MICROBIOLOGIA E LABORATORIO

CORSO IFTS

“TECNICO SUPERIORE DEI PRODOTTI AGROALIMENTARI”

PROF. G. D’ANGELO

LA MICROBIOLOGIA

• La Microbiologia studia i batteri, le alghe, i funghi, i protozoi, i virus e, di conseguenza, le sue branche hanno assunto la loro denominazione da questi microrganismi (Batteriologia, Immunologia, Algologia, Micologia, Protozoologia, Virologia)

• La Microbiologia ha molte aree di applicazione tanto nel campo alimentare e farmaceutico, quanto in quello delle malattie dell’uomo, degli animali e dei vegetali. Esiste poi una microbiologia del suolo e delle acque.

• La Microbiologia degli alimenti si interessa anche della prevenzione del degrado del prodotto alimentare, del miglioramento dei prodotti in termini di valore nutritivo, di aroma, di sapore e della qualità generale dell’alimento.

• La Microbiologia dei prodotti lattiero-caseari si interessa della manifattura dei formaggi, degli yogurt e di altri prodotti similari. Un’altra importante prerogativa di questo settore è quella della produzione di alimenti privi di microrganismi patogeni..

CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEL LABORATORIO

• DISINFEZIONE E PRINCIPALI DISINFETTANTI CHIMICI

1. ALCOOLI2. ALDEIDI3. FENOLI4. ALOGENI5. OSSIDANTI6. ACIDI E ALCALI7. DETERGENTI SINTETICI8. AMMONIO QUATERNARIO9. METALLI PESANTI

1. ALCOOL ETILICO, ISOPROPILICO, GLICOLE BUTILENICO (DENATURAZIONE DELLE PROTEINE)2. ALDEIDE FORMICA, ALDEIDE GLUTARICA (FORMALINA = 40% VOL, LISOFORMIO = FORMALDEIDE IN

SOLUZIONE SAPONOSA, PARAFORMIO = FORMALDEIDE IN COMPRESSE O TAVOLETTE)3. ACIDO FENICO o FENOLO, CRESOLO (2-metilidrossibenzene [o-cresolo]. il cresolo si presenta come un

liquido scuro oleoso all’apparenza. E’ composto dal 50% di oli aromatici e cresoli; questi ultimi sono la sostanza attiva e sono presenti in concentrazione compresa tra il 17 e il 18%. Il resto è costituito da acqua e tensioattivi (detergenti) che hanno il compito di disperdere la parte attiva nell’acqua di diluizione; ), LISOLO (soluzione saponosa di cresolo grezzo, dotata di potere disinfettante ), CREOLINA (La composizione era formata da olio di catrame, saponi, soda caustica e pochissima acqua. I suoi usi divennero molteplici, a partire dal campo umano, zootecnico, civile e veterinario. Inoltre, l'uso della creolina, in campo di opere di restauro motoristico, viene usata per riportare allo splendore

originale di fonderia, le parti in alluminio macchiate da olio e dai vapori dello stesso ), ECC.• CLORO, IPOCLORITI (moscan 15% cloro attivo, caporite: ipoclorito di calcio ) , CLORAMINE (Derivati

dell’ammoniaca (uno o più atomi di idrogeno vengono sostituiti con il cloro) Ha la stessa attività degli ipocloriti, ma più lenta e dura più a lungo Se ingerita può provocare insufficienza respiratoria, AMUCHINA (OSSICLORURO DI CALCIO)

1. ACQUA OSSIGENATA, AC. PERACETICO2. Ac. CLORIDRICO, SOLFORICO, IDROSSIDI, CARBONATI3. DETERGENTI ANIONICI, CATIONICI(COMPOSTI QUATERNARI DELL’AMMONIO), ANFOLITI4. MERCURIO, ARGENTO5. FUNGICIDI, ANTISETTICI SPRAY A BASE DI FENOLO E AMMONIO QUATERNARIO, SAPONI NEUTRI A

BASE DI O-FENILFENOLO

Il cloro uccide gli agenti patogeni come batteri e virus rompendo i legami chimici delle loro molecole. I disinfettanti usati a tale fine consistono in composti di cloro che possono scambiare atomi con altri composti, quali enzimi batteri ed altre cellule. Quando gli enzimi entrano in contatto con il cloro, uno o più atomi della molecole di idrogeno sono sostituiti dal cloro. Ciò la deformazione o il deterioramento dell'intera molecola. Quando gli enzimi non funzionano correttamente, la cellula o il batterio muoiono.

Quando si aggiunge all'acqua cloro, si formano gli acidi ipocloritici:

Cl2 + H2O -> HOCl + H+ + Cl-

A seconda del valore del pH una parte degli acidi ipocloridrici si trasforma in ioni ipoclorito:

Cl2 + 2H2O -> HOCl + H3O + Cl-HOCl + H2O -> H3O+ + OCl-

Essi si scindono in ioni di cloro e ossigeno:

OCl- -> Cl- + O2-

L'acido ipocloroso (HOCl, che è elettricamente neutro) e gli ioni ipoclorito (OCl-, elettricamente negativi) formano cloro libero quando legati insieme, realizzando la disinfezione. Le due sostanze hanno un comportamento diverso. L'acido ipocloridrico è più reattivo ed è un disinfettante più forte rispetto all'ipoclorito. Esso inoltre e' scisso in acido cloridrico (HCl) ed ossigeno atomico (O). L'atomo di ossigeno è un potente disinfettante. Le proprietà di disinfezione del cloro in acqua si basano sul potere ossidante degli atomi di ossigeno liberi e sulle reazioni di sostituzione del cloro.

L'acido peracetico (C2H4O3) e' una miscela di acido acetico (CH3COOH) e perossido di idrogeno (H2O2) in una soluzione acquosa. E' un liquido luminoso, incolore che ha un odore pungente a pH basso (2,8). L'acido paracetico e' prodotto tramite reazione tra perossido di idrogeno ed acido acetico:

O                              O||                             ||CH3-C-OH + H2O2 -> CH3C-O-OH + H2O

acido acetico + perossido di idrogeno -> acido peracetico

L'acido peracetico può anche essere prodotto tramite ossidazione dell'acetaldeide. L'acido peracetico è prodotto solitamente in concentrazioni di 5-15%. Quando l'acido peracetico si dissolve in acqua, si scinde in perossido di idrogeno ed acido acetico, degenerano in acqua, ossigeno e anidride carbonica. I prodotti di degradazione dell'acido paracetico non sono tossici e possono dissolversi facilmente in acqua. L'acido peracetico è un ossidante molto potente; il potenziale di ossidazione supera quello di cloro e diossido del cloro.

Il cloruro di benzalconio (o benzalconio cloruro) è una miscela di sali di ammonio quaternari, più esattamente è una miscela di cloruri di alchil-benzil-dimetilammonio, in cui il gruppo alchile varia dall'ottile (C8H17-) all'ottadecile (C18H37-).A temperatura ambiente è un solido giallo chiaro deliquescente (fonde a bassa temperatura), molto solubile in acqua, in acetone e in etanolo, dall'odore aromatico intenso.Trova impiego principalmente cone battericida e spermicida in numerosi preparati destinati all'uso quotidiano: disinfettanti, colliri, collutori, creme spermicide.

Tego® 51 è un disinfettante anfotero ad alta tensioattività, di sicura e rapida azione contro lieviti, funghi, batteri grampositivi e gramnegativi, inodoro.Tego® 51 è utilizzato nella disinfezione di pareti, pavimenti, piani di lavoro, apparecchiature, nastri trasportatori precedentemente detersi.

• DISINFETTANTI• Etanolo (alcool etilico), isopropanolo (alcool isopropilico) : Ampio spettro d'azione, rapida attività senza residui

nell'ambiente; non è attivo sulle spore e sulle oocisti dei coccidi, per l'azione battericida il tempo richiesto è di 5-10 min., troppo lungo rispetto all'alta percentuale di evaporazione. Agiscono distruggendo le membrane cellulari in seguito a estrazione dei lipidi, nonché denaturando le proteine microbiche e disidratando la cellula microbica; quando l’alcool si trova in forma idrata viene rapidamente assorbito e penetra all’interno della cellula; viceversa l’alcool puro tende a richiamare acqua sulla superficie cellulare e a produrre fenomeni coagulativi nella membrana citoplasmatica, che proteggono parzialmente le cellule batteriche dal disinfettante;

• Iodoformi (Lo iodoformio (nome IUPAC: triiodometano) è un alogenuro alchilico. A temperatura ambiente si presenta come un solido giallo.Trova impiego come antisettico e disinfettante; si ottiene dalla reazione dello iodio e dell'idrossido di potassio con l'alcol metilico.): Ampio spettro d'azione, bassa tossicità acuta, tempo d'attività antimicrobica elevato, associabile ad altri disinfettanti, possibilità di colorazioni delle superfici trattate, potere corrosivo sui metalli, molto tossico per gli anfibi, inefficace contro Cryptosporidium spp., possono risultare caustici se non vengono diluiti.

