Pesticidi Microbiologici Il controllo biologico degli insetti nocivi non é frutto di un’idea recente: esso risale molto addietro nel tempo, quando già gli antichi cinesi immettevano nei silos le formiche di Pheroas per combattere gli insetti che danneggiavano i raccolti. La mancanza iniziale di fondamenti teorici ha senz’altro rallentato l’affermarsi di questo metodo di lotta contro gli insetti nocivi. I preparati a base di pesticidi chimici, che presentano elevata efficacia unitamente a facile modalità di applicazione e pertanto in un primo tempo hanno arrestato lo sviluppo dell’alternativa biologica, con la continua introduzione di materiali estranei all’ambiente stanno provocando effetti indesiderati. Per questo motivo molti ricercatori cercano nuove soluzioni fra gli organismi in presenza dei quali l’uomo si é evoluto. La coesistenza non implica che non vi sia rischio di tossicità, ma solo che vi deve essere necessariamente un modus vivendi che si é stabilizzato da molto tempo, e suggerisce che vi possono anche essere dei rischi inerenti al sistema di controllo degli insetti dannosi che sono già stati collaudati dalla natura. Anche l’instaurarsi di resistenze degli insetti ai pesticidi chimici sta diventando un problema: pertanto in molti settori agricoli gli insetticidi microbici offrono una potenziale alternativa, complementare a quella dei pesticidi chimici, sempre che i costi permettano di ampliarne la diffusione commerciale. Lotta biologica contro gli insettiIl controllo microbiologico degli insetti usa microrganismi patogeni, portatori di malattie degli insetti, microrganismi che vengono isolati durante epidemie naturali. Di solito queste epidemie si sviluppano solo quando la densità di popolazione degli insetti é elevata, e di norma dopo che i raccolti hanno già subito danni notevoli. Se le epidemie vengono indotte quando la popolazione degli insetti é a bassa densità, esse provocano la diminuzione degli individui presenti al tempo dell’applicazione, impedendone la proliferazione. Dal punto di vista funzionale, i microrganismi associati agli insetti possono essere classificati in diversi gruppi: simbionti, patogeni, non patogeni, commensali, senza effetti. Per la lotta biologica si prendono principalmente in esame i simbionti e i patogeni. A.Simbionti: Batteri, rickettsie e lieviti microsimbionti vengono trasmessi dall’ospite agli insetti per contaminazione delle uova. Koch ha dimostrato che per un normale ricambio gli insetti ospiti hanno bisogno di simbionti, e su questo fatto si sono basate le indicazioni per la lotta biologica contro determinati insetti. Infatti i simbionti essenziali possono essere aggrediti con antibiotici , ma questo metodo ha delle limitazioni dovute allo sviluppo di ceppi antibiotico resistenti. Per questo motivo sembra più conveniente attaccare gli insetti con metodi biologici, ad esempio con i fagi. B.B.Microrganismi patogeni: In questa categoria si considerano non solo i microrganismi, ma anche i virus capaci di indurre malattie negli organismi che li ospitano. Per essere classificati come patogeni gli agenti isolati dall’organismo malato devono essere capace di indurre la stessa malattia nell’organismo sano. Finora sono stati giudicati patogeni per gli insetti circa 300 tra virus, protozoi e funghi, oltre a 50 batteri e rickettsie. Fra questi i funghi sono in grado di attaccare anche forme di vita non larvali, mentre gli altri attaccano l’insetto solo nello stadio di vita giovanile. C. Nella sua forma vegetativa, Bacillus Thuringiensis è solo debolmente tossico contro gli insetti, ma durante la sporulazione produce un cristallo di protossina proteica (corpo parasporale), che agisce come un insetticida microbico . Solo gli insetti che hanno un tubo digestivo con pH sufficientemente basico solubilizzano la tossina che distrugge il loro epitelio intestinale. Il contenuto del tubo digestivo passa nel sangue, provocando la morte dell’individuo. Des virus : Interessano particolarmente tre tipi di virus: suelli della poliedrosi citoplasmatica, quelli della poliedrosi nucleare e i virus della granulosi. Da qualche anno un baculovirus geneticamente modofocato produce una potente tossina di scorpione, attiva contro le larve di insetti. La tossina virale agisce nel tubo digerente Des mycètes : Più di cinquecento