Prevenzione e riparazione del danno uditivo: cellule ... · per regredire allo stato di cellula...

Sabato 24 maggio 2014

Prevenzione e riparazione

del danno uditivo:

cellule staminali e non solo

““stato della ricerca sulla sorditstato della ricerca sulla sordità”à”

Dr.ssa Astolfi Laura

LABORATORIO DI BIOACUSTICA

Campus Biomedico Pietro d’Abano,

via G. Orus, 2b, 35128 Padova

Prof. Alessandro MARTINI

Ad oggi

Impianti cocleari

Somministrazione di farmaci

Genetica diagnostica

pratica clinica

vs

ricerca biomedica

Futuro:

Cellule staminali

Sviluppo di nuovi farmaci

Nanotecnologie

Terapia genica

ricerca biomedica

vs

pratica clinica

““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”

Laboratorio di Bioacustica Università di Padova Campus Biomedico Pietro d'Abano

1. Embryonic stem cells ,

derivano dalle cellule germinative di

embrioni di 4-5 gg

1. Iduced pluripotent stem cells ,

tessuti cellulari che sono stati ingegnerizzati

per regredire allo stato di cellula staminale

1. Adult stem cells ,

derivano dai tessuti adulti


CELLULE STAMINALI


1. Cellule staminali

sono state identificate

nell’organo vestibolare di

ratto

2. E nel nervo cocleare

di Guinea pigs e uomo


CELLULE STAMINALI


3) SOMMINISTRAZIONE SISTEMICA (IV) DI CELLULE STAMINALI (HCBSCS)

1) MODELLO ANIMALE: 70 topi NOD-SCID di 2 mesi di età(Charles Rivers, Laboratories Clinical, UK)

AMINIGLICOSIDI (Kamicina: 700 mg\kg\48 hrs x14gg)

RUMORE (105 dB SPL; 4 hrs)2) DANNO :


CELLULE STAMINALI


MHC di II° classe sono espressi in alcuni

precursori mieloidi, in alta percentuale nei

monociti/macrofagi, in cellule di langerhans

della cute

Sensibilità della PCR HLA-DQa1:

Analisi Molecolare (PCR) : HLA-DQ


CELLULE STAMINALI


LIVER

COCHLEA sv

HOMING E INTEGRAZIONE NEL TESSUTO

CentromeriCentromeri

umaniumani

CentromeriCentromeri

murinimurini

FISH (DUALFISH (DUAL--COLOR)COLOR)


CELLULE STAMINALI


MODELLO ANIMALE: RATTO

PREVENZIONE DAL DANNO DA RUMORE

VERIFICA DELLA FUNZIONE UDITIVA:

ABR thresholds



OTOTOSSICITÀ DEL CISPLATINO

MODELLO ANIMALE: RATTO

TRATTAMENTO: IP 16 mg/kg



CISPLATINO (CONTROLLO POSITIVO) DEXAMETASONE + CISPLATINO

Effetto PROTETTIVO

del DEXAMETASONE

nei confronti del

CISPLATINO

-20

-10

0

10

20

30

40

50

Controllo Cpt A-QTER + Cpt A-QTER

Spostamento di soglia (dB SPL)

CLICK

2KHZ

4KHZ

8KHZ

16KHZ

32KHZ**

****

Effetto PROTETTIVO

del Coenzima Q10

nei confronti del

CISPLATINO

PREVENZIONE DAL DANNO OTOTOSSICO““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”


COME APPLICARE I FARMACI

via INTRA-TIMPANICA

IMPIANTO COCLEARE

via INTRA-COCLEARE

APPLICAZIONE DIRETTA

CONIUGATI A NANOPARTICELLE



APPLICAZIONE DIRETTA e IMPIANTI COCLEARI

Progetto:EVALUATION OF THE CAUSES OF COCHLEAR DAMAGE AFTER IMPLANTATION AND THE PROTECTIVE CAPACITY OF A DEXAMETHASONE-RELEASING ELECTRODE