• Fenoli: Ampio spettro d'azione, irritazioni cutanee da frequente uso, alcune formulazioni sono inefficaci contro i virus, oocisti di coccidi, spore batteriche, trattenute da materiale poroso, difficoltà di eliminazione da esso, possono essere molto tossici per i rettili. L’azione germicida del fenolo sembra associata alla sua capacità di denaturare le proteine. Il fenolo in soluzione si adsorbe sulle cellule batteriche e riesce ad oltrepassare la membrana per le sue proprietà lipofile. Si lega quindi (attraverso legami idrogeno) alle proteine batteriche, alterandone la struttura e compromettendo la loro attività naturale. 

• Sali quaternari d'ammonio (es. benzalconio cloruro benzalconio cloruro): Elevato spettro d'azione, basso costo, medio-bassa tossicità,agente di scelta contro Cryptosporidia spp., l'attività disinfettante può essere ridotta dal contatto di sapone ed acqua "dura", materiale organico, fibre (cotone, lana), inefficace contro oocisti e spore, spesso inefficace contro Pseudomonas.

• Ipoclorito di sodio (varechina, amuchina): Poco costoso, ampio spettro di attività anche contro alcuni virus, rapida azione disinfettante, non facilmente miscelabile ad altri disinfettanti/detergenti.

• Glutaraldeide: Elevata azione disinfettante, sterilizzante per la strumentazione in ca. 10 ore, irritante, corrosivo, elevata attività residua nell'ambiente, elevata tossicità.

• Perossido di idrogeno (acqua ossigenata), acido acetico: Bassa tossicità acuta, corrosivi per alcuni metalli. • Ossido di etilene: Per la sterilizzazione degli strumenti, molto tossico per l'uomo e gli animali, esplosivo e

infiammabile ad elevate concentrazioni, cancerogeno, costoso. L'ossido di etilene uccide batteri, muffe e funghi; trova uso come agente sterilizzante come alternativa alla pastorizzazione per quei prodotti che verrebbero danneggiati dal calore. Viene inoltre usato per la sterilizzazione dei materiali e degli strumenti usati in chirurgia.

• La maggior parte dell'ossido di etilene trova impiego come intermedio nella produzione di numerosi altri composti chimici. Il principale di essi è il glicol etilenico, usato nell'industria automobilistica come antigelo e come liquido di raffreddamento. Viene usato anche nella preparazione dei poliesteri.

FILTRAZIONEQUANDO IL MATERIALE NON PUO’ ESSERE STERILIZZATO SI FILTRA CON FILTRIDI CAOLINO, FARINA FOSSILE, ACETATO DI CELLULOSA AVENTI PORI DIDIAMETRO OPPORTUNO(micron)L’apertura in micron dei pori delle membrane è la seguente:• Lieviti 0,8• Flora batterica del vino 0,65• Sterilizzazione dell’acqua 0,2• Flora microbica dell’acqua 0,45

ULTRASUONI• CON FREQUENZE SUPERIORI AI 20 K HERTZ NELLE CELLULE SI VERIFICANO

PRECIPITAZIONI DI PROTEINE, ROTTURA DI MOLECOLE COMPLESSE, COAGULAZIONE, ECC. Efficaci sono i trattamenti, da 2 a 20 minuti, con frequenze da 175 a 1500 K Hertz

RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE• Raggi gamma: < di 1 nm (ottenuti per bombardamento del Co-60. Uso permesso solo

per la inibizione della germogliazione di patate, cipolle e aglio e per la sterilizzazione di materiali monouso)

• Raggi X: da < di 1 nm a 100 nm• Raggi ultravioletti: da 100 a 380 nm (prodotti da lampade a vapori di mercurio, non

hanno azione sulle spore batteriche)• Luce bianca: da 380 nm a 750 nm• Raggi infrarossi:da 750 nm a < di 1mm• Microonde: da < di 1 mm a 12 cm• Onde radio: > 12 cm

STERILIZZAZIONE

• LA STERILIZZAZIONE SI PREFIGGE LA DISTRUZIONE DI OGNI ORGANISMO VIVENTE, SPORE BATTERICHE COMPRESE

• LA STERILIZZAZIONE PUO’ AVVENIRE MEDIANTE CALORE UMIDO IN AUTOCLAVE A 121°C PER 15 min. O MEDIANTE CALORE SECCO IN STUFE TERMOSTATICHE A 180°C PER 1 ORA (VETRERIA E MATERIALE DI LABORATORIO)

• STERILIZZAZIONE PER FLAMBATURA

PASTORIZZAZIONE• E’ UN PROCESSO DI RISANAMENTO INDUSTRIALE IN CAMPO

ALIMENTARE. AD ESEMPIO IL LATTE VIENE PASTORIZZATO A 72°C PER ALMENO 15 SECONDI

TECNICHE DI CONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI

Microrganismi

T.C° minima T.C° massima T.C° optimum Generi/Specie

Psicrofili -5/+5 15/20 12/15

Psicrotrofi -5/+5 30/35 25/30 Pseudomonas,Aeromonas,Yersinia, Listeria, Clostridium,stafilococchi, salmonelle,lieviti, muffe

Mesofili -5/+15 35/47 30/40

Termofili 30/45 60/90 55/75

Tranne Listeria monocytogenes e yersinia enterocolitica, i principali batteri patogeni responsabili di intossicazioni alimentari (Clostridium botulinum, C. perfrigens, stafilococchi salmonelle) sono inibiti sotto i 3°C

CONGELAMENTO E SURGELAMENTO• La differenza tra tale tecnica di conservazione e il congelamento è che nel primo

caso le basse temperature vengono raggiunte più rapidamente fino al cuore dell’alimento, in questo modo l’acqua e i liquidi cellulari solidificando formano dei piccolissimi cristalli; nel congelamento, invece, i tempi più lunghi determinano la formazione di cristalli più grandi i quali nel processo di dilatazione provocano delle lesioni nei tessuti cellulari e, nella successiva fase di scongelamento, una maggiore perdita di liquidi

• Il surgelamento è regolato da una precisa legislazione secondo la quale i cibi devono essere portati ad una temperatura di -18 °C in un tempo massimo di 4 ore, una volta surgelati devono essere venduti in confezioni chiuse che riportino precise indicazioni relative alla conservazione e alla procedura ottimale di scongelamento e, inoltre, deve essere rispettata la catena del freddo senza interruzioni dall’iniziale

surgelamento fino al momento dell’acquisto.Infatti la sopravvivenza di un batterio in sospensione acquosa portata a -18°C è molto più alta che non a -2°C. Infatti le basse temperature mantengono una maggiore integrità enzimatica. Non a caso i ceppi microbici vengono conservati a bassissima temperatura(neve carbonica o azoto liquido)

• Le categorie alimentari che possono essere sottoposte a surgelazione sono la carne e i derivati, il pesce, le verdure e gli ortaggi, i prodotti lattiero-caseari, gli alimenti precotti.

ESSICCAMENTO• L’acqua funziona da solvente dei nutrienti e come agente chimico nelle

reazioni di idrolisi, dalle quali si ottengono composti (amminoacidi, carboidrati, grassi) fondamentali per la formazione di nuove molecole e per la produzione di energia

• Attività dell’acqua: indica l’acqua libera di un mezzo disponibile per reazioni chimiche. Aw = n2/(n1+n2) n1 = numero di molecole di soluto; n2 = numero di molecole di solvente. Aw diminuisce con l’aumentare della concentrazione.

LIOFILIZZAZIONE• Consiste nell’allontanamento dell’acqua per sublimazione. Il prodotto finito

ha un contenuto in acqua del 2-5% facilmente reidratabile. La liofilizzazione non distrugge la flora microbica

ADDITIVI CONSERVANTI• I conservanti hanno lo scopo di distruggere la microflora presente negli

alimenti per ritardarne i processi alterativi o per conservare nel tempo le caratteristiche chimico-fisiche e/o esaltarne favorevolmente particolari caratteristiche di aspetto, forma sapore, odore Un additivo alimentare diventa, esso stesso o un suo derivato, un componente dell’alimento medesimo

• La maggior parte dei conservanti agisce in ambiente acido. L’intervallo di pH per la moltiplicazione batterica varia da 4,5 a 9 con un optimum a pH 7. I batteri lattici sopportano ambienti acidi sotto 3,5

• Nelle carni l’assenza dell’ossigeno determina la diminuzione del pH per via della fermentazazione lattica

• L’azione antimicrobica del cloruro di sodio è legata al suo effetto di depressione dell’attività dell’acqua (Aw = n2/n1+n2 dove n1 = numero di molecole di soluto e n2 = numero di molecole di solvente) e per gli ioni cloro liberati.

• In salumeria si impiegano i nitrati di sodio e potassio che vengono trasformati dai batteri alotolleranti in nitriti.

• Per gli alimenti si usano additivi conservanti organici quali il difenile e gli acidi sorbico, formico, propionico che agiscono in particolare contro funghi e lieviti

ANTIMICROBICI  Nota: La lettera E indica che il singolo additivo è stato approvato dalla CEE. Tutti gli additivi, approvati e non, riportano attualmente la E.

Cod. Denominazione chimica Eventuale tossicità

E 200 Acido sorbico --

E 201 Sodio sorbato --

E 202 Potassio sorbato --

E 203 Calcio sorbato --

E 210 Acido benzoico

Sostanza particolarmente tossica, con dose massima giornaliera accettabile, secondo le tabelle del comitato FAO/OMS molto bassa ( 5 mg per Kg di peso al giorno).

