Ossidoreduttasi con coenzima flavinico · sulla ossidoriduzione delle unità bicarboniose, con...

Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 1

Ossidoreduttasi con coenzima flavinico

Un altro gruppo di ossidoreduttasi che dipendono da una vitamina sono quelle che dipendono dalla vitamina B2.La vitamina B2 è la riboflavina, che viene sintetizzata solo dalle cellule vegetali e da alcuni procarioti: tutti gli altri organismi sono eterotrofi, ossia dipendenti dalla vitamina B2.

La struttura di base è l’eterociclo dell’ISOALLOSSAZINA.

L’isoallossazina si può immaginare come la condensazione di 2 anelli eterociclici (pirimidina e piperazina) e 1 omociclo (nucleo benzenico).

Omociclobenzenico

Piperazina

PirimidinaN10

N1

N5

N34

29

6

8

7


Vitamina B2

Nella forma naturale della vitamina la porzione pirimidinica è sostituita (come nell’uracile) nelle posizioni 2 e 4 da due funzioni ossigenate. L’equilibrio è totalmente spostato nella forma lattamica.Il nucleo benzenico è totalmente aromatizzato, il nucleo piperazinico è anch’esso in forma lattamica e si hanno ulteriori sostituzioni:In 7 e 8: sostituzioni metilicheIn 10: catena polialcolica a 5 atomi di carbonio del ribitolo, ottenibile dal riboso per idrogenazione. Forma ridotta = vitamina B2

N NH

NH

NH

O

O

OH

OH

OH

OH

CH3

CH3

H

H

H

HH


Vitamina B2

La possibile comparsa di ulteriori insaturazioni e l’equilibrio tra forma lattamica e lattimica fa sì che questa struttura possa funzionare da CROMOFORO (ha colorazione gialla).

Quando viene assunta da un organismo eterotrofo o dopo la biosintesi in un autotrofo, la B2, per poter diventare coenzima, deve venire MARCATA PER FOSFORILAZIONE. Gli enzimi responsabili di questa marcatura sono transferasi ( o CINASI) che hanno nel sito catalitico un metallo di transizione che destabilizza il legame pirofosforico, formando un fosfato-catione che può dare attacco elettrofilo sui gruppi alcolici, in questo caso sul gruppo alcolico primario 5’ del ribitolo.


Flavinmononuleotide (FMN)

N NH

NH

NH

C

C

C

O

O

C

OH

OH

OH

H2C

CH3

CH3

H

H

H

HH

P

O

O-

O-

O5’La fosforilazione produce un composto

dove non è presente un vero saccaride ma un prodotto di trasformazione di un saccaride per riduzione. Inoltre è presente un gruppo fosforico e un eterociclo azotato (particolare base azotata): si può quindi definire un NUCLEOTIDE, il flavinmononucloetideo FMN.Questo composto è già coenzima di molte ossidoreduttasi flaviniche che nelle cellule eucariotiche hanno distribuzione EXTRAMITOCONDRIALE. Flavinmononuleotide (FMN)


FAD (flavinadenildinucleotide)

N NH

NH

NH

C

C

C

O

O

C

OH

OH

OH

H2C

CH3

CH3

H

H

H

HH

P

O

O-

O-

O

Il secondo tipo di coenzima flavinico (FAD) si ottiene per intervento di una reazione a cui partecipa l’ATP. Il promotore della costruzione del FAD è un ENZIMA MANGANESE-DIPENDENTE: Il Mn destabilizza il legame pirofosforico tra i fosforili α e β, ne promuove la scissione con la comparsa di un catione sul fosforile α. Il catione subisce attacco nucleofilo da parte dell’ossigeno del fosforile dell’FMN.

FMN

N

N

N

N

NH2

OO

OHOH

P

O

OH

P

O

O

OH

OH

OH

O

O

P+

α

Mn-Enzima


FAD: (flavinadenildinucleotide)

N NH

NH

NH

C

C

C

O

O

C

OH

OH

OH

H2C

CH3

CH3

H

H

H

HH

P

O

O

O-

ON

N

N

N

NH2

OCH2O

OHOH

P

O

OH

Il FAD è composto da due nucleotidi: FMN e AMP.


FAD

Le due reazioni stechiometriche sono:rF + ATP ADP + FMNFMN + ATP FAD + Ppi

Dove rF = riboflavinaPpi = residuo pirofosforico

Nelle cellule eucariotiche il FAD è caratteristico delle ossidoreduttasi INTRAMITOCONDRIALI.

La fosforilazione rende riconoscibile il coenzima da parte della propria apoproteina. I fosforili intervengono solo parzialmente nel legame con la proteina. Infatti si hanno interazioni deboli e apolari.


FAD: legame alla apoproteina

L’interazione tra coenzima e apoproteina avviene tramite legami deboli e interazioni apolari.Nel sito attivo dove ha posto il coenzima si realizzano interazioni tra i gruppi dissociabili del sito attivo e i fosforili e le posizioni 2, 3, 4 del FAD. Si formano ponti H e le posizioni 2, 3, 4 subiscono processi di protonazione e deprotonazione.