miceti sono associati ad insetti L’infezione avviene attraverso la cuticola dell’insetto. Beauveria bassiana è utilizzata contro la dorifora della patata ; Metarhizium anisopliae contro un parassita della canna da zucchero ; Verticillium lecanii contre i pidocchi delle piante… A seconda del tipo di microrganismo, si attua di preferenza una via di ingresso: 1.I virus, le rickettsie, i protozoi e i batteri di solito infettano per via perorale, cioé per ingestione: poiché la sensibilità dell’individuo diminuisce con il crescere del peso e dell’età, una malattia prodotta dagli agenti suddetti può essere diffusa con contagio soltanto negli stadi di vita più giovanili. Inoltre gli organismi infestanti restano prigionieri dell’ospite anche dopo la morte, fino alla sua dissoluzione. 2.I funghi invece, oltre ad essere efficaci anche in stadi di vita più avanzati, hanno la possibilità di agire anche per via percutanea: Infatti le loro ife possono penetrare attraverso lo scheletro chitinoso degli insetti adulti, scheletro che di solito evita il contagio con altri patogeni. Inoltre i funghi producono internamente all’ospite delle ife che escono in direzione inversa a quella in cui ha avuto luogo l’infezione e formano all’esterno dei miceli appariscenti: nel caso di funghi imperfetti nella parte terminale del micelio si sviluppano conidiofori e conidiospore3.Una terza via di infezione é la trasmissione alla discendenza per contaminazione delle uova, come nel caso dei simbionti. Questo accade specialmente per i patogeni obbligati degli insetti.

MECCANISMI DI DIFESA I meccanismi di difesa degli insetti dai patogeni sono diversi da quelli dei vertebrati: a volte la differenza é totale, a volte solo parziale. � La principale barriera esterna alle infezioni é costituita dallo scheletro chitinoso. �All’ interno invece la protezione é costituita dalla parete intestinale (barriera intestinale), che é permeabile solo a certi patogeni. �Se i germi penetrano nell’emocele, si mobilitano delle sostanze di difesa e dei fagociti, ma non si formano anticorpi come nei vertebrati. L’immunità individuale nell’insetto non ha alcuna importanza pratica, mentre si può manifestare una resistenza di popolazione o di ceppo selezionato sia verso i patogeni che verso le loro tossine. �

Classificazione dei microorganismi entomopatogeni: A) I protozoi : I più importanti tipi di protozoi patogeni per gli insetti sono i microsporidi, che sono patogeni obbligati, polifagi. In confronto ad altri agenti patogeni, i microsporidi hanno avuto poco successo perché presentano difficoltà di coltivazione e di conservazione. Se si potessero manipolare più agevolmente sarebbero utilissimi come fattori di regolazione di popolazioni dannose. Questo obiettivo per ora é stato raggiunto solo dagli insetti con infestazione permanente ( passaggio germinale). B)I virus: Interessano particolarmente tre tipi di virus : •I virus delle poliedrosi citoplasmatiche, •I virus delle poliedrosi nucleari •I virus delle granulosi I baculovirus sono una famiglia di virus in grado di infettare una grande varietà di artropodi ed in particolar modo le larve di Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Neuptera, Siphonoptera, Thysanura e Trichoptera. Il nome baculo è riferito alla forma bastoncellare del capside di queste particelle virali. All’interno del capside il DNA è condensato in una struttura nucleoproteica. Da qualche anno, un baculovirus modificato geneticamente produce una potente tossina di scorpione, attiva contro le larve di insetti. I virus sono dissolti nel tubo digerente dove la tossina può agire. I virus poliedrici sono attivi per molti anni e sono danneggiati solo dai raggi solari e dalle alte temperature, mentre non risentono di condizioni ambientali sfavorevoli, come variazioni drastiche del tasso di umidità. I miceti: I generi più importanti di funghi entomopatogeni sono rappresentati da Beauveria, Metharryzium, Enthomophtoracee, Coelomyces. I primi due sono costituiti da funghi imperfetti , vale a dire che non sono noti i corpi fruttiferi principali. Sono relativamente specifici come entomopatogeni, e pertanto si raccomanda di usarli in habitat estremamente limitati con particolari caratteristiche ecologiche. Le Entomophtoracee, altamente specifiche per quanto riguarda l’ospite, sono