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IlIl metodometodo introdottointrodotto neinei primiprimi annianni ’’9090 daldal ProfProf.. JanuszJanuszPawliszynPawliszyn dell’Universitàdell’Università didi WaterlooWaterloo inin Ontario,Ontario, CanadaCanadarappresentarappresenta unauna evoluzioneevoluzione delladella tecnicatecnica SPESPE..

Microestrazione in Fase Solida Microestrazione in Fase Solida “Solid Phase Microextraction”“Solid Phase Microextraction” (SPME)(SPME)

E’ una tecnica d'estrazione/concentrazione di E’ una tecnica d'estrazione/concentrazione di contaminanti (presenti anche in tracce) in matrici contaminanti (presenti anche in tracce) in matrici solide,

liquide o gassose in soluzioni omogenee e/o in fase eterogenea, che che non richiede l'uso di solventinon richiede l'uso di solventi..

TECNICA “SOLVENT FREE”TECNICA “SOLVENT FREE”

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http://www.sigmaaldrich.com/europe/events/spme-usermeeting-italy.html

Il componente fondamentale è un piccolo segmento di Il componente fondamentale è un piccolo segmento di FIBRA DI SILICE FUSAFIBRA DI SILICE FUSA

rivestita da una pellicola (film di liquido non vol atile) simile rivestita da una pellicola (film di liquido non vol atile) simile alle fasi stazionarie usate in gascromatografiaalle fasi stazionarie usate in gascromatografia

Ripartizione dell’analita tra il campione (Ripartizione dell’analita tra il campione (soluzione, spazio soluzione, spazio

di testadi testa) ed il polimero che riveste la silice fusa ) ed il polimero che riveste la silice fusa

Questa tecnica abbastanza recente, ha acquisito Questa tecnica abbastanza recente, ha acquisito popolarità negli ultimi anni grazie a:popolarità negli ultimi anni grazie a:1. semplicità1. semplicità2. velocità2. velocità3. sensibilità3. sensibilità

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La fibra La fibra di diversa lunghezza di diversa lunghezza ((generalmente 1 cm)generalmente 1 cm)e diverso spessoree diverso spessore(generalmente diametro 100 µm(generalmente diametro 100 µm))è saldata alla parte terminale di è saldata alla parte terminale di un tubicino sottile di acciaio un tubicino sottile di acciaio all’interno di un sistema a all’interno di un sistema a “siringa” protetto da un “siringa” protetto da un rivestimento anch’esso in rivestimento anch’esso in acciaio. acciaio.

Opportuno dispositivo che comanda lo scorrimento della fibra

Il piccolo diametro e la simmetria cilindrica della fibrapermettono di incorporare la fibra stessa in un sistemache può essere utilizzato come una classica siringacromatografica

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Procedura di Estrazione Procedura di Estrazione (e preconcentrazione)(e preconcentrazione)

L’SPME prevede due processi L’SPME prevede due processi fondamentalifondamentali

Procedura di DesorbimentoProcedura di Desorbimento

1. Perforare il setto del portacampione con l’ago metallico.

2. Esporre la fibra alla soluzione (mediante spinta dello stantuffo) nella soluzione campione o nello spazio di testa per un tempo prefissato. La soluzione campione è posta sotto agitazione e, in alcuni casi riscaldata.

3. Ritrarre la fibra ed estrarre l’ago.

VIAL

Modalità di utilizzo di una fibra SPMEModalità di utilizzo di una fibra SPMEProcedura di EstrazioneProcedura di Estrazione

magnetino

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L’estrazione può essere effettuataL’estrazione può essere effettuata

esponendo la fibra nello esponendo la fibra nello spazio di testa del spazio di testa del

campione, cioè nella fase campione, cioè nella fase vapore sovrastante il vapore sovrastante il

campionecampione

Immergendo la fibra Immergendo la fibra direttamente nel direttamente nel campione liquidocampione liquido

DIRECTDIRECT––SPMESPME(sistema a due fasi)(sistema a due fasi)

HEAD SPACE HEAD SPACE --SPMESPME(Sistema a tre fasi)(Sistema a tre fasi)

Preferibile per campioni solidi o matrici liquide Preferibile per campioni solidi o matrici liquide complessecomplesse (es. acque di scarico contenenti grassi, oli, sostanze umiche, etc.) dove il maggior numero di composti interferenti potrebbero inibire i centri di adsorbimento della fibra.

