Dott. Michelangelo Mancuso

Dipartimento di Neuroscienze

AOUP Pisa

MITOCONDRI E DEMENZA

• MITOCONDRIO E STRESS OSSIDATIVO

• MITOCONDRIO COME CAUSA DI

DEMENZA

• MITOCHONDRIAL CASCADE

HYPOTHESIS IN ALZHEIMER DISEASE

• Un mitocondrio è un organulo cellulare

presente in tutti gli eucarioti.

• I mitocondri sono presenti nel citoplasma

di tutte le cellule animali a metabolismo

aerobico.

• Questo organulo può essere considerato

come la centrale energetica della

cellula: infatti esso ricava energia dai

substrati organici per produrre un

gradiente ionico che viene sfruttato per

produrre adenosintrifosfato (ATP).

EVIDENZE:

• presenza di molecole di cardiolipina ed assenza di colesterolo nella membrana

interna

• la presenza di un DNA circolare a doppia elica

• presenza di ribosomi propri e di una doppia membrana

• assenza di istoni

• ribosomi sensibili ad alcuni antibiotici (come il cloramfenicolo).

• replicazione, per scissione binaria, autonoma rispetto alla cellula.

La teoria endosimbiotica afferma che i

mitocondri deriverebbero da ancestrali

batteri, dotati di metabolismo ossidativo,

inglobati dalle cellule eucariote con

conseguente mutuo beneficio.

I mitocondri sarebbero, quindi, cellule

simbiontiche ottimizzate per produrre molta

energia e consumarne pochissima.

E' stato calcolato che questa simbiosi doni

un vantaggio energetico alle cellule

eucariote da 3 a 4 ordini di grandezza in

più. Salvador Dalì, Simbiosi donna-animale (1928)

• I mitocondri si duplicano all’interno di una cellula prima che essa si divida in modo da fornire i mitocondri per le cellule figlie

• I mitocondri prima di dividersi duplicano il loro DNA

Organelli intracitoplasmatici di forma

bastoncellare

– O.5 - 1 µm di spessore

– Fino a 10 µm di lunghezza

Membrana

esterna

Membrana

interna ripiegata

Creste

mitocondriali

Lo spazio tra la membrana esterna e la

membrana interna e detto spazio

intermembrana.

La membrana interna delimita la Matrice

mitocondriale

La membrana esterna è composta per il 50% da lipidi e per il resto da svariati enzimi dalle molteplici attività tra cui:

• ossidazione dell'adrenalina • allungamento degli acidi grassi • degradazione del triptofano.

Contiene porine: canali proteici transmembrana, formati per lo più da

foglietti β, non selettivi.

membrana esterna molto permeabile:

permette il passaggio di molecole di

massa fino a 5000 Dalton.

La membrana interna ha un rapporto proteine/lipidi che si aggira intorno a 3:1 e contiene più di 100 molecole polipeptidiche.

La membrana interna, contrariamente a quella esterna, è selettivamente permeabile, priva di porine, ma con trasportatori transmembrana altamente selettivi per ogni molecola o ione.

Si distinguono,

quindi due facce

della membrana

interna

versante della matrice - o versante N in ragione del

potenziale di membrana neutro -

versante citosolico (in quanto viene facilmente raggiunto dalle piccole molecole del citosol cellulare) – o versante P in ragione del potenziale di membrana positivo nello spazio intermembranoso interno -

Processo attraverso il quale l’ossidazione di

metaboliti cellulari produce ATP

Gli elettroni trasportati da NADH e FADH2 dopo

una serie di passaggi intermedi, vengono

ceduti all’O2. Le varie proteine trasportatrici

subiscono cambiamenti conformazionali che

consentono di trasferire protoni dalla matrice

allo spazio intermembrana contro

gradiente. Questo gradiente è sfruttato dal

complesso V per formare ATP.

I mitocondri possiedono un proprio DNA costituito da un

cromosoma circolare nudo, superavvolto a doppia elica,

16.569 pb codificanti, 3% del DNA totale.

In ogni mitocondrio sono presenti da 2 a 10 copie di mtDNA.

Genoma mitocondriale

37 geni: 2 codificanti

rRNA (16S e 12s), 22

codificanti tRNA, 13

codificanti proteine della

fosforilazione ossidativa

(di cui 2 per subunità 6

e 8 di ATPasi).

Due filamenti: H: 2rRNA,

14 tRNA, 12 polipeptidi;

L: 8 tRNA, 1

polipeptide; geni

sovrapposti

Genoma mitocondriale• Sistema di replicazione, trascrizione, traduzione indipendente da quello

nucleare (polimerasi, ribosomi e rRNA)• Due filamenti (H e L) diversi nella composizione nucleotidica, entrambe

trascritti e tradotti.• La replicazione è Bidirezionale e asincrona: due diverse origini di

replicazione. Modello a D loop: inizio dall’origine di H con formazione di un’ansa, quando metà di H è replicata in una direzione, inizia la sintesi di L da un’altra origine nell’altra direzione (senso antiorario).