responsabili delle epidemie autunnali delle mosche domestiche (Entomophora musci) e delle larve di nottuidi quali Panolis flammea, Agrotis segetum. I conidi di Entomophtora sono molto delicati e non si sono trovate ancora le condizioni di germinazione adatte per le spore. La commercializzazione é ostacolata dal fatto che, essendo patogeni obbligati, hanno notevoli esigenze ecologiche. I Coelomyces sono funghi che vivono in acqua e aggrediscono pressocché solo le larve dei nematodi (Anopheles, Aedes, Culex). Per quanto riguarda gli ospiti, la loro selettività é variabile. Alcuni funghi utilizzabili per la lotta biologica sono: Spicaria farinosa (fungo imperfetto) e i Cephalosporius sp.p. L’uso di fungicidi in operazioni fitosanitarie può pregiudicare l’impiego di funghi entomopatogeni: popolazioni di insetti dannosi che sono stati tenuti sotto controllo con entomopatogeni, possono aumentare in misura considerevole in seguito a trattamenti fungicidi. I Batteri: Sono entomopatogeni sia batteri sporigeni che non sporigeni, ma le spore sopportano meglio sia l’applicazione a spruzzo che la permanenza in campo. I batteri non sporigeni sono patogeni facoltativi di alcuni insetti (Locusta migratoria), ma se vi sono le condizioni per un’epidemia gli sporigeni hanno migliori possibilità di applicazione. Nel genere Bacillus rivestono particolare interesse il Bacillus popilia e il Bacillus thuringiensis. Il Bacillus popilia é stato usato con successo contro le larve della Popilia japonica. Le larve di Popilia danneggiano i prati e gli adulti distruggono il fogliame degli alberi da frutto. Il Bacillus popiliae deve essere riprodotto nel suo ospite originale perché solo così forma spore virulente. I preparati a base di spore sono stabili e durano per anni. Il B. popiliae ha efficacia limitatamente alle varietà di scarabeo: la varietà melolonthae può essere usata per le larve di maggiolino. . Il Bacillus thuringiensis agisce come insetticida sulle larve di lepidottero, ma alcuni ceppi hanno attività anche nei riguardi di Ditteri e Coleotteri. Nella sua forma vegetativa, è solo debolmente tossico contro gli insetti, ma durante la sporulazione produce un cristallo di protossina proteica (corpo parasporale), che agisce come un insetticida. Questi cristalli , ingerit i dagli insetti insieme al cibo, si dissolvono nell’intestino medio dell’insetto, se è sufficientemente basico, e rilasciano proteine dal P. M. medio di 65 - 160 Kd. Queste, ad opera di proteasi, liberano dei frammenti più

piccoli e tossici, in quanto distruggono le cellule epiteliali della superficie intestinale del bruco, provocando paralisi e morte. A seconda della dose ingerita, i bruchi cessano di alimentarsi entro 15’ dall’ingestione e muoiono dopo 3 - 5 giorni, perchè Le diverse varietà di Bacillus thuringiensis producono varie tossine, di cui le più note sono: l’ αααα-esotossina, (termolabile), la ββββ-esotossina o Turingiensina (termostabile) e la γγγγ-endotossina, di gran lunga la più importante. La Turingiensina é attiva anche per insetti che non hanno intestino basico, ed é stata usata contro le mosche domestiche; presenta però una leggera tossicità anche per i mammiferi, per cui, ad eccezione della Finlandia, nessun Paese occidentale ha immesso sul mercato prodotti commerciali contenenti la ββββ-esotossina. In Russia sono coltivate varietà ad elevata espressione di Turingiensina, mentre in Cecoslovacchia si lavora per produrre una molecola modificata priva delle caratteristiche negative, consistenti principalmente in una sospetta azione mutagena. Le tossine insetticide del Bacillus thuringiensis sono altamente specifiche e rappresentano una interessante alternativa agli agenti chimici di controllo. La loro commercializzazione però é limitata dagli alti costi di produzione e dalla loro scarsa stabilità in campo aperto. Hanno avuto anche in Italia diffusione commerciale. Sono molto attive le ricerche genetiche: ricercatori belgi hanno usato il trasferimento mediato dal T - DNA del plasmide di Agrobacterium tumefaciens per esprimere geni chimerici di questa tossina in piante di tabacco, per conferire alle piante la capacità di difendersi dai lepidotteri, che è trasmessa anche alla discendenza. Ricercatori americani hanno invece trasferito il gene codificante per la protossina in