Nella headspace-SPME gli analiti però devono poter essere rilasciati facilmente dal campione nello spazio di testa, devono quindi avere una certa volatilità.

HEAD SPACE HEAD SPACE --SPMESPME

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Sistema di autocampionamento

1.1. Perforare il setto Perforare il setto dell’inettore del dell’inettore del cromatografo con cromatografo con l’ago metallico.l’ago metallico.

2. Esporre la fibra 2. Esporre la fibra riscaldata al gas di riscaldata al gas di trasporto (GC) o al trasporto (GC) o al flusso di solvente flusso di solvente (HPLC) per un tempo (HPLC) per un tempo prefissato per prefissato per ottenere il ottenere il desorbimento degli desorbimento degli analiti.analiti.

3. Ritrarre la fibra ed 3. Ritrarre la fibra ed estrarre l’ago.estrarre l’ago. INIETTORE GC o HPLCINIETTORE GC o HPLC

Modalità di utilizzo di una fibra SPMEModalità di utilizzo di una fibra SPMEProcedura di DesorbimentoProcedura di Desorbimento

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In GC i composti volatili e

semivolatili possono essere

desorbiti tra 150 e 250 °C in

poche frazioni di secondo.

Per composti ad alto peso

molecolare, invece, è

possibile che si verifichino

per la fibra SPME effetti di

carry-over (effetti memoria).

La fibra comunque non

può essere riscaldata oltre i

300 °C, poichè si avrebbero

perdite di fase adsorbente.

Fibre SPMEFibre SPME

FibreFibre inin silicesilice fusafusa::

-- lunghezzalunghezza 11 oo 22 cmcm

-- chimicamentechimicamente inerteinerte

-- stabilestabile adad altaalta temperaturatemperatura (<(< 300300 °°C)C)..

LeLe fibrefibre sonosono rivestiterivestite concon unauna fasefase polimericapolimerica similesimile aaquellequelle utilizzateutilizzate perper colonnecolonne gascromatografichegascromatografiche::

-- rivestimentirivestimenti didi variavaria polaritàpolarità-- spessorispessori variabilivariabili dada 77 aa 100100 mmmm..

IlIl differentedifferente spessorespessore permettepermette didi assorbireassorbire quantitàquantitàdiversediverse didi analitaanalita sullasulla superficiesuperficie polimericapolimerica..

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DISPONIBILITA’ DELLE FIBRE PER POLARITA’

Fibre Non polariFibre Non polari

Polydimethylsiloxane (PDMS): 100 µµµµm, 30 µµµµm, 7 µµµµ

(estraggono sostanze apolari come gli idrocarburi, i BTEX (benzene, toluene, etilbenzene e xileni isomeri) e gli IPA

Fibre polariFibre polari

Polyacrylate : 85 µµµµm

Carbovax®-divinylbenzene StableFlex TM (CW-DVB): 65 µµµµm (estraggono efficacemente composti polari: fenoli, acidi carbos silici, ecc.)

Fibre BiFibre Bi--PolariPolari

PDMS-DVB StableFlex: 65 µµµµm

Carboxen TM-PDMS StableFlex: 75 µµµµm

DVB-Carboxen-PDMS StableFlex: 55 -30 µµµµm

PDMS-DVB: 60 µµµµm

La Microestrazione in Fase Solida sfrutta la possibilità di poter disporre di fibre con diverso spessore e polarità per effettuare campionamenti selettivi in funzione dei pesi molecolari, delle volatilità e delle polarità degli analiti in esame.

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110 µm

25 µm

60 µm

Scegliendo in maniera opportuna l' adsorbente (e lo spessore) è possibile eliminare le

interferenze di matrice e lo stadio di clean-up del campione, spesso necessario

nella tecnica SPE

natura natura dell’analitadell’analita

natura della natura della matricematrice

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In genere, la polarità del rivestimento dovrebbe essere confrontabile con quella dei componenti del campion e.

