Ornella Pastoris

Le micotossine nella

filiera vitivinicola

Prof. Ornella Pastoris

Università degli Studi di Pavia

Centro Riccagioia

Torrazza Coste, 27 marzo 2013

Micotossine

I funghi filamentosi microscopici, comunemente noti

come muffe, possono svilupparsi su una grande

quantità di derrate alimentari ed in particolari

condizioni ambientali e di conservazione

In particolari condizioni di

squilibrio nutrizionale la muffa può

attivare vie metaboliche

secondarie che portano alla

formazione di micotossine

Alimento con muffapotrebbe non contenere micotossine

Alimento integro potrebbe contenere micotossine

Funghi patogeni nell’uva

Erysiphe necator

Plasmopara viticola

Alternaria spp

Aspergillus spp

Botrytis cinerea

Cladosporium spp

Penicillium spp

Rhizopus spp

A. flavus e A. parasiticus aflatossine

ritrovate nell’uva solo occasionalmente

Micotossine nell’uva

Ocratossina A

Fumonisine

Ocratossina A (OTA)

• Comunemente presente in cereali, uva, caffè, spezie, cacao

• Individuata nell’uva e nel vino per la prima volta nel 1996

• Prodotta da Aspergillus spp. e Penicillium spp.

• Nei cereali i principali produttori sono P. verrucosum e A. ochraceus

Ocratossina A (OTA)

• Nell’uva l’OTA viene prodotta principalmente da A. niger e da A. carbonarius

• 70-100% dei ceppi di A. carbonarius e 2-20% di A. niger che contaminano l’uva sono produttori di OTA

• Gli Aspergilli in vitro degradano l’OTA prodotta ricavando una serie di composti che probabilmente favoriscono la crescita del fungo

• OTA può essere presente anche se non si rileva la presenza di specie ocratossigene

• La presenza di muffe sull’acino non implica contaminazione da OTA

Ocratossina A (OTA)

Il problema della

contaminazione del vino

nasce nelle vigne

Durante la lavorazione

l’alcol inibisce la

formazione di micotossine

L’OTA è prodotta principalmente quando A. carbonarius

infetta gli acini prima del raccolto

Effetti di OTA sulla salute

• Nefrotossica (danni dipendenti da dose ed esposizione)

• Immunotossica

• Teratogena

• Cancerogena (gruppo 2B, IARC 1993)

Lunga emivita

Maiale: 70-120 ore

Pollo: 4 ore

Uomo: 840 ore

Presente anche in prodotti

di origine animale destinati

all’alimentazione umana

TWI

120 ng/kg di peso corporeo (Efsa, 2006)

Livelli di esposizione

15-60 ng/kg di peso

corporeo alla settimana

OTA nell’uva e nel vino

• Clima (temperatura e umidità)

• Zona geografica (latitudine)

• Annata di produzione

• Fattori legati alla vinificazione

La presenza di OTA nell’uva e

nel vino è influenzata da

numerosi fattori:

Livelli massimi di OTA ammessi in

succo d’uva, mosto e vino

2 µg/kg (Regolamento CE n. 123/2005)

Effetto del clima

Temperatura ed umidità sono fattori fondamentali che

influenzano la crescita fungina e la produzione di micotossine:

la conoscenza di come tali fattori possono favorire la

produzione di OTA è di grandissima importanza per poter

prevedere e quindi prevenire eventuali contaminazioni

Condizioni ottimali di crescita fungina

Specie T aw

A. carbonarius 30°C 0.97

A. niger 35°C 0.98

Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216

Effetto della temperatura

Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216

La temperatura ottimale per la produzione di OTA è di 15-20°C

Effetto dell’umidità

Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 110: 209-216

I valori ottimali di aw per la produzione di OTA sono

molto simili a quelli che favoriscono la crescita fungina

Effetto della latitudine

I vini dei Paesi più meridionali sono in genere più

contaminati come conseguenza del clima più caldo e secco

Valero et al., Food Chemistry 2008; 108: 593–599

CII 15% > 2µg/l

CIII 27% > 2µg/l

Annata di produzione

L’annata – come conseguenza del clima e della presenza di fenomeni

metereologici – può influenzare la presenza di OTA nelle uve

Lucchetta et al., Toxins 2010; 2: 840-855

Lopez De Cerain et al., Food Addit Contam 2002; 11:1058–1064

Fattori legati alla coltivazione

Varietà di uva, grado di

maturazione, danni fisici agli

acini possono favorirne il

deterioramento e la crescita

di funghi ocratossigeni

La presenza di danni sulla

buccia dell’acino favorisce

la penetrazione del fungo

all’interno


La fase di maturazione e l’esposizione a raggi UV

influenzano il grado di contaminazione dell’uva

Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S83-S87


La presenza di danni alla buccia degli acini

favorisce l’infezione da A. carbonarius

De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24

Fattori legati al tipo di vinificazione

Pur non essendoci differenze di contenuto di OTA tra

uva bianca e nera, il contenuto di micotossina nei

vini rossi è superiore rispetto agli altri vini

Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618


• Il processo di vinificazione può svolgere un ruolo

importante nel determinare il contenuto finale di

OTA nel vino

• È fondamentale conoscere i passaggi critici che

influenzano tale contaminazione allo scopo di poter

tener sotto controllo i livelli di OTA durante tutto il

processo di lavorazione

• La maggior parte dell’OTA originariamente presente

nell’uva rimane legata alle fecce e con esse viene

eliminata


Livelli di OTA nel vino

Livelli di OTA negli

scarti di lavorazione

Fernandes et al., Am J Enol Vitic 2007; 58: 92-96

AF = Fermentazione alcolica

MLF = Fermentazione malolattica


• In seguito alla pigiatura, quando le bucce rimangono

a contatto con il mosto, può esserci un aumento di

OTA, che poi diminuisce nei passaggi successivi

• Durante la macerazione

per la produzione dei vini

rossi il contatto tra bucce

e succo può determinare

un aumento di OTA in

quest’ultimo stimato

intorno al 20%


Il processo di vinificazione porta ad una riduzione dei

livelli di OTA nel vino. Una ulteriore riduzione (fino al

17%) si può avere anche durante l’invecchiamento

Grazioli et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S93-S96


I livelli di OTA variano anche in funzione della qualità

del vino, sebbene non ci sia correlazione tra il prezzo

ed il grado di contaminazione


L’importanza della campionatura

• È fondamentale conoscere le zone

maggiormente soggette all’attacco dei

funghi ocratossigeni allo scopo di

effettuare una corretta campionatura

per verificare una eventuale

contaminazione prima della vendemmia

Raccogliere campioni a intervalli

regolari lungo un percorso

prestabilito

• Non c’è relazione tra il contenuto di OTA

e la posizione di un grappolo sul ramo o

la localizzazione della pianta nel vigneto

I risultati migliori si ottengono

campionando, in una posizione

predefinita, un grappolo per ogni

pianta da almeno dieci piante

Aspergillus spp nelle uve italiane

Le uve del nord sono complessivamente più contaminate (~82%)

A. carbonarius è virtualmente assente nei campioni provenienti dal

nord, mentre è presente (~10%) nelle uve del sud


OTA nelle uve italiane

Il 30.4% dei campioni risulta contaminato con una considerevole

differenza legata all’area geografica di provenienza

Il 24% dei vini del sud Italia ha livelli di

OTA>0.02 µg/l, mentre il 4.5% supera il

limite imposto dalla CE di 2 µg/l


Contaminazione delle uve italiane

• Non c’è una correlazione significativa tra la presenza di

Aspergilli totali e contaminazione da OTA

• Nelle regioni del nord e

del centro la presenza

di alti livelli di funghi

non necessariamente

implica la presenza

anche di OTA

• Esiste una correlazione

positiva tra presenza di

A. carbonarius e

contaminazione da OTA

OTA nei vini italiani

La regione di origine del vino, come conseguenza diretta

del diverso clima, influenza il contenuto di OTA


OTA nei vini italiani

Piemonte

3 ng/l

Lombardia

15 ng/l

Triveneto

43 ng/l

Romagna 115 ng/l

Marche 25 ng/l

Abruzzo 195 ng/l

Puglia 1302 ng/l

Sicilia 1366 ng/l

Toscana 498 ng/l

Emilia 17 ng/l

Considerando solo i vini rossi

si crea un gradiente dei

livelli di OTA da nord a sud

lungo il versante adriatico

Pietri et al., Food Addit Contam 2001; 18: 647-654

Esposizione della popolazione italiana

Sebbene i cereali siano considerati la maggior fonte di esposizione

ad OTA, recenti studi hanno sottolineato l’importante contributo

apportato dal vino (in particolare dai vini rossi)