E 211 Sodio benzoato Come sopra

E 212 Potassio benzoato Come sopra

E 213 Calcio benzoato Come sopra

E 214 Etile p-ossibenzoato Come sopra

E 216 Propile p-ossibenzoato Come sopra

E 217Sale sodico dell'estere propilico dell'acido p-

ossibenzoicoCome sopra

E 218 Metil-p-ossibenzoato Come sopra

E 219Derivato sodico dell'est. met. delI'acido p-

ossibenzoicoCome sopra

E 220 Anidride solforosaSostanza abbastanza tossica, interferisce col

metabolismo di alcuni aminoacidi ed inattiva la Vit.B1.

E 221 Sodio solfito Poduttore di E220, ha gli stessi effetti tossici

E 222 Sodio bisolfito Come sopra

E 223 Sodio metabisolfito Come sopra

E 224 Potassio metabisolfito Come sopra

E 226 Calcio solfito Come sopra

E 227 Calcio bisolfito Come sopra

E 228 Potassio solfitoacido Come sopra

230 Difenile

Sostanza molto tossica ( dose giornaliera accettabile pari a 0,005 mg per kg di peso al giorno). Attenzione, è usato come antimuffa sugli agrumi.

E 231 OrtofenilfenoloDella stessa categoria del difenile, composto

molto tossico.

E 232 Orfofeilfenato di sodio Come sopra

E 233 Tiobendazolo Tossico

E 235 Pimaricina Tossico

E 236 Acido formico Tossico

E 237 Formiato di sodio Tossico

E 238 Formiato di calcio Tossico

E 239 Esametilentetramina Tossico

E 240 Aldeide formica Tossica e canceroren

SOSTANZE DESTINATE PRINCIPALMENTE AD ALTRI USI,MA AVENTI UN EFFETTO CONSERVATIVO SECONDARIO

  Cod. Denominazione chimica Eventuale tossicità

E 249 Potassio nitrito

Si possono formare composti chiamati "nitrosamine", alcune delle quali sono ritenute cancerogene. Se questi composti sono associati all'acido ascorbico (Vit.C), denominato E300, E301, E302, questo rischio diminuisce.

E 250 Sodio nitrito Come sopra

E 251 Sodio nitrato Come sopra

E 252 Potassio nitrato Come sopra

E 260 Acido acetico --

E 261 Potassio acetato --

E 262 Sodio diacetato --

E 263 Calcio acetato --

E 270 Acido lattico --

E 280 Acido propionico --

E 281 Sodio propionato --

E 282 Calcio propionato --

E 283 Potassio propionato --

E 290 Anidride carbonica --

E 325 Sodio lattato --

E 326 Potassio lattato --

E 327 Calcio lattato --

E234 Nisina Antibiotico

ANTIOSSIDANTI 

E 300 Acido L-ascorbico --

E 301 Sodio L acorbato --

E 302 Calcio L ascorbato --

E 304 L ascorbile palmitato --

E 306Estratti di origine naturale ricchi di tocoferoli --

E 307 Alfa tocoferolo di sintesi --

E 308Gamma tocoferolo di sintesi --

E 309 Delta tocoferolo di sintesi --E 310 Gallato di propile Sostanza sospetta

E 311 Gallato di ottile Come sopra

E 312 gallato di dodecile Come sopra

E 320 ButilidrossianisoloSostanza sospetta, perchè non presente in natura

E 321 Butilidrossitoluolo Come sopra

E330 Acido citrico --

E 331 Citrati di sodio --

E 332 Citrati di potassio --

E 333 Citrati di calcio --

E 335 Tartrati di sodio --

E 336 Tartrati di potassio --

E 337Tartrato doppio di sodio e potassio

--

STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI

 

STABILIZZANTI, ADDENSANTI E GELIFICANTI

 

E 339 Ortofosfati di sodio --

E 340 Ortofosfati di potassio --

E 341 Ortofosfati di calcio --

E 400 Acido alginico --

E 401 Alginato di sodio --

E 402 Alginato di potassio --

E 403 Alginato di ammonio --

E 404 Alginato di calcio --

E 405 Alginato di propilenglicol --

E 406 Agar-agar --

E 407 Carragenani --

E 410 Farina di semi di carrube --

E 412 Farina di semi di guar --

E 413 Gomma adragante --

E 414 Gomma arabica --

E 415 Gomma xantano --

E 420 Sorbitolo --

E 420 Sciroppo di sorbitolo --

E 421 Mannitolo --

E 422 Glicerolo --

E 440 a) pectina --

E 440 b) pectina amidata --

E 450 a-i) pirofosfato disodico

Sono conosciuti più comunemente col nome generico di polifosfati.Alcuni Autori hanno osservato fenomeni di ipocalcemia e lesioni renali, dovuti ad assunzioni continue e massicce , mentre altri hanno costatato accumulo di fosfati di calcio nelle reni.

E 450 a-ii) pirofosfato trisodico come sopra

E 450 a-iii) pirofosfato tetrasodico c.s.

E 450 a-iv) pirofosfato tetrapotassico c.s.

E 450 b-i) trifosfato pentasodico c.s.

E 450 b-ii) trifosfato pentapotassico c.s.

E 450 c-i) polifosfati di sodio c.s.

E 450 c-ii) polifosfati di potassio c.s.

E 460 i) cellulosa microcristallina --

E 460 ii) cellulosa in polvere --

E 461 metilcellulosa --

E 463 Idrossipropilcellulosa --

E 464 Idrossipropilmetilcellulosa --

E 465 Metiletilcellulosa --

E 466 Carbossimetilcellulosa --

-- Gelatine animali

EMULSIONANTI

 

E 322 lecitina --

E 470sali di sodio, di potassio o di calcio degli acidi grassi --

E 471mono e digliceridi degli acidi grassi --

E 472a) esteri acetici del mono e digliceridi degli ac. grassi --

E 472b) esteri lattici del mono e digliceridi degli ac. grassi --

E 472c) esteri citrici dei mono e digliceridi degli ac. grassi --

E 472d) esteri tartarici del mono e digliceridi degli ac. grassi --

E 472e) esteri mono e diacetiltartarici dei mono e digl.. degli ac. grassi.

--

E 473f) esteri misti acetico tartarici del mono e digl.. degli ac. grassi

--

E 473 sucresteri --

E 474 sucrogliceridi --

E 475esteri poligliceridi degli acidi grassi --

E 477esteri del propilenglicol con gli acidi grassi --

E 481 stearoil 2 lattilato di sodio --

E 482 stearoil 2 lattilato di calcio --

E 483 tartatro di stearoile --

ESALTATORI DI SAPIDITÀ

 

E 621 glutammato monosodico

Sostanza eccitante del sistema nervoso.Se usata in quantità eccessiva, può provocare sintomi definiti come "sindrome del ristorante cinese"(questo tipo di cucina ne fà abbondante uso), che consistono in irritabilità, cefalea, insonnia.

E 260 acido acetico --

E 270 acido lattico --

E 300 acido L ascorbico --

E 330 acido citrico --

E 334 acido tartarico --

 

SOSTANZE AROMATIZZANTI ARTIFICIALI

  aldeide paratoluica

allilcicloesanpropionato

allile capronato

dimetilresorcina

etilacetilacetato

etilbetanaftolo

etilvanillina

metilamilchetone

metilciclopentenolone

metile eptilcarbonato

metilionone

naftilmetilchetone

ossicitronellale

propenilguaetolo

undecalattone

• Conservanti nocivi Acido benzoico e suoi sali (E210, E211, E212, E213): sono usati da soli o insieme

all'acido sorbico e ai PHB. Non sono ammessi in alcuni paesi per la loro potenziale tossicità, inoltre gli alimenti ai quali vengono aggiunti sono soprattutto le confetture, le gelatine, le marmellate, le gomme da masticare e le bevande analcoliche, tutti prodotti che non necessitano di conservanti.,

Anche gli esteri dell'acido p-Idrossibenzoico (E214, E215, E216, E217, E218, E219), indicati con la siglia PHB, sono vietati in alcuni paesi. Vengono addizionati ai patè, ai rivestimenti di gelatina dei prodotti a base di carne, alla frutta in guscio ricoperta.

I derivati dell'anidride solforosa (E220, E221, E222, E223, E224, E226, E227, E228) sono irritanti e hanno una tossicità acuta e cronica, per esempio interagiscono con gli enzimi cellulari e distruggono alcune vitamine (per esempio la tiamina). Vengono usati nel vino, nella birra (anche per questo bisogna moderarne il consumo, non solo per l'alcol) e in altre bevande come i succhi di frutta, nella senape e in altri condimenti.

I derivati fenolici e il tiabendazolo (E230, E231, E232 , E233) sono dotati di una certa tossicità, infatti sono proibiti in Australia. Vengono utilizzati per il trattamento superficiale degli agrumi e delle banane (per questo bisognerebbe usare solo la scorza delle arance non trattate).

La netamicina (E235), un antibiotico utilizzato sulla superficie dei formaggi, (soprattutto dei provoloni) provoca problemi intestinali.

I nitriti (E249 ed E250) e i nitrati (E251 ed E252) sono utilizzati nei salumi e nelle carni conservate.