POLARITA’ DEI SOLUTI

Il principio su cui si basa l' SPME

è la RIPARTIZIONE

In SPME gli equilibri che si instaurano sono quelli:

ASPETTI TEORICI DELLA SPMEASPETTI TEORICI DELLA SPME

tratra l’analita nel l’analita nel campione e il campione e il rivestimento rivestimento

polimerico che polimerico che ricopre la fibra di ricopre la fibra di

silice (Directsilice (Direct--SPME)SPME)

tratra l’analita nel l’analita nel campione, la fase vapore campione, la fase vapore

sopra il campione e il sopra il campione e il polimero che ricopre la polimero che ricopre la

fibra di silice (HSfibra di silice (HS--SPME) SPME)

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Considerando un rivestimento polimerico liquido, laquantità di analita n (µg), adsorbita dal polimero èdirettamente proporzionale alla concentrazione di analitainiziale nel campione (C0) e alla costante didistribuzione (K fs) dell' analita secondo la seguenterelazione:

dove:n = massa di analita adsorbito (estratto) dal polimero in µgVf = volume del film di rivestimento sulla fibraVs = volume della soluzione sottoposta ad estrazione C0 = concentrazione iniziale (µg/mL) dell’ analita nella medesima soluzioneKfs= coefficiente di ripartizione per l’analita tra il film di rivestimento e la soluzione

n = K fs Vf C0

Se si estrae un grande volume di soluzione (VSe si estrae un grande volume di soluzione (V ss) , cosicchè ) , cosicchè Vs >> KVs >> K fsfs VVff, allora l’equazione precedente:, allora l’equazione precedente:

La quantità di analita estratto n è quindi proporzionale:-- allaalla concentrazioneconcentrazione didi analitaanalita inzialeinziale CC oo inin soluzionesoluzione

indipendenteindipendente daldal volumevolume deldel campionecampione stessostesso V s (questorende la tecnica SPME utilizzabile per misure in situ)

-- al volume di adsorbente Val volume di adsorbente V ff-- al valore del coefficiente di ripartizione Kal valore del coefficiente di ripartizione K fsfs

Vssi riduce a:si riduce a:

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Per valori elevati di KPer valori elevati di K fsfsNei casi in cui i valori di Nei casi in cui i valori di KK fsfs non risultino elevati, gli non risultino elevati, gli analiti hanno scarsa analiti hanno scarsa affinità per la fibra e non affinità per la fibra e non sono quantitativamente sono quantitativamente estratti dalla matrice.estratti dalla matrice.

All’All’ aumentareaumentare deldel volumevolume deldelfilmfilm didi rivestimentorivestimento sullasulla fibrafibra(V(Vff)) attraversoattraverso::-- aumento dello spessore del aumento dello spessore del film di rivestimentofilm di rivestimento-- aumento della lunghezzaaumento della lunghezzadella fibradella fibra..

L'L' SPMESPME haha quindiquindi delledelle limitazionilimitazioni termodinamichetermodinamiche (è(è ununmetodometodo all’equilibrio)all’equilibrio):: inin altrealtre paroleparole sese ilil coefficientecoefficiente didiripartizioneripartizione KK fSfS èè troppotroppo piccolo,piccolo, ilil metodometodo sisi rivelarivela pocopocoefficaceefficace .

Migliorare il valore di KMigliorare il valore di K fsfs attraverso attraverso

derivatizzazione degli analiti

modificazione della modificazione della matricematrice

Reazioni di derivatizzazione possono essere usate per ridurre ad esempio la polarità di composti, aumentare il valore del K fs.

La derivatizzazione può avvenire sia in soluzione, sia " drogando " la fibra con un opportuno agente derivatizzante.

Mediante l' addizione di sali Mediante l' addizione di sali (NaCI, Na(NaCI, Na22SOSO44) si può ) si può modificare la forza ionica del modificare la forza ionica del mezzo e di conseguenza mezzo e di conseguenza variare il valore di Kvariare il valore di K fsfs . .

