguna,quando ha raggiunto taglie adeguate, dopo l'accrescimento in gabbie.l'accrescimento in gabbie.



PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATEPRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATE

Allevamento “Spezzina Itticoltura s.r.l.” di La Spezia :

semi-intensivo, i pesci sono allevati:semi-intensivo, i pesci sono allevati:• • in gabbie sotto costa (in-shore)in gabbie sotto costa (in-shore)• • in gabbie in alto mare (off-shore)in gabbie in alto mare (off-shore)

L'alimentazione è automatizzata, il mangime arriva L'alimentazione è automatizzata, il mangime arriva tramite condotte subacquee dai silos a terra alle gabbie.tramite condotte subacquee dai silos a terra alle gabbie.Gli avannotti sono acquistati da aziende specializzate e Gli avannotti sono acquistati da aziende specializzate e seminati in primavera.seminati in primavera.




Raccolta dei campioni

Campionamento, a cadenza settimanale, per un totale di 40 pesci prelevati sterilmente campioni di 4 matrici: •Cute•Muscolo•Branchie•Contenuto intestinale




Determinazione quantitativa di Determinazione quantitativa di AeromonasAeromonas spp spp.

diluizioni scalari in Acqua Peptonata Alcalina (APW, Oxoid)Cute, branchie e intestino: da 10-1 a 10-4

Muscolo: da 10-1 a 10-3 •omogeneizzazione con Stomacher 400 Circulator (Pbi International) •semina per spatolamento su terreno Aeromonas Agar Base + Ampicillin Supplement (Oxoid) (terreno di Ryan), per la ricerca di Aeromonas spp., con incubazione a 30°C per 24 ore




Determinazione quantitativa di Determinazione quantitativa di Aeromonas Aeromonas sppspp.

campioni dal 20% dei pesci→determinazione quantitativa anche su:

•Aeromonas Starch DNA Agar Base + Ampicillin Supplement (Biolife)•GSP Agar (Pseudomonas Aeromonas Selective Agar according to Kielwein, Glutamate Starch Phenol Red Agar) (Fluka) + Ampicillin Supplement (Oxoid)Stesse modalità di semina e incubazione




Preidentificazione di Preidentificazione di Aeromonas Aeromonas sppspp.

Crescita caratteristica sui terreni utilizzatiAeromonas Agar Base (Ryan)Aeromonas Starch DNA Agar BaseGSP AgarColonie dall’aspetto tipico → prelevate, purificate e messe in collezione a -80°C




Preidentificazione di Preidentificazione di Aeromonas Aeromonas sppspp.Test preliminari:•colorazione di Gram

•test del metabolismo ossidativo-fermentativo (O/F)

Test succesivi:•sensibilità al fattore vibriostatico O129 (Oxoid)




Preidentificazione di Preidentificazione di Aeromonas Aeromonas sppspp.Test preliminari:•colorazione di Gram•test del metabolismo ossidativo-fermentativo (O/F) Test succesivi:•sensibilità al fattore vibriostatico O129 (Oxoid) •utilizzazione del Trealosio in Phenol Red Broth Base (Difco)+ Trealosio all’1%




Preidentificazione di Preidentificazione di Aeromonas Aeromonas sppspp.Test succesivi:•sviluppo in Gelatin Agar senza cloruro di sodio

•sviluppo in Gelatin Agar al 3% di cloruro di sodio




Risultati presenza Risultati presenza di di Aeromonas Aeromonas spp.spp.Cooperativa “La Peschereccia s.r.l” di Orbetello

VALORI MUSCOLO CUTE BRANCHIE INTESTINO

MEDIA 1,00 3,14 4,12 2,22

DEVIAZIONE STANDARD

- 1,18 1,31 1,15


MEDIA 1,00 2,93 3,23 1,80

DEVIAZIONE STANDARD

- 1,47 1,95 1,59


MEDIA 1,00 2,79 3,18 1,78

DEVIAZIONE STANDARD

- 1,57 1,70 1,13




Risultati presenza Risultati presenza di di Aeromonas Aeromonas spp.spp.“Spezzina Itticoltura s.r.l.” di La Spezia