FMN: interazioni con il sito attivo

L’ FMN occupa uno spazio più ridotto nel sito attivo e gli enzimi FMN-dipendenti hanno nel sito attivo aminoacidi acidi disposti a simmetria ottaedrica e quindi in grado di accogliere FERRO.Le flavoproteine FMN sono FERROFLAVOPROTEINE.Anche le FAD-flavoproteine sono spesso ferroproteine, ma per il funzionamento del FAD, oltre al ferro, sono necessari gli ioni cofattori.


Equilibri forma RED. e OX.

N N

NNH

O

OCH3

CH3

La molecola del FAD è ripiegata in modo che i due eterocicli dell’isoallossaziona e dell’adenina si trovano su piani paralleli e affacciati. Calcio, magnesio e manganese (ioni cofattori), trasportando elettroni, possono regolare le interazioni tra le forme lettimiche e lattamiche degli eterocicli, mettendoli in condizione di accettare o cedere idrogeno. L’equilibrio interessa le posizioni 1 e 5.

N NH

NH

NH

O

OCH3

CH3

Forma ossidata (1, 5 deidrogenata) Forma ridotta (1, 5 idrogenata)

5 5

1 1


Substrati delle ossidoreduttasi flaviniche

1. Unità a due atomi di carbonio2 gruppi metilenici o metinici contigui possono venire idrogenati o deidrogenati a seconda del tipo di enzima e quindi del potenziale a cui l’enzima si trova.Si tratta di due carboni che devono essere sempre molto prossimi ai terminali che a loro volta devono essere portatori di parziale carica positiva.

CH2

CH2

CH

CH

+FAD

FMN

FADH2

FMNH2

+



2. Interazione con i coenzimi piridiniciEntrambi i coenzimi sono inseriti nelle rispettive strutture apoenzimatiche

+

NAD+

NADP+

FAD

FMN

+FADH2

FMNH2

NADH + H+

NADPH + H+

In vivo l’equilibrio è spostato verso sinistra (nella serie elettrochimica degli enzimi redox il senso del trasporto di unità riducenti è dal coenzima piridinico a quello flavinico)



3. Interazione con i coenzimi chinonici

+ CoQ

FAD

FMN

+FADH2

FMNH2

CoQH2

Le unità riducenti vengono trasportate dalla struttura isoallossazinica alla struttura chinonica che diventa fenolica e viceversa. Anche queste reazioni sono modulabili in vitro. In vivo i CoQ nella serie elettrochimica stanno dopo i coenzimi flavinici: l’equilibrio in vivo sarà spostato a destra.



4. Ossigenasi flaviniche: DIOSSIGENASI

+ O2

FAD

FMN

+FADH2

FMNH2

2 OH•

Le ossigenasi flaviniche usano come substrato l’ossigeno molecolare. Le reazioni sono irreversibili e la resa in radicaleOH• è doppia rispetto alle ossigenasi con coenzimi piridinici. Anche in questo caso l’enzima può accogliere nel sito attivo un substrato a cui l’ OH• viene addizionato per fenomeni di sostituzione radicalica.


Proteine flaviniche

Le proteine a cui si legano i coenzimi flavinici possono essere:AlbumineGlobuline

La grande maggioranza delle flavoproteine ha lunghe sequenze di aminoacidi poco polari che costituiscono estesi domini idrofobici.

La maggior parte delle flavoproteine sono inserite in membrane, sia del reticolo endoplasmatico (enzimi extramitocondriali), sia nelle membrane dei mitocondri (nelle cellule eucariotiche).


Lesione biochimica da carenza di vitamina B2

Comporta una lesione dei processi ossidoreduttasici che riguarda sia il semplice trasporto delle unità riducenti (e quindi la rigenerazione dei coenzimi piridinici) con effetti sulla catena respiratoria e la respirazione cellulare, sia sulla ossidoriduzione delle unità bicarboniose, con effetto sul metaqbolismo lipidico che si traduce in una CARENZA della SINTESI di FOSFO e GLICOLIPIDI.

Risultano colpiti, per quanto riguarda la respirazione, il tessuto nervoso, muscolare e epiteliale.Il tessuto nervoso risulta doppiamente colpito per la riduzione del turnover dei lipidi, che danneggia le membrane mieliniche.La carenza si manifesta quindi con NEVRITI e può causare lesionicerebrali.Il fabbisogno quindi viene calcolato per ciascuna specie su:1: flusso ossidoreduttasico2: turnover dei lipidi


Ossidoreduttasi chinoniche

In queste ossidoreduttasi il gruppo prostetico porta una struttura benzenica (benzochinoni) con la struttura del paradifenolo che può diventare un parachinone.In posizione 2 abbiamo sempre un metileSe le posizioni 5 e 6 erano sede di un gruppo fenolico, questo viene bloccato per metilazione.In 3 è presente un sostituente che servirà da aggancio con la proteina.

Il sostituente in 3 ricorda la struttura del fitolo della clorofilla, ossia una lunga catena apolare (idrofobica) che interagisce con un sito idrofobico molto sviluppato in lunghezza superficiale della proteina globulare (solco). La porzione reattiva (nucleo benzochinonico, naftochinonico o anello del cromano) sporge verso l’esterno.