• Conservanti innocui Sono i sorbati (E 200, E202, E203), l'acido acetico e i suoi sali di potassio E260, E261,

E262, E263, l'acido lattico e i suoi sali di sodio (E270, E325, E326, E327), l'acido propionico e i suoi sali (E280, E281, E282, E283), l'anidride carbonica (E 290).

Gli additivi 'naturali' 

•AcetoL'aceto è frutto della fermentazione del vino. Noto fin dal tempo dei Romani, veniva usato anche come dissetante.L'aceto è impiegato come conservante per le verdure (sottaceti) e nella fase di preparazione delle verdure (scottatura o bollitura) per la successiva conservazione sotto'olio.

•AlcoolL'alcool ha la proprietà di creare un ambiente poco favorevole allo sviluppo di microrganismi già da concentrazioni superiori al 15%. Puro o come liquore, es. grappa, viene impiegato per la conservazione di frutta come albicocche, amarene, ciliege, prugne, uva.

•LimoneIl succo del limone è un buon antiossidante. Viene usato per evitare che verdure e frutta diventino nere dopo il taglio (es. carciofi, melanzane, macedonia di frutta ecc.)

•OlioOttenuto dalla spremitura delle olive (o per estrazione dalle arachidi, girasole, mais, soia ecc.) permette la conservazione degli alimenti isolandoli dall'aria e quindi dai germi.Acciughe, funghi, ortaggi, sgombro e tonno sono i principali alimenti conservati sott'olio.

•SaleUno dei metodi più antichi di conservazione degli alimenti. Usando il sale è possibile conservare gli alimenti in due modi:Salatura: consiste nello stipare il prodotto alternando strati di sale all'alimento. La conservazione, in un periodo iniziale, deve avvenire pressando il prodotto.La salatura è usata soprattutto per acciughe e baccalà, ma anche per i capperi, la bresaola ed altri insaccati.Salamoia: consiste nel conservare il prodotto in una soluzione di acqua e sale (circa 10%).La salamoia è usata soprattutto per olive ed ortaggi.

•ZuccheroLo zucchero in elevate concentrazioni impedisce la fermentazione. Con il 60-70% di zucchero le marmellate si riescono a conservare per lunghi periodi senza difficoltà.Soluzioni zuccherine con concentrazioni più basse, circa 20-25%, consentono, previa sterilizzazione, la conservazione della frutta.Vari sono i tipi di zucchero: fruttosio - nella frutta e nel miele,glucosio - nella frutta e nel miele,lattosio - nel latte,maltosio - dai cereali, saccarosio - deriva dalla canna da zucchero o dalla barbabietola da zucchero, è il più usato nelle nostre case.

ALTRE TECNICHE DI CONSERVAZIONE• AFFUMICATURA (La conservazione deriva in parte dal calore e in misura minore dalla

penetrazione di sostanze gassose come aldeide formica, fenoli, ecc)• SALAGIONE• ZUCCHERAGGIO• ATMOSFERA MODIFICATA (Sottovuoto o aggiunta di anidride carbonica). Per alcuni ortaggi

la miscela gassosa contiene l’1% di ossigeno e percentuali di anidride carbonica variabili dallo 0,5 al 5%. La conservazione dei formaggi freschi può essere garantita da un’atmosfera modificata contenente 61% di CO2, 26% di N2 e 7% di O2

IL MICROSCOPIO La costruzione del primo microscopio si deve ad un mercante olandese di tessuti Antonj Van

Leeuwenhoek (1632-1723). Per primo vide e descrisse gli animalcula (protozoi, batteri, alghe e lieviti)

• Indice di rifrazione dell’olio di legno di cedro: 1,515(molto vicino a quello del vetro 1,555). L’olio di cedro(Juniperus virginiana) aumenta il potere risolutivo dell’obiettivo fornendo una immagine più chiara ed un ingrandimento maggiore.

• Microscopio ottico

1. Microscopio semplice2. Microscopia in campo oscuro3. Microscopia in contrasto di fase4. Microscopia in contrasto interferenziale5. Microscopia a fluorescenza6. Stereomicroscopia

. Microscopio elettronico1. M.E. a trasmissione2. M.E. a scansione

Microscopio a fluorescenzaQuesto tipo di microscopio serve per apprezzare la disposizione delle molecole. La sorgente luminosa, che trasmette radiazioni ultraviolette, eccita il preparato dall'alto, infatti si parla di epifluorescenza. Le componenti del preparato emettono luce di lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla sorgente luminosa, questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza. Gli obiettivi usati per questo tipo di osservazione sono quelli a fluorite.Microscopio a contrasto di faseLa maggior parte di componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere dei dati, cioè delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. Microscopio ad interferenzaSi attua con due onde: una attraversa il preparato che, se non è omogeneo, deforma l'onda, che si incontra con la seconda onda non deformata, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili sulle sostanze presenti nel provino. Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro ma fornisce immagini più contrastate e con un effetto "tridimensionale". Questo metodo di contrasto è conosciuto con il nome di "DIC" (differential interference contrast)oppure "Normaski", dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova negli odierni microscopi a contrasto interferenziale.Ultramicroscopio(M. a campo oscuro) è un microscopio ottico con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo che ferma i raggi che illuminerebbero direttamante il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati, "diffratti". La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici: effetto Tyndall.Microscopio stereoscopicoMentre il microscopio composto osserva il campione attraverso un'unica direzione, quello stereoscopico lo osserva da due angoli leggermente diversi e ne ottiene le due immagini necessarie per la visione stereoscopica. In questo modo, lo stereomicroscopio fornisce una visione tridimensionale degli oggetti, mentre attraverso quello composto gli oggetti appaiono piatti, senza volume. Il microscopio composto osserva gli oggetti per trasparenza e produce 50-1200 ingrandimenti. Il microscopio stereoscopico, invece, osserva gli oggetti principalmente per mezzo della luce riflessa e il suo ingrandimento, tipicamente compreso fra 8-50 volte, è molto inferiore a quello del microscopio composto. Con il microscopio stereoscopico, non è dunque possibile osservare microbi, ma esiste ugualmente una grande varietà di oggetti naturali che si possono osservare con questo tipo di strumenti

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)Il microscopio elettronico a trasmissione fa attraversare un campione molto sottile (da 5 a 500nm) da un fascio di elettroni, quindi con un insieme di magneti (che funzionano come le lenti del microscopio ottico) ingrandisce l'immagine ottenuta che viene infine proiettata su uno schermo fluorescente rendendola visibile. Dà immagini della struttura interna dell'oggetto esaminato, al contrario del SEM che ne dà solo la superficie, ma permette si ottenere solo immagini 2D. Raggiunge i nanometri, permettendo di vedere anche le molecole più piccole.Ulteriori miglioramenti hanno prodotto il HRTEM (high resolution trasmition electron microscope), con cui è stato possibile distinguere i singoli atomi di litio in un composto. Microscopio elettronico a scansione (SEM)Il microscopio elettronico a scansione, al contrario di quello a trasmissione, ricava l'immagine illuminando con un fascio di elettroni un oggetto anche relativamente grande (un insetto per esempio) e rilevando gli elettroni secondari riflessi, e può quindi fornire immagini 3D. Può analizzare solo oggetti conduttori o semi-conduttori. Gli oggetti organici devono quindi essere prima rivestiti con una sottile lamina metallica. Questo strumento ha la necessità di operare in condizioni di vuoto elevato: per questo è stato sviluppato il microscopio elettronico ambientale a scansione che, libero da questo vincolo, è in grado di analizzare campioni di materiale organico conservandone le condizioni di temperatura, pressione ed umidità. Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM)Questo particolare tipo di microscopio consente di analizzare la superficie di un campione conduttore o semiconduttore drogato utilizzando, come sensore, una punta cresciuta su di un cristallo singolo di tungsteno e rastremata alla sommità fino allo spessore di un singolo atomo: a questa punta, posta ad una distanza molto ravvicinata dal campione, viene applicata una piccola tensione (circa 0.02 V) rispetto al campione. Data la particolare conformazione del sensore, si ha la certezza che gli elettroni fluiranno tutti dalla punta verso il campione per effetto tunnel. Poiché la corrente varia con la distanza della punta del sensore dalla superficie del campione, è possibile tramite un processo di retroazione mantenere costante tale distanza, muovendo la punta sull'asse ortogonale alla superficie del campione con la precisione garantita da un attuatore piezoelettrico. Effettuando quindi una scansione su tutta la superficie del campione e registrando punto per punto i valori della corrente, è possibile ricostruirne un modello tridimensionale. Mediante tale tecnica, si riesce a raggiungere precisioni molto elevate, fino a 4 Å. Microscopio a forza atomica (AFM)Il microscopio a forza atomica permette di effettuare analisi non distruttive di superfici, con una risoluzione inferiore al nanometro (un miliardesimo di metro). Una sonda di dimensioni dell'ordine del micrometro (un milionesimo di metro) esplora la superficie da analizzare, a contatto o a brevissima distanza da essa (circa 10 angstrom). Interagendo con gli atomi del campione, per effetto delle forze di Van der Waals, subisce microscopiche deflessioni che, attraverso un sensibilissimo dispositivo (leva ottica), vengono tradotte nei dettagli di un'immagine topografica della superficie del campione. Rispetto allo Scanning Electron Microscope (SEM) e allo Scanning Tunnelling Microscope (STM), il microscopio a forza atomica ha il vantaggio di consentire analisi non distruttive e di adattarsi anche a campioni di materiale non conduttore. Tipicamente viene impiegato per esaminare wafer semiconduttori, compact disc e altri supporti magnetici

I BATTERI• Con Pasteur (1822-1895) si chiude la controversia sulla generazione spontanea,

radicata fin dall’antichità con Aristotele e confutata in un primo tempo nel 1665 da Francesco Redi e in seguito da Lazzaro Spallanzani (1729-1799)

• Le dimensioni dei batteri sono dell’ordine di 0,5-2 micron e l’aspetto morfologico può essere: bastoncellare (bacilli), sferico (cocchi), corto e tozzo (cocco-bacillo), filamentoso (vibrioni e spirilli)

• I cocchi possono assumere diverse posizioni: diplococchi (a coppia), streptococchi (a catenella), stafilococchi (a grappoli), sarcine(a tetradi o cubi)

• I batteri vengono classificati con un tipo di classificazione artificiale o fenetica che considera le caratteristiche attuali sia fenotipiche che genotipiche dei batteri espresse in base al livello di somiglianza e di differenza.