• Non esistono introni• Codice genetico diverso da quello nucleare.

• Non esiste sistema di riparo delle mutazioni (tasso di mutazione è 10-20 volte superiore a quello nucleare)

Genoma mitocondriale

• Dovuta alla particolare trasmissione di carattericodificati dal DNA mitocondriale

• Eredità uniparentale (MATERNA), non esistonorapporti mendeliani di segregazione.

• I mitocondri PATERNI sono selettivamente distruttinello zigote.

• Sono affetti sia i maschi che le femmine che hanno lamadre affetta, ma la trasmissione del carattereavviene solo attraverso le donne affette (i maschi nontrasmettono la malattia)

• Ciascuna cellula contiene migliaia di molecole di mtDNA(poliplasmia)

• Una mutazione nel mtDNA viene trasmessa ai mitocondri inmaniera casuale perchè durante la divisione cellulare imitocondri sono distribuiti alle cellule figlie in modo casuale

• Una cellula può ricevere dalla cellula madre una popolazionedi mtDNA omogenea, sana o mutante (omoplasmia)

• Alternativamente può ricevere una popolazione mista dimolecole normali e mutate (eteroplasmia)

• Se le cellule eteroplasmiche sono capostipiti di vari tessuti,l’espressione fenotipica sarà multisistemica.

Omoplasmia

(genoma normale)

Omoplasmia

(genoma mutato)Eteroplasmia

L’espressione del fenotipo nei disordini mitocondriali dipende dalla proporzione tra mtDNA normali e mutati presenti nelle

cellule dei vari tessuti. Solo quando si supera una proporzione critica di mtDNA mutati (EFFETTO SOGLIA) si ha deficit della fosforilazione ossidativa e conseguente comparsa di malattia.

Variabilità fenotipica: è espressa dal rapporto mtDNA mutante/mtDNa normale nella cellula. La severità del difetto

biochimico e la rilevanza clinica delle manifestazioni patologiche sono variabili e dipendono quindi da due fattori:

la percentuale di mtDNA mutante presente nella cellula; la dipendenza funzionale dei diversi tessuti dal metabolismo

ossidativo. Per tale motivo il sistema nervoso centrale, il muscolo striato

scheletrico, il cuore, il rene ed il fegato sono gli organi più frequentemente coinvolti.

Come si studiano i Mitocondri

Come si studiano i Mitocondri

Identificate negli anni novanta

Il tasso di mutazione del mtDNA è 10 volte maggiore di quello nucleare

Oltre 100 riarrangiamenti e 50 mutazioni puntiformi

6-7 casi su 100 000

Il DNA mitocondriale è un hotspot di mutazioni patogeniche!

•Il DNA mitocondriale è 1/200 000 del DNA nucleare• I geni mitocondriali sono migliaia di copie/cellula• Le mutazioni devono originare in una singola molecola di mtDNA

Le mutazioni possono

essere MISSENSO,

INSERZIONI,

DELEZIONI e

DEPLEZIONI

Mutazioni a carico del

mtDNA riducono la

produzione di ATP

danneggiando i diversi

organi a secondo del

loro fabbisogno

energetico

•Ptosi palpebrale

•Oftalmoplegia esterna

•Intolleranza all’esercizio fisico

•Debolezza muscolare

•Crampi, mialgie

•Atassia

•Degenerazione retinica

•Ipoacusia neurosensoriale

•Ritardo o deterioramento mentale

•Atrofia ottica

•Crisi epilettiche e mioclonie

•Stroke

•Cefalea emicranica

•Parkinsonismo

•Neuropatia

•Blocchi di branca

•Cardiomiopatia

•Tubulopatia renale

•Diabete mellito

•Ipotiroidismo

•Ipoparatiroidismo

•Bassa statura

•Lipomatosi multipla

•Insufficienza epatica

danno ossidativo

ROS-mediato

ALTERAZIONI DEL mtDNA

DIFETTO ENZIMATICO DELLA CATENA RESPIRATORIA

MITOCONDRIALE

produzione

cellulare di ATP

DNA

proteine

lipidi di

membrana

DANNO CELLULARE

IRREVERSIBILE

MORTE

CELLULARE

Radicali liberi

Ruolo patogenetico

dello stress ossidativo sui tessuti

- CLINICA

- Indagini di laboratorioCK (v.n. o poco )

acido latticoischemico

aerobico

- Studi elettrofisiologici

Elettromiografia

Velocità di conduzione

- Imaging; RM, spettroscopia protonica - Biopsia

muscolare

- Analisi genetiche su sangue, muscolo, sedimento

urinario ecc. Sanger vs NGS

• Microscopia ottica

(e.e., tricromica di

Gomori)