VALORI MUSCOLO

CUTE BRANCHIE INTESTINO

MEDIA 1,00 3,05 4,13 1,86

DEVIAZIONE STANDARD

- 0,74 0,71 0,96


MEDIA 1,00 2,00 3,77 1,83

DEVIAZIONE STANDARD

- 0,24 0,26 0,99


MEDIA 1,00 2,42 3,81 1,93

DEVIAZIONE STANDARD

- 0,21 0,23 1,08




Risultati preidentificazioneRisultati preidentificazione102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)

riportabili a Aeromonas hydrophila : 24 ceppi Orbetello 38 14 ceppi La Speziaossidasi positivi, aerobi-anaerobi facoltativi, resistenti al fattore vibriostatico O129, sviluppano sia in assenza che in presenza del 3% di sale (oppure in assenza ma non con il 3 % di sale), utilizzano il trealosio, crescono con colonie tipiche nei terreni colturali utilizzati.

riportabili ad Aeromonas spp.: 31 ceppi Orbetello 48 17 ceppi La Speziaprofilo tipico per la maggior parte, ma non per tutte le prove eseguite, più spesso: mancata capacità di sviluppare con colonie di aspetto tipico su uno dei terreni colturali impiegati, St o GSP, e/o mancata capacità di utilizzare il trealosio

probabili Vibrio spp.: 7 ceppi Orbetello 13 6 La Speziaceppi sensibili al fattore vibriostatico O129

non Aeromonas, non Vibrio: 3 ceppi




Risultati preidentificazioneRisultati preidentificazione102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)102 ceppi testati (64 Orbetello, 38 La Spezia)

37%

47%

13%

3%

A. hydrophila?Aeromonas spp.?Vibrio spp.?non Aeromonas non Vibrio




Risultati identificazione genotipicaRisultati identificazione genotipicaPCR genere-specificaPCR genere-specifica- estrazione con DNeasy blood and Tissue Kit (Qiagen)estrazione con DNeasy blood and Tissue Kit (Qiagen)- Primers: 5’-AGTACTTGCTACTTTTGCCG-3’ (senso) Primers: 5’-AGTACTTGCTACTTTTGCCG-3’ (senso)

5’- AAGGCCCGAAGGTCCCCT-3’ (antisenso)5’- AAGGCCCGAAGGTCCCCT-3’ (antisenso)- Condizioni di amplificazione : - Condizioni di amplificazione : -- 94 °C per 5 minuti94 °C per 5 minuti- 35 cicli: •35 cicli: • 94 °C per 1 minuto94 °C per 1 minuto • • 60 °C per 1 minuto60 °C per 1 minuto

• • 72 °C per 1 minuto72 °C per 1 minuto-72 °C per 5 minuti 72 °C per 5 minuti

- Prodotto di amplificazione atteso: 120 bpProdotto di amplificazione atteso: 120 bp




Risultati identificazione genotipicaRisultati identificazione genotipica

Su 72 ceppi sottoposti a PCR genere-specifica Su 72 ceppi sottoposti a PCR genere-specifica solo 5 sono risultati non riportabili ad solo 5 sono risultati non riportabili ad AeromonasAeromonas spp. spp.

120 bp




Determinazione quantitativa di Determinazione quantitativa di VibrioVibrio spp spp.

Diluizioni in APW fino a 10-4, seminate su Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar e Trifeniltetrazolio cloruro-TTC-Tryptone Soya Agar per spatolamento di un'aliquota di 0,2 ml. Incubazione a 30°C per 24 ore.

Determinazione qualitativa di Determinazione qualitativa di VibrioVibrio spp spp.

La soluzione madre, diluita 1:10, incubata per 24 ore a La soluzione madre, diluita 1:10, incubata per 24 ore a 30°C, poi seminata per ansata su TCBS e TSAT ed incubati 30°C, poi seminata per ansata su TCBS e TSAT ed incubati a 30° C per 24 ore.a 30° C per 24 ore.••Con il TSAT sono stati saggiati 2 pesci per ogni serie, in Con il TSAT sono stati saggiati 2 pesci per ogni serie, in totale il 20%.totale il 20%.




Preidentificazione di Preidentificazione di VibrioVibrio spp spp.

•COLORAZIONE DI GRAM:COLORAZIONE DI GRAM: i vibrioni sono Gram negativi. i vibrioni sono Gram negativi.

•ATTIVITA' OSSIDASICA:ATTIVITA' OSSIDASICA: i vibrioni risultano positivi. i vibrioni risultano positivi.