• Un criterio utilizzato in tal senso è la tassonomia numerica o adansoniana per la quale l’affinità tra le diverse specie viene valutata matematicamente in base ai rispettivi coefficienti di similitudine, considerando di un congruo numero di microrganismi 100-300 caratteri, codificati ed analizzati al computer

• Un altro criterio è quello di determinare la percentuale di G + C del DNA che fornisce il livello di parentela cellulare. La % di G+C si può calcolare conoscendo la temperatura di fusione in cui si ha la separazione dei due filamenti di DNA, caratteristica per ogni specie di acido nucleico.

• Altre tecniche di indagine si basano sulla struttura antigenica, la composizione biochimica, l’omologia del DNA e le correlazioni filogenetiche

• L’identificazione batterica non può prescindere dagli aspetti epidemiologici inerenti la conoscenza della sua distribuzione, dalla frequenza della malattia in seno alla popolazione e dalle condizioni ambientali, demografiche e sociali che possono favorire od ostacolare il suo sviluppo nel territorio.

PARETE CELLULARE• Capsula polisaccaridica (glicocalice) con funzione di protezione dall’ambiente

esterno a bassa presssione osmotica

• Peptidoglicano (detto mureina) costituito da una parte peptidica (costituita da 4 aminoacidi) e da una glicidica caratterizzata da due carboidrati azotati: N-acetilglucosamina e l’acido N-acetilmuramico uniti da legame beta glicosidico

• Nei Gram positivi si trova una maggiore quantità di peptidoglicano rispetto ai Gram negativi. Nello strato di peptidoglicano vi sono inoltre lipidi, proteine, polisaccaridi

• Nei Gram negativi lo strato di peptidoglicano è ricoperto da una membrana parietale esterna formata da fosfolipidi, lipoproteine, lipopolisaccaridi, proteine

• Il lipopolisaccaride della membrana parietale, impermeabile per alcuni antibiotici e resistente all’azione detergente degli acidi biliari, degli acidi grassi e degli enzimi intestinali, favorisce l’adattamento intestinale di alcuni enterobatteri.

GENETICA BATTERICATrasformazione, coniugazione, trasduzione

Fotoautotrofi Fonte di energia: Luce Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica Fonte elettroni: H2O, H2SOssigenici, anossigenici (S2, SO4

--)Tipo clorofilla: clorofilla a, batterioclorofillaEsempi: Cianobatteri, batteri verdi e purpureiFotoeterotrofiFonte di energia: Luce Fonte di Carbonio: Composti organici Fonte elettroni: H2S, S, ecc.Pigmento fotosintetico: batteriorodopsina Esempi: Solforodobatteri,batteri verdi e purpurei non sulfurei (batteri alofili)ChemioautotrofiFonte di energia: Ossidazione di sostanze inorganiche Fonte di Carbonio: CO2 atmosferica Esempi: Batteri Nitrificanti nitratatori: Ca(NO2)2+O2 >Ca(NO3)2 (=nitriti >nitrati), idrogenobatteri (l’idrogeno gassoso viene utilizzato come fonte per la riduzione della CO2 per ottenere CH2O), Solfobatter i: 2H2S+O2 >2H2O + S2 (Thiobacillus nei fondi d’acqua stagnante) (= acido solfidrico >acqua e zolfo inorganico)Nitrificanti nitrosatori: (NH4)2CO3+3O2 >2HNO2+CO2+3H2O (= sali d’ammonio >acido nitroso ovvero nitriti di Ca o Mg), Ferrobatteri: ossidano ioni ferrosi in ioni ferrici (pellicole superficiali argentate o iridate) 2FeCO3 + 3H2O + ½ O2 >2Fe (OH)3 + 2CO2 (Fe bivalente >Fe trivalente; lo stesso tipo di reazione può avvenire col Mn), Solfato-riduttori (da ione solfato ad H2S e da acetato ed altri composti a CO2), Denitrificatori (trasformazione delle sostanze azotate nel terreno.Da anione nitrico ad ammoniaca o N2 )ChemioeterotrofiFonte di energia: Ossidazione di sostanze organiche Fonte di Carbonio: Composti organici Esempi: Quasi tutti i batteri patogeniI Procarioti Chemioeterotrofi possono essere:Saprofiti

Si nutrono di organismi in decomposizione o di sostanza organica nel suoloParassiti

Si nutrono a carico di Eucarioti (Protisti, Animali, Funghi o Piante) Simbionti

Instaurano una simbiosi con Eucarioti (per lo più Piante o Protisti)Azotofissatori (Cianobatteri – es. licheni, Attinomiceti – es. Ontano, Rhizobium – es. leguminose)

TipoTipo Fonte di energiaFonte di energia Fonte di carbonioFonte di carbonio MicrorganismiMicrorganismi

FotoautotrofiFotoautotrofi LuceLuce CO2CO2 Alghe verdi-blu, batteri fotosinteticiAlghe verdi-blu, batteri fotosintetici

FotoeterotrofiFotoeterotrofi LuceLuce Composti organiciComposti organici Batteri rossi, fotosinteticiBatteri rossi, fotosintetici

ChemioautotrofiChemioautotrofi Composti organiciComposti organici CO2CO2 Solfo-, Ferro-, Ammonio-batteri, Batteri metanoproduttoriSolfo-, Ferro-, Ammonio-batteri, Batteri metanoproduttori

ChemioeterotrofiChemioeterotrofi Composti organiciComposti organici Composti organiciComposti organiciProtozoi, funghi, la maggior parte dei batteri (tutti quelli Protozoi, funghi, la maggior parte dei batteri (tutti quelli

patogeni)patogeni)

physiological group energy source oxidized end product organism

hydrogen bacteria H2 H2O Alcaligenes, Pseudomonas

methanogens H2 H2O Methanobacterium

carboxydobacteria CO CO2 Rhodospirillum, Azotobacter

nitrifying bacteria* NH3 NO2 Nitrosomonas

nitrifying bacteria* NO2 NO3 Nitrobacter

sulfur oxidizers H2S or S SO4 Thiobacillus, Sulfolobus

iron bacteria Fe ++ Fe+++ Gallionella, Thiobacillus

Elettroni accettori Prodotto ridotto finale Tipo di processo Microrganismo

O2 H2O respirazione aerobica Escherichia, Streptomyces

NO3 NO2, NH3 or N2 denitrificazione Bacillus, Pseudomonas

SO4 S or H2S riduzione solfati Desulfovibrio

fumarato succinato respirazione anaerobica  Escherichia

CO2 CH4 metanogenesi Methanococcus

CARATTERISTICHE METABOLICHE E NUTRIZIONALI

• BATTERI GRAM – POSITIVI

1. Bacillus anthracis

2. B. thurigiensis

3. Clostridium denitrificans

4. C. botulinum

5. C. tetani

6. C. perfrigens (avvelenamento di cibi e gangrena gassosa)

7. Lactobacillus

8. Listeria

9. Staphylococcus aurei (infezioni dell’apparato respiratorio)

10. Streptococcus mutans (cavo orale, carie)

11. Streptococcus pneumoniae

12. Mycobacterium tubercolosis

13. Streptomices

14. Micoplasmi

• BATTERI GRAM – NEGATIVI

1. Beggiatoa (batteri striscianti)

2. Treponema pallidum

3. Campylobacter fetus (infiammazioni intestinali)

4. Rhizobium

5. Nitrobacter

6. Thiobacterium

7. Escherichia coli

8. Yersinia pestis

9. Shigella dysenteriae

10. Vibrio cholerae

11. Salmonella typhimurium

12. Agrobacterium tumefaciens

13. Neisseria gonorrhoeae

14. N. meningitidis

15. Rickettsie

16. Clamidie

17. Cianobatteri

COLORAZIONI BATTERICHEFasi principali delle colorazioni:• Distensione• Essiccamento• Fissazione (anche con liquidi fissatori quali la miscela alcool – etere per 10

ninuti, alcool etilico assoluto per 20 minuti, alcool metilico per 2-3 minuti)• Colorazione semplice o monocromatica• Colorazione differenziale (con due coloranti)• Si usano coloranti basici di anilina per la grande affinità nei confronti degli

acidi nucleici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina, safranina)

• Si usano coloranti acidi per l’affinità che hanno per il citoplasma (eosina, fucsina acida, nigrosina)

• Per favorire la penetrazione dei coloranti si usano dei mordenzanti quali il fenolo e la soluzione iodo-iodurata

• Le soluzioni madri si preparano sciogliendo 10 grammi di colorante in polvere in 100 g di alcool etilico al 95% o assoluto

• Le soluzioni idroalcoliche per la colorazione si preparano aggiungendo a 10 ml di soluzione madre 90 ml di acqua distillata. Per le soluzioni mordenzate si procede sciogliendo prima l’acido fenico nell’acqua distillata e aggiungendo poi 10 ml della soluzione madre. La quantità di acido fenico varia da 1 g a 5 g a seconda del tipo di colorazione.