Coenzima Q

CH3

CH3

O

O

O

O

CH3

X

X : CH C

CH3

HH2C

5/10

Es. Nei coenzimi Q5 la sequenza si ripete 5 volte.

Benzochinone


Vitamina K

O

O

CH3

X

CH C

CH3

CH2H2C CH3

5,6

naftochinone


Vitamina E

O

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

Derivati del cromano


Vitamina E: attivazione

CH3

CH3

CH3CH3

La vitamina E per funzionare deve subire, dopo l’inserzione a gruppo prostetico, un processo di attivazione specifico. Si tratta di una reazione ossigenasica operata da una ossidoreduttasi specifica con coenzima piridinico. Si ha sostituzione radicalica con un OH• in posizione 2. Si ha l’apertura dell’eterociclo tra 1 e 2 con formazione di un omociclo difenolico (con ossidrili in para). Si possono avere transizioni in forma chinonica

OH

CH3

CH3

CH3 XCH3

OHOH

X =

123

4


Vitamina E: effetto redox

OH

OH

OH

CH3

CH3

CH3 XCH3

OH

O

O

CH3

CH3

CH3 XCH3

Vit E H2 + O2 à 2 OH• + Vit E

Gli OH • sono specificamente indirizzati alla trasformazione del carotene verso i precursori della vitamina A.Carotene + 4 OH •à ciclocitrale + carotenale


CoQ: collocazione nella serie elettrochimica

+ CoQ

FAD

FMN

+FADH2

FMNH2

CoQH2

I CoQ hanno potenziale di riferimento confrontabile con quello dell’elettrodo a idrogeno.L’equilibrio redox tra CoQ e CoQH2 prevede una transizione del benzochinone a fenolo ( e corrispondentemente del naftochinone a naftolo nella vit. K e chinone-difenolo della vit. E).

O

O

CH3

X

Es. vit K

OH

OHCH3

X


CoQ: collocazione nella serie elettrochimica

CoQH2 + 2Cyt Fe+++ CoQ + 2 Cyt Fe++ + 2H+

I Coenzimi chinonici (Q, K e E) possono interagire con i citocromi. In vivo l’equilibrio è spostato a destra.


Vitamina K: coinvolgimento nella coagulazione del sangue

L’enzima specifico che ha come coenzima la vitamina K è in grado di promuovere sulla protrombina neosintetizzata la formazione di ponti disolfuro che la organizzano in una struttura terziaria stabile e ben precisa. La protrombina assume così la sua struttura funzionalmente efficace. La vitamina K prende quindi il nome di vitamina antiemorragica, per il controllo esercitato sui fattori di coagulazione (anche se NON è un fattore di coagulazione).


Vitamina K nei tessuti vegetali

La vitamina K in forma ridotta, nei tessuti vegetali viene riconosciuta da enzimi che marcano le molecole con fosforile, ma in questo caso è riconosciuta da una semplice idrolasi (enzima di classe 3). Con nessun dispendio energetico si passa alla vitamina nella sua forma fosforilata.

Vit KH2 + H3PO4àVit K P

Si forma una struttura Semiossidata METASTABILE, in disequilibrio. Si passa da estere fenolico a estere enolico, a più alta energia.Si forma ATP e la vit K da metastabile torna nella forma ossidata stabile.Vit K P + ADPàVit K + ATP

OHO

OH

PO

O

CH3

X

OHO

OH

PO

O

CH3

X+

O

O

CH3

X


Vitamina A

OH

CH3

CH3CH3CH3 CH3

Retinolo


β-carotene: produzione della vitamina A

6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

15'

14'

13'

CH320'

12'

11'

10'

9'

CH319'

8'

7'

CH3 17CH316

CH319CH320

1'

6' 2'

3'5'

4'CH3 18'

CH316'

CH317'

HOH

OH

6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

15'

14'

13'

CH320'

12'

11'

10'

9'

CH319'

8'

CH317CH316

CH319CH320

HOH

OH

7' 1'

6' 2'

3'5'

4'CH318'

CH316'

CH317'



H O

6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

15'

14'

13'

CH320'

12'

11'

10'

9'

CH319'

8'

CH317CH316

CH319CH320

H

O

7' 1'

6' 2'

3'5'

4'CH318'

CH316'

CH317'

carotenale

ciclocitrale

Viene trasformata in acido e trasferita sul CoA



§ L’accorciamento avviene fino alla posizione 15-15’, dove l’orientamento del legame trans è caratteristico (centro dei fenomeni di florescenza) e quindi riconosciuto dall’enzima che si blocca

O

6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

15'

14'

13'

CH320'

12'

11'

10'

9'

CH319'

8'

CH317

CH316

CH319

CH320

S-CoA



§ Scissione reduttasica

S-CoA6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

CH317CH316

CH319CH320 O

H6

5

1

4

2

3

7

8

CH318

9

10

11

12

13

14

15

CH317

CH316

CH319

CH320 O

Vitamina A1

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