Miraglia e Brera, 2002

Esposizione della popolazione italiana

L’assunzione quotidiana di OTA con il vino varia considerevolmente a

seconda del consumo, del tipo di vino e dell’area geografica


TDI = 17.1 ng/kg

Come minimizzare il rischio di contaminazione

Minimizzare il danno agli acini sulla vite è uno degli elementi

chiave per ridurre il rischio di contaminazione da OTA

• tenere sotto controllo gli eventuali danni agli acini causati

da funghi o da muffe patogene tramite l’utilizzo di fungicidi

• tenere sotto controllo i danni causati da insetti utilizzando

insetticidi

• sfruttare pergolati e la potatura in modo che i grappoli

abbiano una adeguata esposizione al sole, non rimangano

impigliati nei fili dei tralicci ed abbiano spazio a

disposizione

• controllare le tempistiche di irrigazione per ridurre il

rischio di rottura degli acini in caso di pioggia prima del

raccolto

Come minimizzare il rischio di contaminazione

• Strumenti che permettono di prevedere le regioni viticole a

rischio di contaminazione da OTA e che sfruttano modelli che

tengono conto delle temperature e delle precipitazioni stagionali

• Raccolta di campioni nei vigneti sa sottoporre ad analisi

microbiologiche

• Applicazione dei metodi di

controllo della contaminazione

da Aspergillus spp

Controllo chimico

(fungicidi)

Controllo biologico (lieviti,

agenti di biocontrollo)

Controllo chimico della produzione di OTA

I fungicidi possono sia ridurre che favorire (a seconda

anche della temperatura) l’infezione dell’uva da parte di

A. carbonarius

Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029

Controllo chimico della produzione di OTA

I fungicidi che inibiscono le infezioni degli acini riducono

anche il contenuto di OTA nelle uve

Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029

Trans-resveratrolo

• Il trans-resveratrolo (3,5,4-triidrostilbene) è un

composto antiossidante naturale che si accumula nelle

foglie e nella buccia degli acini in risposta a danni di

varia natura (infezioni fungine, radiazioni UV, danni

chimici…)

• Si può trovare anche nel vino in concentrazione

variabile in funzione dei processi viticoli ed enologici

• Ha proprietà di pesticida naturale

Trans-resveratrolo

Nei vini rossi esiste una correlazione positiva tra contenuto di OTA,

stilbeni totali e trans-resveratrolo, il che suggerisce che la produzione

di OTA stimoli la sintesi sia di stilbeni che di trans-resveratrolo

Perrone et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 6807-6812

Svantaggi dei fungicidi

• Residui nell’uva dopo la

vendemmia e quindi possibile

presenza nel vino

• Potenziali effetti nocivi per la

salute

• L’uso persistente favorisce la

selezione di ceppi resistenti

Necessità di sviluppare metodi

di controllo alternativi

Controllo biologico della produzione di OTA

• Utilizza microrganismi (agenti

di biocontrollo) antagonisti dei

funghi patogeni e rappresenta

una buona e promettente

alternativa ai pesticidi

• Uno dei vantaggi è che gli

agenti di biocontrollo possono

essere impiegati insieme ai

pesticidi, riducendo quindi i

livelli di questi ultimi

necessari per tenere sotto

controllo la crescita fungina

I lieviti come agenti di biocontrollo

L’azione protettiva dei lieviti è influenzata da temperatura e umidità,

ma alle condizioni ideali si osserva una riduzione significativa della

crescita del fungo patogeno negli acini pretrattati



I livelli di OTA negli acini pretrattati con lieviti

sono significativamente inferiori



L’azione degli agenti di biocontrollo è

maggiore se impiegati nella fase di

stoccaggio dei frutti, quando cioè le

condizioni di temperatura ed umidità

possono essere controllate in modo da

garantire la massima azione protettrice

L’applicazione degli agenti di

biocontrollo prima del raccolto

comunque favorisce la

colonizzazione della superficie del

frutto e delle lacerazioni della buccia

aumentando così l’efficacia durante

lo stoccaggio

I lieviti epifiti

• Sono i principali costituenti della flora microbica

che ricopre la superficie degli acini di uva

• Sono evolutivamente adattati a questa nicchia

ecologica

• Possono essere validi agenti di biocontrollo per

la loro capacità di colonizzare i grappoli di uva e

competere (per spazio e nutrienti) con i funghi

patogeni

• Possono sopravvivere e colonizzare gli acini

nelle vigne mantenendo l’equilibrio

dell’ambiente naturale

I lieviti epifiti

Portano ad una considerevole riduzione della crescita sia

di A. carbonarius che di A. niger sugli acini di uva

Bleve et al., Int J Food Microbiol 2006; 108: 204-209

Vantaggi degli agenti di biocontrollo

• Non influenzano le caratteristiche organolettiche

dell’uva

• Uno dei normali passaggi nella produzione del vino

consiste nell’aggiunta di anidride solforosa

(antiossidante, conservante e antisettico), che

porta anche alla neutralizzazione dei lieviti per

evitare che entrino in competizione con i lieviti

che vengono aggiunti nei processi di

fermentazione alcolica

• Con la svinatura si separa il vino dalle vinacce ed

altri elementi solidi comprendenti anche i residui

degli stessi lieviti

Interventi durante la vinificazione

I principali elementi che riducono i rischio di

contaminazione durante e dopo la raccolta:

• selezione dell’uva e raccolta in modo da

minimizzare i danni agli acini e ridurre la

perdita di succhi durante il trasporto

• rapido trasporto alla cantina

• conservazione a bassa temperatura dell’uva

raccolta

• corretta condotta igienica nella cantina


Durante la fermentazione

alcolica l’OTA viene adsorbita

da mannoproteine presenti

sulla parete dei lieviti e quindi

“sottratta” al vino

Selezionare ceppi di lievito la

cui parete abbia una

composizione proteica che

garantisca elevata capacità di

adsorbire l’OTA

Agenti raffinanti (es. carbone vegetale) rimuovono l’OTA dal vino,

ma compromettono la qualità del prodotto finale

Agenti proteici (es. albumina) e la bentonite legano l’OTA, ma la

loro efficacia può dipendere dalla presenza di altre proteina

nell’uva


In base alle norme generali di salvaguardia della salute e alle

direttive comunitarie, tutte le aziende del settore alimentare – e

quindi anche le cantine che producono vino – devono mettere a

punto dei sistemi di autocontrollo basati sulle norme HACCP

Individuare i punti critici di controllo, ossia quei passaggi della

lavorazione in cui il rischio di contaminazione è maggiore ed in cui

vanno quindi concentrate le analisi di controllo

Nei processi di vinificazione i punti critici di controllo per

monitorare i livelli di OTA sono la pigiatura e la fermentazione

alcolica. Al termine di questi passaggi è quindi buona norma

effettuare dei prelievi per opportune analisi

Fumonisine (FB)

• Micotossine cancerogene prodotte da Fusarium

Verticillioides e da altre Fusarium spp

• FB1, FB2 e FB3 sono cancerogene. FB2 è la più

citotossica

• FB2 è stata ritrovata in varie piante e prodotti di

origine vegetale, soprattutto nel mais e derivati,

nella birra e negli asparagi

• In Europa il limite massimo di FB totali ammesso

nei prodotti a base di mais è di 0.2-2 µg/g

Fumonisina B2 (FB2)

È prodotta anche da A. niger: l’80% dei ceppi noti produce FB2; il

17% produce OTA; il 10% produce FB2+OTA

A. niger produce anche FB4 ed

FB6, ma non FB1

Poiché A. niger infetta

frequentemente l’uva, il rischio

di contaminazione dei prodotti

vitivinicoli con FB è elevato

Problema recente

Ricerca PubMed

“ochratoxin A + wine” 222 articoli dal 1996

“fumonisin + wine” 16 articoli dal 2006

Frisvad et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 9727-9732

FB2 nei vini italiani

In uno studio su 51 vini italiani è risultato che 9

(pari al 17.6%) contenevano FB2 (0.4-2.4 ng/ml)

200 ml

2.9 ng/kg

PMTDI = 2 µg/kg

Logrieco et al., Food Addit Contam 2010; 27: 1136-1141

Il vino, da solo, non rappresenta un rischio, ma insieme ad altre

fonti può contribuire al raggiungimento della PMTDI

70 kg

FB2 nei vini rossi

I vini rossi sono più contaminati dei vini bianchi,

mentre non c’è relazione tra contenuto di FB2 e

la regione di provenienza o l’annata del vino

Mogensen et al., J Agric Food Chem 2010; 58: 4853-4857

Conclusioni I

• La contaminazione da micotossine nel vino

rappresenta un rischio concreto

• L’OTA è presente maggiormente nei vini rossi delle

aree geografiche più meridionali

• L’esposizione ad OTA dovuta

al vino è molto inferiore alla

TDI, ma può comunque

contribuire al raggiungimento

di tale limite se si assumono

altri alimenti contaminati

Conclusioni II

• Esistono mezzi preventivi

e di controllo per

minimizzare il rischio di

presenza di OTA nei vini

• Recentemente è emerso

anche un ruolo delle FB2

nella contaminazione dei

prodotti vitivinicoli

Ornella Pastoris

Business

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