• Indagini

istochimiche (COX,

SDH)

• Studi biochimici

• Indagini genetiche:

mtDNA

• Microscopia

elettronica

(raramente richiesta)

Miopatia mitocondriale:(a) fibre con il caratteristico aspetto“ragged red”, dovuto alla proliferazione mitocondriale. (b) Conla reazione istoenzimatica per la succinico-deidrogenasi (SDH)le fibre sono intensamente marcate (*). (c) fibre COXiporeattive-negative

(Tricromica di Gomori, ingrandimento originale

40x). Fibra muscolare con aspetto tipo "ragged

red". Fibre muscolari contenenti un numero

eccessivo di mitocondri a struttura anomala,

espressione di alterata proliferazione mitocondriale

A

B

C

FENOTIPO ETEROGENEO

INTERESSAMENTO COMUNE DEL SNC

SINTOMATOLOGIA CENTRALE MULTISISTEMICA

Telethon-UILDM Clinical Grant 2009 GUP09004

“NETWORK Nazionale Malattie Mitocondriali”

La nostra esperienza…..

Steering CommitteeG Siciliano& M Mancuso Pisa

G Uziel, Milano

E Bertini, Roma

GP Comi, Milano

T Mongini,Torino

A Toscano, Messina

V Carelli, Bologna

C Angelini, Padova

S Servidei, Roma

P Tonin, Verona

C Minetti, Genova Mitocon

Italian Network of Mitochondrial Diseases

• Corrado Angelini

• Luca Bello

• Enrico Bertini

• Claudio Bruno

• Elena Caldarazzo Ienco

• Valerio Carelli

• Michela Catteruccia

• Giacomo Pietro Comi

• Maria Alice Donati

• Maria Teresa Dotti

• Antonio Federico

• Massimiliano Filosto

• Costanza Lamperti

• Michelangelo Mancuso

• Carlo Minetti

• MITOCON

• Maurizio Moggio

• Tiziana Mongini

• Isabella Moroni

• Olimpia Musumeci

• Daniele Orsucci

• Elena Pegoraro

• Dario Ronchi

• Filippo Maria Santorelli

• Mauro Scarpelli

• Monica Sciacco

• Serenella Servidei

• Gabriele Siciliano

• Paola Tonin

• Antonio Toscano

• Graziella Uziel

• Maria Lucia Valentino

• Liliana Vercelli

• Massimo Zeviani

Oversee Committee

G Logroscino, Bari

S. DiMauro, Columbia University, New York

J. Montoya, Zaragoza, Spain

RW Taylor, Newcastle

Siena

Cagliari

The network has reached the following goals:

1. Establishment of an Italian network of clinical

centers with expertise on MM

2. Creation of a validated web based database,

harmonized with other European Databases and

Networks

3. Characterization of a big cohort of MM cases

32.0 % 27.8 %

Molecular diagnosisMolecular diagnosis

PEO 28.3%

Encephalo-

myopathy

25.3%

Leber/ADOA

15.3%

MELAS 9.0%

Leigh 7.3%

KSS 2.1%

MERRF 4.3%

Others 8.4%

Mitochondrial syndromesMitochondrial syndromes

mtDNA point

mutations

mtDNA point

mutations

nuclear point mutationsnuclear point mutations

OPA1 35.4%

POLG1 20.5%

Twinkle 11.8%

ANT1 2.6%

TYMP 5,1

SURF1 10.3%

PDHA1 4.6%

TK2 2.1%

others 7.6%

1250 patients

(April 15th,

2014)

1250 patients

(April 15th,

2014)

3 CLASSICI FENOTIPI

PEO

KEARN SAYRE SYNDROME

PEARSON SYNDROME

QUADRO CLINICO

• Crisi miocloniche generalizzate

• Atassia/demenza/sordità neurosensoriale/ atrofia ottica/debolezza

mucolare con atrofia

• Deficit stenico prevale ai cingoli

• Polineuropatia sensorimotoria diffusa con piede cavo

• Esordio precoce, cardiomiopatia con blocco di conduzione e

insufficienza respiratoria

DATI DI LABORATORIO

• CK: normale/elevata

• Lattato sierico: aumentato

• TC/RMN encefalo: atrofia cerebrale e cerebellare

• EEG: rallentamento diffuso con scoppi di punte e onde lente

QUADRO CLINICO

• Esordio nel I anno di vita 10% entro i 15 anni 60-80%

• Caratterizzata da encefalomiopatia mitocondrale

• Episodi ricorrenti simil-ictus con cefalea tipo emicranico, nausea,

vomito, emiparesi, emianopsia o cecità corticale. Provocati da

infezioni o sforzi fisici.