• REGOLA DELLE MISCELE• COLORAZIONE DI GRAM Si basa sulla facoltà di alcuni coloranti, quali il violetto di genziana, il cristalvioletto, ecc.

di reagire con lo iodio di una soluzione iodo-iodurata, per dare composti resistenti alla colorazione con alcool. Mentre i batteri Gram positivi non si scolorano con alcool e appaiono colorati in viola-blu al microscopio, i Gram negativi acquisiscono una colorazione rosa-rosso del secondo colorante (fucsina, safranina, ecc.). Ciò è dovuto al fatto che i Gram negativi hanno un contenuto in lipidi più alto, lipidi che vengono rimossi con il lavaggio con alcool con conseguente aumento della permeabilità della parete.

TECNICA:1. Stemperare una goccia di brodocoltura, o una colonia cresciuta in piastra,in una goccia di

acqua sterile depositata su un vetrino portaoggetti2. Distendere per strisciamento con l’ansa3. Lasciare asciugare e fissare4. Colorare per 1 minuto il preparato con violetto di genziana fenicato di Nicolle al 2% (o di

cristalvioletto)5. Allontanare l’eccessso di colore e, senza lavare, coprire con liquido di Lugol facendo agire per

1 minuto6. Lavare con acqua e versare gocce di alcool sul vetrino finchè il preparato non cede più

colorante7. Colorare per 10 secondi con soluzione di safranina allo 0,25%, o con fucsina diluita 1:10 per

30 secondi8. Lavare e asciugare

• Colorazione di Ziehl-NeelsenViene effettuata per la ricerca del bacillo tubercolare e di altri micobatteri. I microrganismi acido resistenti si colorano con difficoltà per la presenza di un involucro ricco di cere e di grassi che riveste la cellula batterica. A differenza degli altri batteri gli acido-resistenti una volta colorati “resistono” alla decolorazione di una soluzione alcool-acido.

TECNICA

1. Far agire sullo striscio fissato alla fiamma la fucsina basica fenicata a caldo (sciogliere 3 g di fucsina basica in 10 ml di etanolo al 95% ed aggiungere 90 ml di una soluzione acquosa di fenolo al 5%), in modo da far svolgere i vapori senza far bollire

2. Lavare con acqua e decolorare per 2 minuti con soluzione di acido solforico al 20% o ac. Cloridrico al 3% o ac. Nitrico al 33% fino a che il preparato non diventa giallo

3. Lavare e far agire ripetutamente con etanolo al 95% per 5 minuti finchè il preparato non cede più colore

4. Lavare con acqua e colorare per 1 minuto con soluzione idroalcolica di blu di metilene: 0,5 g di blu di metilene, + 100 ml di acqua distillata

5. Lavare con acqua e asciugare

• COLORAZIONE DELLA CAPSULA

La capsula è una formazione non essenziale, composta in genere di polimeri di carboidrati, la quale conferisce ai batteri proprietà peculiari quali la virulenza, l’attività antifagocitaria, la protezione fisico-chimica dall’ambiente esterno, la resistenza all’essiccamento, ecc.

La capsula dei batteri non ha per i coloranti la stessa affinità degli altri componenti cellulari e quindi rende necessario l’uso di particolari procedimenti di colorazione.

L’inchiostro di china e la nigrosina mettono in evidenza la capsula per mezzo di una colorazione ‘negativa’.

Colorazione con eosina:

1. fissare lo striscio alla fiamma

2. Colorare per 2-3 minuti con violetto di genziana fenicato

3. Decolorare per qualche secondo con una soluzione alcool-acetone

4. Lavare e colorare per pochi secondi con una soluzione alcolica di eosina allo 0,5%

I batteri appaiono colorati in violetto, le capsule in rosa-rosso

Colorazione con nigrosina:

1. Stemperare su un vetrino portaoggetti una goccia di campione in una goccia di nigrosina

2. Stendere uniformemente con un altro vetrino, fino a formare una sottile pellicola

3. Asciugare all’aria e osservare con l’obiettivo ad immersione

Le cellule appaiono incolori su sfondo scuro

COLORAZIONE DELLE SPOREGli involucri di rivestimento rendono le spore pressochè impermeabili ai comuni coloranti;

una volta colorate si decolorano con difficoltà. Sono sporigeni i batteri del genere Bacillus e Clostridium

Colorazione di Schaeffer-Fulton1. Ricoprire lo striscio con soluzione verde malachite e mantenerlo sopra la fiamma

per 30 secondi fino allo sviluppo dei primi vapori2. Lavare con acqua3. Colorare con safranina per 30 secondi4. Lavare, asciugare ed esaminare

Colorazione di Moller1. Immergere lo striscio in una soluzione acquosa di acido cromico al 5% per 2

minuti2. Lavare in acqua corrente3. Colorare per un minuto con fucsina fenicata4. Passare velocemente in acido solforico al 5% fino a scomparsa del colore rosso5. Lavare con acqua corrente6. Colorare con soluzione acquosa di blu di metilene7. Lavare con acqua e asciugare8. Montaggio in balsamoLe spore appaiono colorate in rosso su sfondo azzuro

TERRENI DI COLTURALa semina in un terreno di coltura persegue due obiettivi1. Determinare la carica microbica in una unità di campione (1 g o un ml)2. Identificare la presenza/assenza di microrganismi patogeni3. Coltivare microrganismi per produzione industriale4. Verificare l’efficienza di prodotti farmaceutici5. Verificare la sensibilità ad agenti antimicrobici mediante l’antibiogramma6. Controllare la sterilità di materiali e attrezzatureAll’isolamento dei microrganismi in terreni selettivi e differenziali, segue l’identificazione mediante:1. Colorazioni, per individuare l’aspetto morfologico2. Microscopio ottico3. Prove di identificazione biochimica4. Tipizzazione sierologica• I terreni possono essere liquidi, semisolidi (0,3-0,5% di agar), solidi con

aggiunta di agar (1-2%) o con la coagulazione al calore (se a base di siero e di uova)

• L’agar è un composto mucopolisaccaridico (galattosio + ac. galatturonico) estratto da alghe marine. Solidifica a 38 °C e fonde a 84 °C

Un terreno può contenere:• Sostanze nutrienti (proteine, peptidi, aminoacidi, infuso di carne, triptoni, caseina) ed energetiche (zuccheri)• Metalli e minerali essenziali (sodio, potassio, calcio, ferro, magnesio, cloro, fosforo,zolfo)• Sostanze tamponanti a valori specifici di pH (fosfati mono e di-sodico e di K, acetati…)• Indicatori per evidenziare la fermentazione dei carboidrati o dei composti azotati, i quali cambiano colore ad

un determinato pH (rosso fenolo, porpora di bromo-cresolo, fucsina, rosso neutro)• Indicatori di ossido-riduzione quali il blu di metilene e la resazurina, che virano in presenza di ossigeno• Fattori di crescita quali sangue, siero, estratti di lievito• Agenti selettivi antimicrobici (antibiotici quali neomicina, cloramfenicolo, vancomicina) e prodotti chimici quali

Sali biliari, i coloranti di anilina (eosina, verde brillante…), il selenio, il tetrationato, il tellurito, l’azide sodica , per inibire la crescita dei microrganismi indesiderati a vantaggio di quelli che si vogliono isolare

• Gelificanti quali l’agar

• La bile, gli acidi e i Sali biliari, non inibiscono gli enterobatteri patogeni (Salmonelle e

Shigelle) e, in genere, i Gram negativi, mentre hanno attività batteriostatica o battericida

su alcuni enterobatteri saprofiti e sui Gram positivi

• Il cloruro di sodio a concentrazioni 10 volte superiori non inibisce lo sviluppo degli stafilococchi e di

altri batteri alofili

• Certi coloranti ottenuti dal trifenilmetano quali il cristalvioletto, la fucsina basica, il verde brillante, il

verde malachite, inibiscono i Gram positivi (in particolare gli streptococchi fecali) a concentrazioni

minori rispetto a quelle necessarie per i Gram negativi

• L’azide sodica allo 0,2 g/l permette lo sviluppo degli enterococchi (streptococchi fecali) mentre inibisce

quello dei microrganismi Gram negativi associati

PREPARAZIONE DI UN TERRENO• Molte ditte hanno in catalogo terreni in polvere disidratati, da ricostituire secondo le

istruzioni, o terreni pronti all’uso in capsule Petri, in provetta, in flaconi.• Pratici e facili da usare sono i cartoni nutrienti impregnati con mezzi di coltura liquidi • essiccati e sterilizzati. Sono pronti all’uso previa reidratazione con pochi ml di acqua

distillata• Pesati i prodotti, seguendo le indicazioni riportate sulla confezione, le polveri vanno

sciolte in beuta o altro recipiente di volume adeguato mediante ebollizione, avendo cura di agitare continuamente per evitare che il terreno posto sul fondo si bruci.

