HPLC(High Performance Liquid Cromatography)

L' HPLC, ovvero la cromatografia liquida ad alte prestazioni (o ad alta

pressione) è una tecnica analitica cromatografica che serve per

separare i componenti di una miscela omogenea, in particolare per le

sostanze che non possono essere separate utilizzando la

gascromatografia, quindi per le sostanze non vaporizzabili (ad esempio

le sostanze termolabili, ovvero che si alterano con le alte temperature,

come gli amminoacidi e le proteine), quindi il discriminante per la

separazione dei componenti della miscela sarà l' utilizzo non della

temperatura, ma delle alte pressioni.

HPLC

La strumentazione per l'

HPLC è costituita da

vari moduli

Il primo modulo è costituito da un sistema di pompaggio del campione,

che, grazie a una pompa meccanica a pistone, aspira l' eluente e lo

spinge all'interno del loop e della colonna;

nel primo modulo è possibile regolare il flusso dell' eluente.

Il loop è la camera di iniezione in cui il campione viene iniettato

Per iniettare il campione, posizionare il loop su "inject", inserire il

campione con la siringa, chiudere il loop posizionandolo su "load" ed

estrarre la siringa; poi, premere "mark" sul secondo modulo, in modo

che lo strumento possa leggere i dati.

Le sostanze del campione, insieme all' eluente, vengono spinte

all'interno della colonna, dove arrivano tutte insieme, ma in base alla

diversa affinità che le varie sostanze (dovuta al differente peso

molecolare e ad altre caratteristiche chimico-fisiche delle sostanze

stesse) hanno con la fase fissa adsorbente presente all'interno della

colonna, le varie sostanze vengono più o meno trattenute, uscendo

quindi con tempi differenti tra loro.

Il secondo modulo dello strumento è costituito da un rivelatore UV dove,

al passaggio delle diverse sostanze in uscita dalla colonna, ne rileva la

presenza; le sostanze, successivamente, escono dal rivelatore e

vengono raccolte in un recipiente.

Il terzo modulo è costituito da un altro rivelatore, in questo caso un

rivelatore a indice di rifrazione, che però non utilizziamo.

Il quarto modulo è costituito da un ADC (Analogic Digital Converter),

che ha la funzione di convertire il segnale, proveniente dal rivelatore,

da analogico a digitale.

Il segnale, successivamente, viene rielaborato, riprocessato da un

software dedicato (ChromNAV, in questo caso), che consente di

calcolare varie grandezze che caratterizzano il cromatogramma, come

l'area dei picchi (e quindi la concentrazione delle varie sostanze) e i

tempi di ritenzione di ogni sostanza.