• Deficit forza muscolare prossimale e intolleranza allo sforzo

DATI DI LABORATORIO

• CK: normale/elevata

• Lattato sierico e nel LCS: aumentato

• TC/RMN encefalo: atrofia corticale / depositi di Ca⁺⁺ nei gangli della

base

• EEG: attività di punte e onde lente

• EMG/VdC: nella norma

• BIOPSIA muscolare: indistinguibile da altre miopatie mitocondrali.

Decadimento cognitivo e Mitocondriopatie

RESULTS: the m.3243A>G mutation

• 118 patients harboring the A8344G mutation have

been identified among the 1150 mitochondrial patients

(10.9%) present in our database (April 15th, 2013).

• They represented the 34.2% (118/345) of all mtDNA

point mutations.

MRI

DWI

MENDELIAN MD

Temple Lee Parker Mitochondria 3 B

MITOCHONDRIAL MEDICINE: ADVANCES IN UNDERSTANDING PATHOLOGIES AND

THERAPEUTICAL STRATEGIES, Pisa 2006

ONCE UPON A TIME…..

POLG

Nat Genetics 2001

Mitochondrial ataxias

• mitochondrial recessive ataxia syndrome

(MIRAS)

• sensory ataxia neuropathy dysarthria and

ophthalmoplegia (SANDO)

Mitochondrial ataxias – SANDO

• Caused by mutations in mitochondrial POLG gene

• POLG encodes the catalytic subunit of mitochondrial DNA

polymerase

• Adult-onset disease (typically between 16–40 years of age)

• Typical clinical symptoms include:

– Sensory ataxic neuropathy

– Dysarthria

– Chronic progressive external ophthalmoplegia

SANDO, sensory ataxic neuropathy, dysarthria and

ophthalmoparesis Mancuso et al. 2004

Mitochondrial ataxias – MIRAS

• Caused by homozygous or compound heterozygous mutations

in the POLG1 gene

• Results in decreased complex I, II & III of the electron transport

chain

• Cerebellar ataxia

• Commonly associated with:

– Mild cognitive impairment

– Psychiatric abnormalities

– Involuntary movements

– Seizures

– PNP

• Patients may be prone to adverse reactions to valproate

manifesting as acute liver failure

MIRAS, mitochondrial recessive ataxia syndrome

Caso Clinico

• Donna 75 anni

• In anamnesi: ipertrofia ventricolo sinistro, tireopatia

• Anamnesi familiare:cardiopatia e morte improvvisa, ptosi

palpebrale (madre, nonna materna, zia materna)

• Astenia muscolare, facile affaticabilità, ptosi palpebrale

• DA 2 AA CIRCA DIST MEMORIA A BREVE TERMINE,

MMSE 21

Obiettività neurologica

• Ptosi palbebrale bilaterale

• Oftalmoparesi

• Modesta ipostenia prossimale AAII

RMN ENCEALO…

Gene ANT1: mutazione c.340G>C esone 2 gene ANT1

DIAGNOSI AD-PEO

Work in progress…

Le premesse….

Obiettivo dello studioEffettuare una valutazione neuropsicologica e neurometabolica di

screening in una popolazione adulta di entrambi i sessi, affetta da

Malattia Mitocondriale

Pazienti•Pazienti adulti di entrambi i sessi affetti da malattia mitocondriale

Età compresa tra 18 e 75 anni

In grado di comprendere ed aderire a quanto richiesto dal protocollo dello

studio

Consenso informato scritto

Disegno dello studio e Metodi

• Studio osservazionale, monocentrico, prospettico/retrospettivo

• Visita basale per verificare i criteri di inclusione/esclusione dallo studio

• Somministrazione di una batteria di test neuropsicologici

Procedura dello studio e valutazione

• 40 pazienti reclutati affetti da malattia mitocondriale

• Acqusizione consenso informato scritto

• Anamnesi accurata

• Esclusione di esami di laboratori alterati (emocromo, funzionalità epatica e renale, profilo lipidico e glicemico, Vitamina B12, folati e omocisteina)

• RMN encefalo

• Batteria neuropsicologica

• PET cerebrale con FDG

Allo stato attuale….

• 21 pazienti arruolati

• 12 con batteria neuropsicologica alterata

• PET data in progress

1. CARATTERI GENERALI

2. NELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE

LO STRESS OSSIDATIVO

(OS)

1. OS: caratteri generaliStress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di una eccessiva

produzione di Specie Chimiche Reattive (SCR) secondario ad un’aumentata produzione

delle stesse e/o a una ridotta efficacia dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.