• Raffreddare a circa 50 °C, mescolare e distribuire nei contenitori finali: tubi, provette inclinate a becco di clarino (slant), capsule petri, beute.

• Verificare sulla confezione se il terreno va autoclavato e a quale temperatura. Quando il contenitore è provvisto di tappi a vite questi vanno allentati per favorire la fuoriuscita dell’aria durante il riscaldamento in autoclave. Finita la sterilizzazione, prima di estrare i contenitori, attendere che la temperatura sia scesa sotto gli 80 °C. Controllare il pH finale ed aggiungere, se necessario, HCl o NaOH

• Per accertare l’avvenuta sterilizzazione vi sono indicatori biologici sotto forma di strisce contenenti spore di Bacillus stearothermophilus e B. subtilis. Le strisce in substrato liquido, dopo la sterilizzazione, vanno incubate per 48 ore a 55 °C. Se la sterilizzazione è avvenuta non si verificano cambiamenti di torbidità

Conservazione dei terreni• I terreni andrebbero utilizzati freschi, entro 2-3 ore.I terreni liquidi o agarizzati

contenuti in bottiglie con tappo a vite, si conservano fino a 6 mesi al riparo della luce a 12-16 °C

• Al bisogno, i terreni solidi vengono ridisciolti in bagnomaria bollente o in un forno a microonde per pochi minuti

IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI• RACCOLTA DEL CAMPIONE

Il campione non deve subire modifiche durante il trasporto e la conservazione,

e dovrebbe ospitare al momento dell’analisiuna flora microbica

qualitativamente e quantitativamente uguale a quella presente durante il

prelievo

Per il trasporto si utilizzano bauletti termostatati, con piastre termiche

congelanti in grado di mantenere una temperatura di 2-4 °C

In genere si prelevano non meno di 5 unità campionarie• PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

L’unità di volume (ml) o di peso (g) del campione viene seminata per inclusione in un

terreno idoneo. Le cellule si dividono ogni 20 minuti. Dopo 18-24 ore si formano colonie

visibili ad occhio nudo costituite da un minimo di 106 cellule

Il conteggio viene esspresso in U.F.C. (unità formanti colonie) per ml o grammo.

L’aspetto delle colonie può essere liscio S (smooth) di consistenza cremosa, rugosa a

margini frastagliati o mucoso, tipico dei batteri capsulati • OMOGENEIZZAZIONE

Se il campione si trova allo stato solido (es. buro, formaggio, ecc.) si portano 30 grammi

dello stesso in una quantità nove volte di diluente in modo da ottenere una diluizione di

1:10. Campione e diluente vengono omogeneizzati in un miscelatore-omogeneizzatore

• DILUIZIONE

Requisito indispensabile del diluente è l’isotonicità con le cellule microbiche. Dall’omogenato diluito si pipetta 1 ml(pari a 0,1 ml o gr di campione) che viene inoculato in 10 ml di terreno liquido (brodo) posto in provetta oppure in piastra Petri. Per ogni diluizione si seminano due piastre.Se il numero di UFC supera le 300 unità è necessario effettuare ulteriori diluizioni sempre 1:10.

Il conteggio delle UFC deve essere riferito a ml o a gr.Tenendo conto che 1 ml della prima diluizione corrisponde a 0,1 gr o ml se la diluizione utilizzata fosse ad es. 1000 ed il numero di UFC pari a 200 allora il numero di UFC / ml (o gr) sarà 200 X 1000 = 200.000

Es. diluente:

Cloruro di sodio 2,5 g/l

Cloruro di potassio 0,105 g/l

Cloruro di calcio 6H2O 0,12 g/l

Bicarbonato di sodio 0,05 g/l

Acqua 1000 ml

• SEMINA

La coltivazione dei microrganismi in substrati artificiali ha lo scopo di quantificare il numero di germi nell’unità di peso (gr) o di volume (ml), oppure di verificare l’assenza in quantità definite di campione dei microrganismi patogeni. Nel primo caso deve essere seminato un volume notodel materiale in esame. L’entità del campione dipende dal microrganismo cercato e dall’alimento

Semina in provetta

1. Per infissione centrale con l’ago

2. In superficie e in profondità mantenendo inclinata la provetta di circa 30°

Semina in piastra per inclusione

1. Deporre 1 ml di campione opportunamente diluito

2. Versare ca. 15 ml di terreno liquido a ca. 46 °C

3. Lasciare raffreddare le piastre con il coperchio semiaperto per 10 minuti, vicino alla fiamma di un bunsen per ridurre la formazione di condensa

4. Incubare le piastre capovolte in termostato a temperatura, in genere, di 37 °C per 24 ore

Semina in piastra per strisciamento

Lo scopo è quello di distribuire l’inoculo in modo da assicurare lo sviluppo di

colonie isolate. La tecnica consiste nell’inoculare un’ansata di campione sulla

superficie di un terreno solidificato, vicino ai bordi della piastra Petri, e

distribuirlo con l’anse su tutta la superficie.

• INCUBAZIONESi utilizzano termostati ad aria o bagnimaria termostatati. Le piastre vanno

capovolte per evitare il rapido essiccamento e la formazione sul coperchi di gocce di condensa che potrebbero compromettere la crescita microbica

Per l’incubazione in anaerobiosi si possono usare terreni contenenti sostanze riducenti

ATTIVITA’ METABOLICHE DEI BATTERI

Lo studio delle caratteristiche biochimiche sono alla base del riconoscimento di molti microrganismi. Esse rappresentano una sorta di impronta digitale, la prova del nove per la determinazione della specie1. Produzione di catalasi: è possibile differenziare gli stafilococchi (catalasi positivi)

dagli streptococchi (catalasi negativi).La catalasi si può dimostrare stemperando un’ansata della colonia batterica in una goccia di acqua ossigenata al 3%

2. Produzione di coagulasi: è un enzima liberato da alcuni batteri (stafilococchi patogeni, ecc.) in grado di coagulare il plasmadi coniglio

3. Le Enterobacteriaceae si caratterizzano per le seguenti attività metaboliche: 1-utilizzazione del glucosio per via fermentativa,2 - assenza di attività citocromo ossidasica, 3- riduzione dei nitriti a nitrati, 4-idrolisi della gelatina, 5-produzione di acido solfidrico, 6-produzione di indolo, 7-produzione di ureasi, 8-prova dell’ONPG, 9-prova della decarbossilasi, 10-prova dell’utilizzazione del citrato

REQUISITI DI QUALITA’ DELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO

• La legge 236/88 tra i requisiti di qualità da prendere in considerazione per le analisi delle acque destinate al consumo umano impone parametri organolettici (colore, torbidità, odore, sapore), fisico-chimici e microbiologici

• Oltre a tali parametri, a giudizio dell’autorità sanitaria competente potrà essere effettuata la ricerca concernente i seguenti parametri accessori:

1. Alghe2. Batteriofagi anti Escherichia coli3. Elminti4. Enterobatteri patogeni5. Enterovirus6. Funghi7. Protozoi8. Pseudomonas aeruginosa9. Stafilococchi patogeni• Il DPR 236/88 prevede tra i parametri microbiologici tre controlli di routine (C1, C2, C3) ed un controllo occasionale C4

TECNICHE PER QUANTIFICARE I PARAMETRI MICROBIOLOGICI

Colimetria: principali tecniche per quantificare i coliformi1. Conta diretta su piastre Petri2. Metodo statistico o MPN (Most Probable Number)3. Filtrazione su membrana (MF)• La conta diretta fa riferimento a volumi piastrabili non superiori a 1ml, quantità

insufficiente per accertare l’assenza di coliformi quali indicatori di inquinamento fecale

• Tecnica MPN:si basa sull’elaborazione statistica dei risultati positivi o negativi di diverse serie (3 o 5) di tubi contenenti un brodo in cui i coliformi (in diluizioni successive 1:10) fermantano il lattosio con produzione di acidi e di gas. La densità batterica (MPN/100 ml) è funzione esponenziale del numero di provette positive

• Tcnica MF:Si basa sulla filtrazione sottovuoto di 100 ml o più di acqua su membrane di acetato di cellulosa con porosità 0,45 micron. La filtrazione avviene con pompa ad acqua unita ad un comune rubinetto. La membrana viene quindi trasferita su un terreno selettivo in capsula Petri

Di fatto non sono disponibili metodi di sicura affidabilità che permettano ladeterminazione del numero totale di microrganismi vitali contenuti in acqua. Lemetodiche di uso comune presentano sempre sostanziali differenze tra i conteggi nei terreni di coltura in piastra e i conteggi totali diretti al microscopio. Inoltre il numero di batteri capaci di formare colonie su terreno agarizzato è palesemente inferiore rispetto alla concentrazione reale nelle acque e nel suolo

RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI E DEI COLIFORMI FECALI

I coliformi sono batteri Gram negativi, a morfologia bastoncellare, aerobi-anaerobi facoltativi, non sporigeni, in grado di fermentare il lattosio con produzione di acido e di gas entro 48 ore dall’incubazione a 32-37 °C (coli totali), a 44,5 °C (coli fecali). Comprendono i generi Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter.

