19 ottobre 2011 Alessio Branchini

NMD-

Nonsense-Mediated Decay

Università degli studi di FerraraCorso di Laurea in Scienze Biomolecolari e CellulariMacromolecole Biologiche

PREMATURE vs NORMAL TERMINATION

mRNA

PTC Ter

AUG UGA/UAG/UAA UGA/UAG/UAA

7mG A(n)

???? Stable RNA

…PTC? Ter?....

Truncated polypeptideProtein metabolism

RNA metabolism

Full-length polypeptide

Processamento e maturazione del mRNA negli eucarioti

Trasporto attraverso il complesso del poro nucleare

Il ciclo vitale del mRNA nel citoplasma

Terminazione della traduzione

Stop codon

Forma stabilizzata

Circolarizzazione e traduzione del mRNA negli eucarioti

1. Codone di stop in frame

2. Riconoscimento da parte dei fattori di rilascio

3. Idrolisi legame peptidico

12

3

Citoplasma eIF4E sostituisce CBC all’estremità 5’-cap

Trasporto del mRNA negli eucarioti

Meccanismi di controllo di qualità per assicurare fedeltà all’intero percorso cui è sottoposto il messaggero

Quality Control mRNA Surveillance

Nucleo Citoplasma

Esosoma

(Idrolisi 3’ 5’ introni excisi)

Difetti di splicingo poliadenilazione

La concentrazione di un mRNA dipende dal bilancio tra la quota di messaggero sintetizzata e la quota di messaggero degradata

mRNA con codoni di stop prematuri

Nonsense-mediated decay (NMD)

Poro Nucleare

NO a pre-mRNA da splicing incompleto e

associati allo spliceosoma

IL COMPLESSO DI GIUNZIONE ESONICA

EJC(Exon-junction

complex)

Complesso multiproteico depositato durante lo splicing circa 20-24 nucleotidi a monte di ogni giunzione esone-esone

Dipendenza dallo splicing!!

Evento chiave Il PIONEER ROUND della traduzione

CBC

Passaggio del ribosoma sul trascritto contenente EJCs

Spiazzamento degli EJCs

Sostituzione CBC (CBP80/CBP20) eIF4E

Codone di stop stallo del

ribosoma

Se la distanza tra stop codon e la giunzione esone-esone successiva è ≥ 55 nt Stop codon = PTC

Dipendenza dalla traduzione!!

Passaggio del ribosoma

Il PIONEER ROUND della traduzione

Stopcodon

Ribosoma in stallo a livello del codone di stop

Gli EJC sono piattaforme di legame per le proteine UPF

UPF3

UPF2

UPF1

Nucleo

Zona perinucleare

Citoplasma

SMG1

SMG7

SMG5

SMG6

Sequenza di legame

Fattori addizionali

Protein chinasiProteine con dominio14-3-3-like per legare

residui fosforilati

Legati agli EJC in TUTTI i trascritti

Fattore reclutatoindispensabile

SURF Complex(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)

Codone di stop stallo del ribosoma

Se > 55 nt da EJ Stop codon = PTC

NMD Il PIONEER ROUND della traduzione

CBCPassaggio del ribosoma sul trascritto contenente EJCs

Dipendenza dalla traduzione!!

Il complesso di giunzione esonica si localizza suimRNA legati a CBC ma NON sui mRNA legati a eIF4E

EJC Proteins

UPF1 è regolato da cicli di fosforilazione/defosforilazione

Il complesso UPF1:UPF2:UPF3 induce lafosforilazione di UPF1

La fosforilazione di UPF1 recluta il complesso

SMG7/SMG5

mRNA decay(degradazione

del messaggero)+

Riciclo di UPF1 e dei fattori

coinvolti

?

RIASSUNTO: Terminazione normale vs NMDTerminazione normale Codone di stop NMD

Legenda

EJC

Esperimento in cui viene dimostrato come gli EJC siano localizzati solo sugli mRNA legati a CBP80 (proteina che fa parte del cap-binding complex) ma non a eIF4E.L’esperimento prevede una co-immunoprecipitazione che ha lo scopo di vedere quali proteine siano legate a CBC o a eIF4E. Estratti nucleari (N) e citoplasmatici (C) vengono in un primo momento messi in contatti con anticorpi diretti contro CBC e eIF4E per avere l’immunoprecipitato di queste proteine. Successivamente viene eseguito un western blot in cui si utilizzano anticorpi contro le altre proteine che si pensa possano interagire o comunque essere presenti insieme a CBC o eIF4E.Quindi dall’utilizzo incrociato degli anticorpi si può vedere come le proteine costituenti gli EJC siano presenti negli immunoprecipitati di CBC sia nel nucleo che nel citoplasma (fila di mezzo nelle due serie), mentre nessuna proteina degli EJC co-immunoprecipita con eIF4E (fila a destra).

IMMUNOPRECIPITAZIONE ASSOCIATA A WESTERN BLOT

EJC components

mRNA with PTCmRNA wild-typeEJC components

no CBCeIF4E exchangeNMD

CBCeIF4E exchangemRNA translation by ribosomes