Le Specie Chimiche Reattive

radicaliche

(radicali liberi)

non radicaliche

reazioni a catena che aumentano il danno ossidativo

specie reattive dell’ ossigeno (ROS)

specie reattive dell’ azoto (RNS)

specie reattive del carbonio (RCS)

Specie chimica Formula Natura

Anione

superossido·O2ˉ R

Ossigeno

singoletto1O2* R (?)

Perossido di

idrogenoH2O2 NR

Idrossile HO· R

Alcossile RO· R

(Alchil)idroperossi

leROOH NR

Ossido nitrico NO· R

Diossido nitrico NO2· R

Acido nirtoso HNO2 NR

Perossinitrito ONOO- NR

(Alchil)tiile (da R-

SH)RS· R

I radicali liberiGli atomi sono chimicamente stabili quandociascun elettrone dell ’ orbitale più esterno èassociato ad un secondo elettrone che ruota indirezione opposta (appaiato) .

Processi endogeni ed esogeni possono“stappare” un elettrone dall’orbitale esternolasciando un elettrone spaiato; gli atomicaratterizzati dalla presenza di un elettronespaiato sono definiti radicali liberi

Meccanismo di generazione

delle ROS

++

Radicale (ossidante)

A A

Nuova molecola (ridotta, stabile)

Molecola bersaglio(doppio legame C-C)

C C

Nuovo radicale(ossidante)

CC

elettrone spaiatoOSSIDAZIONE

L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo

A concentrazioni moderate le ROS partecipano attivamente ad una varietà di processi

biologici complessi, implicati nella normale crescita cellulare quali la trasduzione del

segnale, il controllo dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi. Sono in

grado di bloccare l’azione patogena di diversi microrganismi.

A concentrazioni elevate le ROS sono dannosi per l’organismo in quanto attaccano i

maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi nucleici, lipidi) partecipando così a

processi complessi quali l’invecchiamento e ad un gran numero di patologie.

Mitocondri e stress

ossidativoI mitocondri rappresentano la fonte metabolica primaria di ROS perché sulle loro creste sono localizzati i complessi enzimatici della catena respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa

La Catena di Trasporto degli

Elettroni

·O2-

O2

H2O2

SOD

Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dell ’ ossigeno non vienecompletamente ridotto ad H2O, ma forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi

Già in condizioni normali, il processo di trasporto degli elettroni non è perfetto, per cui in maniera non facilmente controllabile una certa quota di elettroni (1-2%) sfugge al sistema di trasporto dei vari coenzimi (es. ubichinone, flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagire direttamente con l’ossigeno molecolare, generando, così, anione superossido e /o perossido di idrogeno (riduzione uni- e bivalente dell’ossigeno molecolare)

La Catena di Trasporto degli

Elettroni

Effetti dello stress ossidativo sulla

struttura e sulle funzioni cellulari

BIOMARCATORI DI DANNO OS

a. Danno ai lipidi

Perossidazione lipidica:

Sostanze Reattive all’acido

Tiobarbiturico (TBARS)

Malondialdeide (MDA)

F2-isoprostano

4-idrossi nonenale (4-HNE)

b. Danno alle proteine

proteine nitrosilate

carbonil proteine

c. Danno al DNA

8-idrossi desossi guanosina

(8-OHdG)

Sistema di difesa

antiossidanteAntiossidanti = agenti – chimicamente eterogenei tra loro (enzimi, vitamine, oligoelementi,

ecc.) – in grado di prevenire o annullare l’azione dannosa delle SCR .

Sono molecole capaci di stabilizzare o disattivare i radicali liberi prima che essi danneggino le

cellule

Classificazione degli

antiossidanti

Gli antiossidanti possono essere classificati secondo diversi criteri:

sulla base dell’origine: endogeni ed esogeni,

sulla base della struttura chimica: enzimatici e non enzimatici,

sulla base della solubilità: in liposolubili e idrosolubili.

Considerando, invece, il meccanismo d’azione prevalente, risulta molto utile sotto il profilo

fisiopatologico suddividere gli antiossidanti in 3 gruppi principali:

preventivi,

scavenger

di riparo.