MODELLO ANIMALE

GUINEA PIGS

IMPIANTO BILATERALE

COCLEOSTOMIA

RILASCIO DEL FARMACO

HPLC - MS

CAPACITÀ UDITIVA

Compound Action Potential

DANNI TISSUTALI

ISTOLOGIA



y = -0,038ln(x) + 0,1761R² = 0,8668

-0,01

0,04

0,09

0,14

0,19

0,24

0,29

0,34

0,39

0,44

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

De

xa-

rele

ase

(µ

g)

days

1 rod in 2 mL 2 rods in 2 mL

1. Trauma da inserzione

2. Infiammazione acuta

3. Infiammazione cronica1

2

3

APPLICAZIONE DIRETTA e IMPIANTI COCLEARI ““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

post op day3 day7 day14 day30

SOFT vs 2T & DEXAMETHASONE vs NEGATIVE CLICK THRESHOLD-SHIFTS

negative soft rod dexametasone soft rod negative 2T rod dexametasone 2T rod



CRESCITA DI TESSUTO FIBROSO

Scale bars= 200μm

SOFT 30 days SOFT 60 days

NON

ELUTING

RODS

ELUTING

DEXAMETHASONE

RODS

SOFT 30 days SOFT 60 days

SCALA TIMPANICA COCLEOSTOMIA



SOFT 60gg MODIOLUS

** **** ****

**********

C.I. mal posizionatoC.I. corretto



A questo proposito siamo coinvolti in un

progetto europeo, NanoEar,

il quale prevede di testare più tipi di nanoparticel le

incluse in dendrimeri, micelle o lipidi o complessi

polimerici, per costruire un tipo di

NAOPARTICELLA MULTIFUNZIONALE

in grado di rilasciare molecole

in tessuti specifici dell’orecchio interno

FARMACI CONIUGATI A NANOPARTICELLE ““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”


L’utilizzo delle NPs per la diffusione dei farmaci permette di avere

Aumento della solubilità

Aumento della biodisponibilità

risposta terapeutica più veloce

diminuire le dosi da somministrare



USO DI NPs COME DELIVERY SYSTEM

Elisa Corbacella, Alessandro Martini e Ilmari Pyykko (2011). Il rilascio di farmaci nell’orecchio interno basato sulle Nanotecnologie

In: Nano & Biotech in Audiologia e Otologia, a cura di A. Martini e G. Paludetti. ISBN 978 88 7241

HeLaEGFP/HBPL-Texas Red

OC-k3 Qdot



Vettori di trasporto• Virus (es. retrovirus, adenovirus)

• Liposomes

• siRNA

• Sistemi trasponibili

TERAPIA GENICA““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”


VETTORI VIRALI• Retrovirus

• Adenovirus

• Adeno-associated virus

• Herpesvirus

• Poxvirus

Svantaggi:

• Piccole dimensioni dei geni da trasferire

• Sicurezza

• mutagenesi

• lmmunogenicità/potenziale infiammatorio

Vantaggi:

• Integrazione stabile del

gene



APPLICATA all’orecchio internoTERAPIA GENICA““STATO DELLA RICERCA SULLA SORDITSTATO DELLA RICERCA SULLA SORDITÀ”À”


VANTAGGI• Disegno versatile• Non-immunogenic e non-tossici

• Prodotti farmaceutici ben caratterizzati e rirpoducibili

SVANTAGGI• No integrazione nel genoma ospite• Possibili ripetizioni di somministrazione

VETTORI NON VIRALI

• Liposomes=lipoplexes

• Polycations=polyplexes

• siRNA

Liposomes=lipoplexes



Efficienza di co - Transfection in hearing fetal ste m cells

Modello in vitro hFASC stem cells con Sleeping Beauty transposable system

IN VITRO efficienza di trasfezione

Laura Astolfi, Valeria Guaran, Alessandro Martini (2011)Terapia genica per l’orecchio interno: presente e f uturo

In: Nano & Biotech in Audiologia e Otologia, a cura di A. Martini e G. Paludetti. ISBN 978 88 7241



FUTURE APPLICAZIONI

P19 –

neurons

T.S.T.S.

-con STEM CELL

in protocolli ex-vivo

verifica dell’integrazione

verifica di dove e come agiscono

- Nuovi SISTEMI DI TERAPIA GENICA

no virus

Integrazioni stabili

differenti target cells



PROSPETTIVE FUTURE



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