Anche il pH del campione Anche il pH del campione gioca un ruolo importante nel gioca un ruolo importante nel processo di estrazione, processo di estrazione, soprattutto per composti polari soprattutto per composti polari dove è importante la dove è importante la ionizzazione della molecolaionizzazione della molecola..

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MatriciMatrici solidesolide (suoli(suoli oo sedimenti)sedimenti) presentanopresentano particolariparticolari

problemiproblemi poichèpoichè ii composticomposti didi interesseinteresse nonnon possonopossono

essereessere estrattiestratti direttamentedirettamente mama devonodevono essereessere primaprima

rilasciatirilasciati oo inin fasefase acquosaacquosa oo nellonello spaziospazio didi testatesta perper

essereessere poipoi preconcentratipreconcentrati sullasulla fibrafibra..

Questo processo coinvolge il desorbimento degli analiti da materiaparticellata eventualmente presente nel campione, il tras portoconvettivo in una matrice liquida o gassosa e la diffusione d egli analitiverso la fibra.

Per composti ad alto PM e con analiti che interagiscono forte mente con lamatrice, la cinetica di rilascio è lenta e il tempo di estrazi one può essere piùlungo.

Il tempo di equilibrio dipende, anche dallo spessore dello s trato disoluzione adiacente alla fibra. Una rapida estrazione si ot tiene confibre in cui lo strato adsorbente ha uno spessore di 10-100 µm .

L'equilibrio di ripartizione è di solito veloce e viene ragg iunto in menodi 1 minuto.

è controllata dal trasporto di massa dal campione alla fibraè controllata dal trasporto di massa dal campione alla fibra

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Tecnica solvent freeTecnica solvent free

SemplicitàSemplicità - La semplicità fa di questa tecnica un’efficace alt ernativa ai metodi di estrazione tradizionali.

RapiditàRapidità – L’equilibrio può essere raggiunto in soli 2-30 min uti (dipende dall’analita). Riduzione dei tempi di preparazione dei campioni fino al 70%

SensibilitàSensibilità – Si possono determinare concentrazioni dell’ordine dei ppt.

EconomicitàEconomicità – Le fibre sono riutilizzabili (il tempo di vita delle fibre dipende dalle condizioni d’uso. Comunque è stato ve rificato che in condizioni non troppo drastiche, possono essere riutilizzate p er più di 100 estrazioni) e non ci sono costi per solventi.

VersatilitàVersatilità – Le siringhe possono essere utilizzate in combinazi one con qualunque GC o GC-MS con iniettori split/splitlesso on-column e con HPLC con la possibilità di ricorrere a sistemi di introd uzione della fibra completamente automatizzati.

PRINCIPALI VANTAGGI DELL’SPME

• Campione “pulito”; non si ha contaminazione Campione “pulito”; non si ha contaminazione della fibra con la matrice.della fibra con la matrice.

• Intorno alla fibra non ci sono solventi o acqua.• Intorno alla fibra non ci sono solventi o acqua.

• L’estrazione degli analiti per assorbimento sul • L’estrazione degli analiti per assorbimento sul rivestimento della fibra è rapido.rivestimento della fibra è rapido.

Vantaggi dell’applicazione delle fibre SPME per sistemi a Spazio di Testa

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ApplicazioniAnalisi ambientali e degli alimenti, analisi di droghe,analisi cliniche etc..

� Per quanto riguarda le analisi sull' aria, la tecnica è

stata utilizzata con successo per differenziare inquinanti

presenti in fase gassosa da quelli adsorbiti su

particolato.

� L'SPME diretta con una fibra di poli(dimetil)silossano

ha trovato notevoli applicazioni nella determinazione dei

VOCs, anche a livello di tracce, in acque potabili.

��DiverseDiverse applicazioniapplicazioni riguardanoriguardano l'l' analisianalisi deidei pesticidipesticidi ee

deglidegli erbicidierbicidi.