•TEST O/F:TEST O/F: I vibrioni sono O+/F+. I vibrioni sono O+/F+.

•SENSIBILITA' AL FATTORE VIBRIOSTATICO O129:SENSIBILITA' AL FATTORE VIBRIOSTATICO O129: la crescita dei la crescita dei vibrioni è inibita nell'area circostante il dischetto.vibrioni è inibita nell'area circostante il dischetto.

•SVILUPPO IN ASSENZA/PRESENZA DI NaCl AL 3%:SVILUPPO IN ASSENZA/PRESENZA DI NaCl AL 3%:I vibrioni crescono solo in presenza di NaCl, eccetto I vibrioni crescono solo in presenza di NaCl, eccetto V. choleraeV. cholerae e e V. V. mimicusmimicus..




Risultati presenza Risultati presenza di di VibrioVibrio spp spp

Cooperativa “La Peschereccia s.r.l” di Orbetello


MEDIA 1,00 2,32 3,60 1,80

DEVIAZIONE STANDARD - 0,96 1,03 1,08

VALORIMUSCOLO CUTE BRANCHIE INTESTINO

MEDIA 1,00 3,83 5,09 4,61

DEVIAZIONE STANDARD

- 1,37 1,45 1,63




Risultati presenza Risultati presenza di di VibrioVibrio spp spp

Cooperativa “La Peschereccia s.r.l” di Orbetello


MEDIA 1,00 2,81 4,24 2,25

DEVIAZIONE STANDARD

- 0,95 0,64 1,24


MEDIA 1,00 2,68 5,18 3,09

DEVIAZIONE STANDARD - 1,14 0,37 2,41




ConclusioniConclusioni

• Il muscolo è un tessuto normalmente sterile.

• La cute ha una contaminazione più elevata:•per il contatto con l'ambiente•il muco protettivo è un substrato favorevole allo sviluppo microbico

• Le branchie risultano maggiormente contaminate e: •valori elevati in “Spezzina Itticoltura” per Vibrio spp. forse per il tipo di allevamento semi-intensivo




Risultati preidentificazione di Risultati preidentificazione di VibrioVibrio spp spp

•Individuazione di ceppi riportabili a Vibrio spp..•Individuati ceppi capaci di crescere in assenza di NaCl, possibili V.cholerae e V. mimicus.•La crescita in assenza di NaCl e' stata riscontrata con una certa variabilita' anche in altre specie (V. navarrensis, V. metschnikovii, V. fluvialis, V. anguillarum, V. furnisii•Tuttavia la maggioranza dei ceppi non sono capaci di sviluppare in assenza di NaCl (V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. ordalii)




•Reg. CE 2073/2005, “Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari”: “al momento non si rileva la necessità di fissare criteri specifici per V. vulnificus e V. parahaemolyticus patogeni nel pesce e molluschi”, raccomanda l'istituzione di codici di condotta per garantire le buone prassi igieniche;

•Nota Min. Sal. 5/10/2006, relativa all'identificazione dei fattori di tossicità di V. cholerae non-O1 e non-O139, per i quali si devono ricercare i geni stn/sto, V. alginolyticus non rappresenterebbe un pericolo per i consumatori, V. vulnificus non deve superare 103 ufc/g.

•Parere ISS n° 31646 del 8/06/2005 relativo allo svolgimento di controlli microbiologici per la ricerca di V. parahaemolyticus afferma che è necessaria, dopo l'identificazione , la ricerca mediante PCR del gene ToxR ed in caso di positività, l'ulteriore ricerca dei geni TDH e TRH correlati alla produzione di tossine.



PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: PRESENZA DI VIBRIO SPP. e AEROMONAS SPP: IN ORATE ALLEVATEIN ORATE ALLEVATE

• Stiamo procedendo all’identificazione genotipica dei ceppi di

Vibrio spp.

• Tutti i ceppi dopo l’identificazione genotipica di genere verranno

inviati a Torino per l’identificazione di specie

• Sono initinere prove per verificare l’antibiotico-resistenza dei

ceppi isolati

I risultati ottenuti possono dare un contributo al monitoraggio della presenza di Aeromonas spp. e Vibrio spp. nei prodotti della pesca.



GRAZIE PER L’ATTENZIONE!!!

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