Antiossidanti Enzimatici Superossido Dismutasi (SOD),

Catalasi,

Glutatione Perossidasi (GPx)SOD:

1. Mn-SOD (mitocondrio)

2. Cu/Zn-SOD

(nucleare)

3. Fe-SOD

(extracellulare)

Antiossidanti non enzimatici

vitamina E;

vitamina C;

molecole tioliche (-SH):

- tioredoxina (TRX),

- acido α-lipoico (ALA),

- glutatione (GSH)

altre molecole

- melatonina,

- carotenoidi,

- flavonoidi

Antiossidanti esogeniANTIOSSIDANTI SOLUBILITA’ RDA M/F DOVE

Vitamina A

Vitamina C

Vitamina E

Licopene

Bioflavonoidi

GTE (green tea extract)

Sali di Mg, Zn

Se, Cr

Grassi poli insaturi

Acidi grassi (Omega 6)

Acidi grassi (Omega 3)

liposolubile

idrosolubile

liposolubile

liposolubile

Idrosolubile

1000/800

60/60mg

10/8 mg

1.7/1.3 mg

5 gr

5-6 gr

Frutta gialla, arancione

o verde scura

Frutta, ortaggi a gemma

Fegato, uova

Pomodoro

Cereali, carne, latte

Tè verde

Olio d’oliva

Semi vegetali

Pesce

Meccanismo d’azione degli

antiossidanti

Antiossidanti preventivi

Bloccano la formazione dei radicali

Antiossidanti scavenger

Bloccano la reazione di inizio

Bloccano la reazione di propagazione

Riparano il danno e ricostituiscono le membrane

Antiossidanti di riparo e de novo

Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti,farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, …

Specie Chimiche Reattive

Attacco di biomolecole(glicidi, lipidi, proteine, ecc)

Reazioni radicaliche a catena

Danno ossidativo

malattie

Compartimentalizzazione dei

sistemi antiossidanti

Il sistema di difesa antiossidante è regolarmente distribuito

nell’organismo, sia a livello extracellulare che a livello intracellulare.

Patologie associate ad un

eccessiva produzione di ROSLo stress ossidativo non è caratterizzato da una sintomatologia specifica, inoltre, non è sempre possibile stabilire se l’azione dei ROS sia una causa, l’effetto oppure un semplice epifenomeno associato alla malattia.

2. Lo stress ossidativo nelle malattie

neurodegenerative

È noto un coinvolgimento delle specie radicaliche nel processo di degenerazione

neuronale e un’ associazione tra questo e la patogenesi delle malattie neurodegenerative.

Il SNC è altamente vulnerabile al danno ossidativo a causa di:

elevato consumo di ossigeno,

elevato contenuto lipidico (PUFA),

bassa concentrazione di antiossidanti

Un’eccessiva produzione di prossidanti e/o la caduta dei meccanismi antiossidanti di difesa,

potrebbero far superare facilmente il valore soglia oltre il quale il danno neurodegenerativo

diventerebbe importante

Sclerosi Laterale Amiotrofica

OS nella Malattia di Alzheimer

Neurosci Bull March, 2014

Neurosci Bull March, 2014

[Mayo Clin Proc. 2011; 86(9):876-884]

J. Eric Ahlskog, PhD, MD; Yonas E. Geda, MD, MSc; Neill R. Graff-Radford, MBBCh, FRCP; and Ronald C. Petersen,

Stili di vita e stress ossidativo

Modelli murini SOD1-G93A sottoposti a training (motor or swimming-ALS mice)

il nuoto ritarda in maniera significativa la morte dei motoneuroni

spinali

Severine Deforges, Julien Branchu, Olivier Biondi, Clement Grondard, Claude Pariset, Sylvie Lecolle, Philippe Lopes, Pierre-Paul Vidal, Christophe Chanoine and Frederic Charbonnier ´

[J Physiol 587.14 (2009) pp 3561–3571]

Studi prospettici di meta-analisi documentano una diminuzione

significativa del rischio di sviluppare demenza nei

soggetti che praticano una moderata attività fisica di tipo

aerobica

…..Decadimento cognitivo, mitocondri e stress

ossidativo….

Sempre maggiori evidenze considerano la compromissione del metabolismo e il danno

ossidativo coinvolti nella patogenesi delle malattie neurodegenerative

I mitocondri sono la maggior fonte cellulare di energia e ROS

MITOCONDRI E NEURODEGENERAZIONE

1980: “mitochondrial-free-radical hypothesis”: alla base del fisiologico

invecchiamento cellulare e tissutale vi è il progressivo accumulo di

alterazioni irreversibili indotte da radicali liberi dell’ossigeno (reactive

oxygen species-ROS)

(Harman, 1992)

I mitocondri hanno un ruolo chiave nella

neurodegenerazione?