L' SPME, come si e detto, non utilizza solventi organ ici L' SPME, come si e detto, non utilizza solventi organ ici non solo nella fase di estrazione, ma anche in quell a non solo nella fase di estrazione, ma anche in quell a dell'iniezione cromatografica, per cui si presta ben e in dell'iniezione cromatografica, per cui si presta ben e in campo ambientale per campo ambientale per analisi in situ e onanalisi in situ e on--lineline , vista , vista anche la possibilità di utilizzo di gascromatografi anche la possibilità di utilizzo di gascromatografi portatili. portatili.

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ESEMPI APPLICAZIONI SPME

VEDERE anche LIBRETTO REACH

Condizioni per l’analisi delle NitrosammineCondizioni per l’analisi delle Nitrosammine

Sample: analytes in (water + 25% KCl, pH = 10 )

SPME Fiber: 65 µµµµm polydimethylsiloxane/divinylbenzene

Extraction: immersion, 15 min (rapid stirring)

Desorption:270 °C, 1 min

Column: PTA TM-5 (amine deactivated 5% phenyl Polydimethylsiloxane),

30 m x 0.32 mm ID, 0.5 µµµµm film

Oven: 50 °C (1 min) to 250 °C at 10°C/min, hold 2 min

Carrier: helium, 30 cm/sec

Det: GC/MS (quadrupole, selected ion mo de)

Inj.: splitless, 250 °C (0.75 mm ID lin er)

ESEMPI APPLICAZIONI SPME

10 ppb Nitrosammine in Acqua:

SPME-GC/MS

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1. Nitrosodimethylamine (NDMA)

2. Nitrosodiethylamine (NDEA)

3. Nitrosomethylethylamine (NMEA)

4. Nitrosodipropylamine (NDPA)

5. Nitrosopiperidina (N-PIP)

6. Nitrosodibutylamine (NDBA)

7. Nitrosodiphenylamine (NDPhA)

Dal punto di vista chimico le nitrosammine sono deicomposti organici caratterizzati dalla presenza del gruppoN=O legato all’atomo di azoto di un’ammina secondaria e siottengono generalmente per reazione dei nitriti con leammine secondarie .

Struttura generale di una nitrosammina (R1 e R1 sono i due gruppi sostituenti)

In ambito tossicologico è molto importante il problema delle nitrosammine poiché molte di esse sono cancerogene e la loro presenza è dovuta sia ai componenti naturali degli alimenti sia all’uso di nitriti aggiunti come additivi a insaccati, prosciutti, wurstel, carni in scatola ed altri prodotti a base di carne, pesci marinati, prodotti caseari, …

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US EPA Method 524.2 VOCs: SPME/GC