Pseudomonas fluorescens che, contrariamente al B. thuringiensis, efficace solo sulla superficie del terreno, cresce sottoterra in associazione con le radici delle piante. così si é pensato di rendere Pseudomonas fluorescens efficace contro gli insetti sotterranei. Un altro gruppo americano, sfruttando il normale scambio di materiale genetico che avviene in natura tra batteri, ha prodotto un ceppo geneticamente alterato di Bacillus thuringiensis, la cui tossina é attiva anche contro insetti che attaccano i raccolti di cotone. L’ efficacia della tossina é legata, oltre che al pH dell’intestino , anche al modo di alimentarsi dell’insetto: se questo si nutre solo in superficie, ingerisce rapidamente una dose letale di tossina; se invece si addentra subito all’interno del frutto, ad esempio, la dose di tossina ingerita non é sufficiente a provocare la morte. Per questo, si sono aggiunti alle spore di Bacillus th. degli “appetenti”, sostanze cioé che inducono l’insetto ad indugiare in superficie per nutrirsi. Finora non si é verificato alcun danno né per l’uomo né per l’ambiente in conseguenza dell’uso di Bacillus th., uso che é ammesso su tutte le colture eduli anche il giorno stesso del raccolto. I preparati commerciali vengono ovviamente controllati per escludere la presenza di ββββ-esotossina e di microrganismi patogeni per l’uomo. La resistenza agli insettiNel genoma di un comune batterio del suolo, il Bacillus thuringiensis, è presente un gene che contiene l’informazione per la sintesi della proteina Cry , una delta-endotossina. Questa proteina è in grado di legarsi selettivamente a specifici recettori, localizzati nell’epitelio intestinale delle larve di alcune specie di insetti. Il legame della proteina con i recettori provoca la formazione di pori catione-specificici che, distruggendo il flusso ionico dell’epitelio intestinale, portano alla morte le larve in pochi giorni. Esistono diversi tipi di proteine Cry (per esempio la Cry3A, la Cry1Ab, la Cry9c etc.), prodotte da differenti sottospecie di Bacillus thuringiensis, che esibiscono una elevata specificità di azione nei confronti dei diversi tipi di insetti. Questa specificità è attribuita alla presenza di specifici recettori nelle specie di insetti target. Per conferire il carattere di resistenza nei confronti di un particolare tipo di insetto ad una specie vegetale è sufficiente introdurre nel suo genoma il gene che codifica per la tossina Cry specifica per quell’insetto. In tal modo la pianta sarà in grado di produrre la proteina Cry, che esplicherà la sua funzione bioinsetticida quando l’insetto dannoso attacca la pianta cibandosi dei suoi tessuti. Sulla superficie delle cellule intestinali dei mammiferi non sono presenti recettori per le tossine Cry e quindi gli animali e l’uomo non sono sensibili all’azione di queste proteine. E) FunghiSi trovano funghi entomopatogeni in tutti i gruppi tassonomici, ma la maggior parte di specie utili a questo scopo si trova nei deuteromiceti (Monilia e Sphaeropsidales) e ficomiceti. I deuteromiceti hanno destato molta attenzione principalmente a causa del loro facile accrescimento “in vitro”. Molte specie sono già commercializzate come insetticidi; diversamente dai batteri, i funghi infettano gli insetti non solo attraverso l’apparato boccale e l’intestino, ma attraverso la cuticola. Essi sono pertanto insetticidi di contatto, non veleni per ingestione. L’invasione dell’ospite avviene tramite rottura della cuticola ad opera di una miscela di lipasi, proteasi e chitinasi. Gli entomopatogeni, dopo invasione dell’ospite, possono produrre tossine. In ambiente umido i funghi sporulano sul cadavere, sia immediatamente prima che l’insetto muoia, che subito dopo. Le spore sul corpo dell’insetto possono allora infettare insetti sani. Questa capacità dei funghi di produrre epidemie (chiamate epizootiche) é uno dei vantaggi chiave del loro uso come agenti antinsetti

Il principale svantaggio invece é il ristretto intervallo di condizioni ambientali e climatiche adatte al loro impiego: quasi tutti richiedono elevata umidità e temperature moderate: un esempio é dato dal Vertalec (Verticillium lecanii, Tate & Lyle Company), che richiede un’umidità dell’85% per 10-12 h e temperature comprese fra i 15° e i 20°C. Ne consegue che il loro impiego é limitato alle serre.