Mitocondrio, Stress ossidativo e

Malattia di AlzheimerDanno cellulare

Compromissione del metabolismo energetico nella

malattia di Alzheimer

L’attività del KGDHC e di PDHC

sembra essere fortemente

ridotta e correlata al grado di

demenza

Bubber 2005

COMPROMISSIONE DELL’ENZIMA COX NELLA MALATTIA DI

ALZHEIMER

o Differenti regioni encefaliche

o Muscolo scheletrico

o Fibroblasti

o Piastrine

Bosetti 2002; Liang 2008

COX e Malattia di alzheimer: LA NOSTRA ESPERIENZA

Mancuso 2003

I MODELLI CIBRIDI DELLA MALATTIA DI

ALZHEIMER

• I geni mitocondrali ottenuti da piastrine di pazienti con MA espressi nei cibridi causano disfunzioni bioenergetiche, riducono l’attività della COX, riducono i livelli di ATP e aumentano lo stress ossidativo

• I cibridi da MA sviluppano popolazioni di mitocondri anormali e danneggiati

• Nei cibridi da MA è presente una maggior produzione di peptide Ab amiloidogenico

• I cibridi da MA accumlano depositi di amiloide colorabili col rosso Congo

• I mitocondri nei neuroni di cibridi da MA sono allungati. La velocità media mitocondriale e lisosomiale, come anche la percentuale di movimento dei mitocondri è significativamente ridotta nei cibridi.

I cibridi esprimono il fenotipo morfologico e biochimico osservato in vivo nei pazienti con MA

Alterazioni primitive dell’ mtDNA potrebbero essere responsabili del “fenotipo mitocondriale” della MA sporadica e potrebbero essere la causa

dell’aumentato stress ossidativo e dela deposizione di Ab nell’encefalo di pazienti con MA

GENETICA MITOCONDRIALE E MA

GENETICA MITOCONDRIALE E MA

• Nel tessuto cerebrale di pazienti MA aumento di circa 15 volte della

“common deletion” Corral-Debrinski 1994

• Sostituzione A4336G più frequente in pazienti MA Shoffner 1993

• Due cambiamenti eteroplasmici nella regione di controllo CR sono

specifici del tessuto cerebrale dei soggetti con demenza di Alzheimer:

T414G e T477C Wallace and Beal

AD OGGI NESSUNA MUTAZIONE NEL DNA MITOCONDRIALE PATOGENETICA

PER AD

Caso Clinico• Uomo di 64 anni

• Da 2 anni deficit di memoria ingravescente

• Obiettività neurologica: nella norma. Adl

COMPROMESSE

Valutazione neuropsicologica:

Compromesse le prove per la memoria immediata

verbale, visiva e per l'apprendimento. Compromesse

le prove per l'attenzione. Compromessa la prova per

le gnosie visuo-percettive. Compromesse le prove

per le capacità astrattive. Compromesso il Mini

Mental State. Compromesse le prove per la prassia

costruttiva. Destrimane, disturbo del linguaggio

inquadrabile in una afasia di tipo transorticale

sensoriale di grado modesto.

PET

Attività enzimatica mitocondriale su

piastrine….

"riduzione attività COX; nella norma ATP

sintetasi e idrolisi di ATP";

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

minuti

mg

/dL

curve di riferimento curva paziente curve di riferimento media

Test ischemico per ac. lattico

A 64-year-old man with AD and increased blood lactate. Complex IV and V activities were mildly reduced in muscle. Analysis of the mtDNA revealed an m.8381A>G mutation in ATPase 8 (ThrAla)

Alzheimer disease and mtDNA ATPase 8 mutation: just a coincidence?

ANOMALIE MITOCONDRIALI A TUTTI I LIVELLI (INCLUSI I

CIBRIDI)

ASSENZA MUTAZIONI PATOGENE mtDNA

???

Motilità degli spermatozoi

Capacità di adattamento a fredde condizioni climatiche

Leber

Multiplesclerosis Parkinson

ALS

Friedreich

MITOCHONDRIAL HAPLOGROUPS

aging

Aplogruppipopolazione caucasica

1719 4580 7028 8251 9055 10034 10398 12308 13368 13708 16391

H ..... ..... C ..... ..... ..... A ..... ..... ..... .....

I A ..... T A ..... C G ..... ..... ..... A

J ..... ..... T ..... ..... ..... G ..... ..... A .....

K ..... ..... T ..... A ..... G G ..... ..... .....

T ..... ..... T ..... ..... ..... A ..... A ..... .....

U ..... ..... T ..... ..... ..... A G ..... ..... .....

V ..... A T ..... ..... ..... A ..... ..... ..... .....

W ..... ..... T A ..... ..... A ..... ..... ..... .....

X A ..... T ..... ..... ..... A ..... ..... ..... .....