1. Dichlorodifluoromethane

2. Chloromethane

3. Vinylchloride

4. Bromomethane

5. Chloroethane

6. Trichlorofluoromethane

7. 1,1-Dichloroethylene

8. Methylene chloride

9. Trans-1,2-Dichlorothylene

10. 1,1-Dichloroethane

11. 2,2-Dichloropropane

12. Cis-1,2-Dichloroethylene

13. Chloroform

14. Bromochloromethane

15. 1,1,1-trichloroethane

16. 1,1-Dichloropropene

17. Carbon tetrachloride

18. 1,2-Dichloroethane

19. Benzene

20. Trichloroethylene

21. 1,2-dichloropropane

22. Bromodichloromethane

23. Dibromomethane

24. cis-1,3-Dichloropropene

25. Toluene

26. trans-1,3-Dichloropropene

27. 1,1,2-Trichloroethane

28. 1,3-Dichloropropane

29. Tetrachloroethylene

30. Chlorodibromomethane

31. 1,2-Dibromoethane

32. Chlorobenzene

33. 1,1,1,2-Tetrachloroethane

34. Ethylbenzene

35. M-Xylene

36. p-Xylene

37. o-Xylene

38. Styrene

39. Isopropylbenzene

40. Bromoform

41. 1,1,2,2-Tetrachloroethane

42. 1,2,3-Trichloropropane

43. n-Propylbenzene

44. Bromobenzene

45. 1,3,5-Trimethylbenzene

46. Chlorotoluene

47. 4-Chlorotoluene

48. tert-Butylbenzene

49. 1,2,4-Trimethylbenzene

50. sec-Butylbenzene

51. p-Isopropyltoluene

52. 1,3-Dichlorobenzene

53. 1,4-Dichlorobenzene

54. n-Butylbenzene

55. 1,2-Dichlorobenzene

56. 1,2-Dibromo-3-chloropropane

57. 1,2,4-Trichlorobenzene

58. Hexachlorobutadiene

59. Naphthalene

60. 1,2,3-Trichlorobenzene

Condizioni Analitiche per i VOCs

Extraction ConditionsExtraction ConditionsSample: VOCs in water + 25% NaCl

SPEME Fiber: Carboxen TM/PDMS

Extraction: headspace, 40 °C (20 min) with stirring

Desorption: 5 min, 310 °C

Chromatographic ConditionsColumn: VOCOL TM, 30 m x 0.25 mm ID, 1.5 µµµµm film

Oven: 40 °C (2 min) to 210 °C at 8 °C/min

Carrier: helium, 35 cm/sec

Injection: splitless/split (closed 2 min), 0.75 mm ID liner

Detector: ion trap, GC/MS, m/z = 45 – 260 (0.6 sec/s can)

Per composti organici volatili (VOCs) la headspace-SPME si è rivelata più efficiente

della direct-SPME.

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Determinazione di benzene, toluene, xileni piridina, Determinazione di benzene, toluene, xileni piridina, limonene, naftalene, fenolo e nicotina nelle dieci marche, limonene, naftalene, fenolo e nicotina nelle dieci marche,

di sigarette più vendute in Italiadi sigarette più vendute in Italia

Parametri Analitici

Fibra SPME: PDMS/DVB

Temperatura del campione: 40°C

Tempo di esposizione: 1 min

Metodo: SPMEMetodo: SPME--GC/MS in diluizione GC/MS in diluizione isotopicaisotopica

Campionamento: un tiro di 35 mL in 2 sec

Analisi GC/MS dopo estrazione per 1 min

con SPME

Aggiunta Std marcati con

deuterio

Campionamento fumo diretto

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Curva di Calibrazione o-Xylene

Curva di Calibrazione Naphtalene

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•La fibra aveva un rivestimento di copolimero dimetilsilossano/divinilbenzene spesso 65 µm.

• Gli analiti sono stati desorbiti dalla fibra per 2 min a 250 °C

• La Temperatura della colonna era di 30°C durante il desorbimento ed è stata poi aumentata di 10 °C min.

• La colonna era di 0.32 mm x 30 m, con uno strato di 1 µm di fenilmetilpolisilossano.

• Il rivelatore per azoto-fosforo aveva un limite di rivelabilità di 0.05 ppb.

Gascromatogramma di agenti nervini, campionati medi ante microestrazione in fase solida per 30 minuti da acqua di mare.

ANALISI DI AMFETAMINE IN URINA TRAMITE GAS CROMATOG RAFIA

Introduzione dl campione tramite desorbimento di SPME

Introduzione di campione gassoso prelevato tramite una siringa

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MiglioramentoMiglioramento nella costruzione delle fibre nella costruzione delle fibre

per aumentarne le prestazioni.per aumentarne le prestazioni.

MiglioramentoMiglioramento nella copertura delle fibre SPME per nella copertura delle fibre SPME per

migliorarne le variabili attraverso:migliorarne le variabili attraverso:

-- controllo della porositàcontrollo della porosità

-- ottimizzazione del processo di condizionamentoottimizzazione del processo di condizionamento

SviluppoSviluppo di nuove fasi per la copertura delle fibre (la messa a di nuove fasi per la copertura delle fibre (la mes sa a

punto di fibre con fase a scambio ionico potrà punto di fibre con fase a scambio ionico potrà

costituire un valido strumento per l'estrazione dicostituire un valido strumento per l'estrazione di

specie anche metalliche).specie anche metalliche).

http://www.sigmaaldrich.com/europe/events/spme-usermeeting-italy.html