L’interesse scientifico e la produzione commerciale dei patogeni microbici viene determinato dal grado di polifagia dei microrganismi in esame. Vengono studiati in prevalenza microrganismi che hanno un largo spettro di ospiti possibili e grande capacità di accrescersi su mezzi artificiali. Lo studio e l’applicazione commerciale sono stati ampiamente limitati dalla loro natura parassitica obbligata, che potrebbe definirsi come una richiesta di condizioni biochimiche ed ambientali altamente specifiche. Infatti un certo numero di entomopatogeni viene coltivato mantenendo i microrganismi su insetti viventi, per infezione incrociata. Questo non ha impedito la commercializzazione di almeno un insetticida virale e dell’insetticida batterico Doom (B.popiliae e B.lentimorbus) e di altri, ma ha impedito la sperimentazione su larga scala e la commercializzazione di un gran numero di funghi estremamente virulenti. Inoltre la produzione commerciale é preclusa se il fungo non cresce, o, se cresce, non sporula spore vitali o altre strutture di sopravvivenza in mezzi liquidi. Coltivati su mezzi artificiali i funghi possono perdere virulenza, decrescere in patogenicità o subire una riduzione della sporulazione.

Influenza degli entomopatogeni sugli insetti utili:Uno degli interrogativi principali che si pongono al momento dell’uso di un preparato a base di entomopatogeni é relativo all’effetto sugli entomofagi e sugli insetti utili, come possono essere le api o il baco da seta. Il B.thuringiensis provoca la morte delle larve del baco da seta, per cui in Giappone e in Cinas, dove la coltura serica é praticata in modo intensivo, viene usato solo in casi di estrema necessità e in zone ben lontane dagli allevamenti. Per le api invece é assolutamente innocuo, per cui i trattamenti si possono fare anche nel periodo di volo di questi imenotteri, e innocuo é anche per formiche e altri insetti predatori e parassiti, per cui i nemici di questi possono evolversi tranquillamente.. I virus poliedrici hanno elevata specificità rispetto all’ospite: il baco da seta é immune dalle virosi che attaccano gli altri lepidotteri e le api da quelle che attaccano altri imenotteri. Le Entomophtoracee sono molto specifiche, al contrario dei funghi imperfetti , il cui uso può essere rischioso per gli insetti utili, parassiti e predatori. L’opportunità dell’uso di tali preparati deve essere valutata con estrema attenzione. Aspetti igieniciQuale possa essere l’influenza di preparati entomopatogeni sui vertebrati e in particolare sull’uomo é

un problema che richiede una attenta valutazione. I funghi imperfetti presentano un’ampia gamma di tossicità, dall’innocuità fino a specie patogene per gli animali superiori. I protozoi entomopatogeni non sembrano essere dannosi per l’uomo. Per quanto riguarda i batteri non si hanno dati sufficienti per Bacillus popiliae, mentre su Bacillus thuringiensis si possiede una gran massa di dati e tutti ne dimostrano l’assoluta innocuità per l’uomo. Due entomopatogeni non sporigeni sono la Pseudomonas aeruginosa e la Serratia marcescens, entrambi potenzialmente tossici per l’uomo (infettano le ferite), per cui il loro uso é accettabile con riserva. I virus poliedrici entomopatogeni sembrano essere assolutamente innocui per l’uomo. Sui virus senza corpo di inclusione non si hanno ancora dati certi.