MITOCHONDRIAL HAPLOGROUPS IN AD (1)

o Haplogroup T under-represented in AD; haplogroup J over-represented. Chagnon 1999

o Haplogroups K and U present at a lower frequency in AD ApoE4 carriers than in non-carriers. K and U may act by neutralising the effect of this major AD risk factor. Carrieri 2001

o Males with haplogroup U had increased risk of AD, while females demonstrated a decreased risk with the same U haplogroup. Van der Walt 2004

o Two studies (including only neuropathologically proven cases of AD patients of European descent) indicated that mtDNA haplogroups were not associated with AD. Chinnery 2000, Elson 2006

MITOCHONDRIAL HAPLOGROUPS IN AD (2)

HAPLOGROUPS IN AD: OUR EXPERIENCE (1)

o 209 unrelated sporadic AD subjects (79♂ 130♀ mean age: 74.0±7.6 years, range 50–94)

o 191 healthy, age-matched controls (93♂, 98♀, mean age: 69.1±6.6, range 55–92)

o To minimize the risk of false associations between gene markers and disease, we enrolled in the study only patients and controls of clear Tuscan origin (at least three generations)

HAPLOGROUPS IN AD: OUR EXPERIENCE (2)

Lack of association between AD risk, gender, age of onset, mean survival and mtDNA haplogroups. Mancuso 2007

HaplogroupPatients (N°210)

Patients

(%)Controls (N°191)

Controls

(%)

H 92 43.8 79 41.4

I 5 2.4 3 1.6

J 17 8.1 14 7.3

K 12 5.7 17 8.9

T 15 7.1 20 10.5

U 29 13.8 24 12.6

V 9 4.3 4 2.1

W 5 2.4 4 2.1

X 9 4.3 5 2.6

OTHER 17 8.1 21 10.9

Patients4

without 4

Haplogroups 4(%) without 4(%) OR vs H (95% CI)

H 47 50.5

I 3 1.5 3.45 (0.30-39.71)

J 13 8 1.72 (0.58-5.08)

K 5 5 1.03 (0.23-4.65)

T 9 6 1.72 (0.51-5.84)

U 11 18 0.67 (0.25-1.80)

V 1.5 5 0.34 (0.04-3.10)

W 1.5 3.5 0.57 (0.06-5.78)

X 8 3.5 2.87 (0.64-12.91)

No relationship

HAPLOGROUPS IN AD: OUR EXPERIENCE (3)

HAPLOGROUPS AND AD: CONCLUSION

o Although it has been suggested that inherited haplogroups K and U may influence AD risk in Caucasians, this is still an unresolved question. To date, mtDNA haplogroups do not seem to play a major role in AD.

o The mtDNA alterations that cybrid models induce to hypothesize might be due to somatic factors, i.e. ROS.

o APP, Aβ-induced mitochondrial toxicity, oxidative stress, somatic mtDNA damage, mitochondrial dysfunction and apoptosis seem to be interconnected in the cascade leading to neurodegeneration and dementia.

Lin&Beal Nature 2006Trifunovic 2006

Devi J Neurosci 2006

A proposed model for the

mitochondrial targeting

and accumulation of

transmembrane- arrested

APP affecting

mitochondrial functions.

Proteina della matrice mitocondriale

ABAD

ROS

Alterazione catena respiratoria

Come la β-amiloide arriva nel

mitocondrio

Proteina Tau, Alzheimer e Mitocondri

• Tau iperfosforilata ha ruolo nella patogenesi della Malattia di Alzheimer

(Guillozet et al. 2003)

•L’inibizione dei complessi I e IV della catena respiratoria promuove la

fosforilazione della proteina tau (Melov et al. 2007)

•I radicali liberi dell’ossigeno promuovono l’autoassemblaggio della proteina

tau nelle placche neurofibrillari (Santamaria et al. 2004)

•Per contro l’accumulo di tau causa disfunzione mitocondriale nel modello

murino di Malattia di Alzheimer (Kopeikina et al. 2011)

Fattori vascolari e disfunzione mitocondriale

CONCLUSIONI I

COGNITIVE IMPAIRMENT AS A COMMON FINDING IN MD

PLEASE PAY ATTENTION TO THE FOLLOWING THE RED FLAGS

-Central Nervous System: seizures, ataxia, myoclonus,

sensoryneural hearing loss, cognitive decline, psychomotor

retardation or regression, acute focal signs, migraine, tremor

and parkinsonism.

-Muscles and nerves: exercise intolerance, weakness,

dysphagia, respiratory failure, ptosis, ophtalmoparesis, cramps,

muscle wasting and paresthesia

-Eye: retinopathy, cataract, optic atrophy

-Endocrine: diabetes, short status, dysthyroidism

-Heart: cardiomyopathy, arrhythmia, sudden death

-Gastrointestinal: dysmotility, cachexia, pseudo-obstruction

-Kidney and liver impairment

CONCLUSIONI II

LA MALATTIA DI ALZHEIMER NON E’CAUSATA DA

ALTERAZIONI DNA MT

CONVERGENZA FISIOPATOLOGICA TRA AMYLOID

AND MITOCHONDRIAL CASCADE HYPOTHESIS

MY Professor in Calabria…

Grazie