Coliformi totaliSono batteri diffusi nel suolo, nelle materie prime di origine animale e vegetale, nelle acque e negli ambienti in generale. Con la loro presenza nelle acque i coliformi si comportano come indicatori di inquinamento fecale, segnalando il rischio potenziale dellacontemporanea presenza di enterobatteri patogeni a localizzazione intestinale (salmonelle e Shigelle)• La ricerca può effettuarsi con il metodo MF o col metodo MPN • Metodo MF:Composizione terreno per il conteggio dei coliformi in g/l:Estratto di lievito 1,2Triptone 3,7Peptone P 3,7Triptosio 7,5Lattosio 9,4Potassio fosfato monoacido 3,3Potassio fosfato biacido 1,0Sodio cloruro 3,7Sodio laurilsolfato 0,05Sodio solfito 1,6Agar 10pH finale 7,2Tutti i microrganismi che producono colonie rosso scuro con riflessi metallici verdi dorati sono da considerarsi possibili coliformi

• Metodo MPN:• Prova presuntivaComposizione in g/l del brodo lattosato:Estratto di carne 3Peptone 5Lattosio 5Acqua distillata 1000pH finale dopo sterilizzazione 6,9Mescolare e distribuire 50 ml di brodo doppio concentrato in matracci e 10 ml in provette munite campanella di Durham. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il terreno a temperatura ambiente. Per la semina aggiungere in ciascuno dei due matracci 50 ml di campione(acqua). Aggiungere in due serie di 5 provette contenenti 10 ml di LB 10 ml di campione. Incubare a 36°C per 48 oreSono positivi i contenitori in cui si è avuta entro 48 ore la fermentazione del lattosio con produzione di gas La prova con LB è da considerarsi presuntiva.• Prova di conferma I tubi positivi (presenza di gas) devono essere sottoposti a conferma in brodo-lattosio-bile-verde brillante a 36°C per 48 ore. La bile e il verde brillante inibiscono la crescita dei batteri Gram-positivi, mentre i coliformi si manifestano fermentando il lattosio con liberazione di gas. Sulla base della positività su tale terreno riportare il valore come MPN/100 ml di campione. Composizione del BGBB in g/l:Peptone 10Lattosio 10Bile di bue 20Verde brillante 0,0133Acqua distillata 1000pH finale 7,4

Tabella per il calcolo del numero più probabile MPN

Quantità di acqua seminata per ogni beuta e per tubo

Numero più probabile/100 ml di campione

Quantità di acqua seminata per ogni beuta e per tubo

Numero più probabile/100 ml di campione

Numero di tubi positivi

ml 50 ml 10  

012457

Numero di tubi positivi

ml 50 ml 10 2359

16oltre 16

000000

012345

111111

012345

Coliformi fecaliComprendono i batteri termoresistenti (44°C) il cui habitat naturale è l’intestino umano oAnimale. La specie più rappresentativa è Escherichia coli. Poiché E.coli è un ospite normale predominante della popolazione batterica aerobia-anaerobia facoltativa residente nell’intestino crasso, la sua presenza in un dato materiale (acqua, alimenti, ecc.) viene considerata un indizio sicuro di contaminazione fecale. • Metodo MFTerreno per il conteggio dei coliformi fecali mediante MF:Triptosio 10Peptone proteasi 5Estratto di lievito 3Sodio cloruro 5Lattosio 12,5Sali biliari 1,5Blu di anilina 0,1Agar 15Acqua distillata 1000pH finale 7,4Aggiungere 10 ml di una soluzione di acido rosolico (1% di NaOH 0,2N)Non autoclavareL’acido rosolico ((C 6 H 4 OH)2 CC 6 H 4 O) sopprime la flora microbica non coliforme

• Metodo MPNComposizione in g/l del terreno liquido di conferma indicato per la ricerca dei coliformi fecali (EC Medium)Triptone 20Lattosio 5Sali biliari n° 3 1,5Potassio fosfato monoacido 4Potassio fosfato biacido 1,5Cloruro di sodio 5pH finale 6,9

ProceduraProva presuntivaPrima di procedere all’inoculo di aliquote scalari del campione nei tubi del brodo per la prova presuntiva, agitare vigorosamente il campione per assicurare una distribuzione omogenea dei microrganismi sospesi nell’acqua. Dopo l’inoculo agitare leggermente i tubi e procedere all’incubazione in termostato entro 30 minuti. Incubare a 36±1°C. Dopo 24±2 ore agitare ciascun tubo per verificare la formazione di gas nella campanella ed eventualmente reincubare per altre 24 ore. Alla fine del periodo di incubazione registrare i risultati in base alla disposizione dei tubi che presentano produzione di gas ed intorbidimentodel brodo. La produzione di gas entro le 48±3 ore costituisce una reazione positiva presuntiva, sottoporre alla prova di conferma i tubi risultati positivi.Prova di confermaPrelevare, sterilmente, 1 mL di brodocoltura dai tubi positivi del brodo per la prova presuntiva (formazione di gas entro le 48 ore) ed inoculare nei corrispondenti tubi contenenti il brodo per la prova di conferma. Incubare i tubi a 44±1°C per 24±2ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una reazione positiva per i coliformi fecali. Annotare i risultati ottenuti indicando il numero di tubi positivi e negativi e, sulla base delle combinazioni ottenute, consultando la Tab. 1, calcolare, considerando l’eventuale diluizione, il valore dell’indice MPN.La formazione di gas nella campanella di Durham indica la presenza di E. coli senza escludere la presenza di coliformi. La presenza di gas solo a 37 °C segnala la presenza di coliformi ed esclude quella di E. coli. Escherichia coli si distingue dagli altri coliformi lattoso-fermentanti per la capacità di produrre indolo in acqua triptonata in 24 ore a 44 °C. Un terreno idoneo per la conferma di E. coli da tubi presuntivi è il Brodo Triptone Mannitolo Ricinoleato (BTMR)

IL LATTESe non altrimenti specificato, il latte destinato al consumo umano è quello ottenuto dalla mungitura

regolare, ininterotta e completa della mammella di mucche in buono stato di salute e di nutrizione

La direttiva CEE n° 46/92 stabilisce la seguente nomenclatura:

MICROFLORA DEL LATTE• Prelevato in condizioni igieniche ottimali in una vaccina sana, il latte contiene in

media alla mungitura circa 5000 microrganismi e meno di 1 coliforme/ml. Si tratta in genere di micrococchi, streptococchi lattici e lattobacilli saprofiti presenti nei canali galattofori della mammella.

• Le sorgenti di origine endogena sono influenzate dalle condizioni sanitarie della lattifera che può essere affetta da mastiti, e altre malattie infettive quali la brucellosi, l’afta epizootica, il carbonchio ematico, il vaiolo, la tubercolosi, la febbre Q (causata da Coxiella burnetii), ecc.

• La contaminazione esogena dipende dall’igiene della mungitura, dalle condizioni igieniche della stalla e dell’animale, dal trasporto e dalla conservazione del latte.

• Il latte crudo, prima dei trattamenti termici, può subire la contaminazione di una variegata microflora batterica. Molti germi psicrotrofi sono in grado di moltiplicarsi anche a temperature di refrigerazione sotto i 7°C. I principali sono: Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas, ed alcuni sporigeni dei generi Bacillus e Clostridium. Il latte può essere inquinato anche da lieviti (Saccharomyces cerevisiae, Candida Kefyr, Debaryomyces hansenii, ecc.).

• La bovina malata può trasmettere all’uomo con il latte patogeni quali: Mycobacterium bovis, M. tubercolosis, Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, Salmonella, Leptospira, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Pasteurella multocida, Clostridium perfrigens, Coxiella burnettii, Campylobacter, Yersinia enterocolica, ecc.

BATTERI LATTICI• I batteri lattici sono bacilli Gram positivi, immobili, asporigeni, anaerobi microaerofili

(crescono anche in presenza di esigue quantità di ossigeno). Metabolizzano gli zuccheri con produzione di acido lattico.

• La percentuale di acido lattico prodotto è variabile con la specie di bacillo. La produzione di acido lattico può determinare la coagulazione del latte per la precipitazione della caseina.

• La dimunuzione di pH favorisce lo sviluppo di batteri acidofili e dei miceti che preparano l’ambiente per altri microrganismi in grado di decomporre ciò che resta delle sostanze organiche, accelerando i processi putrefattivi.

• Le capacità fermentative variano da specie a specie e sono più elevate nei batteri lattici termofili. I generi principali di batteri lattici sono: Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus

TRATTAMENTI TERMICI PER IL LATTE ALIMENTARE• PASTORIZZAZIONE

1. In flusso continuo: si realizza a temperature comprese fra 61 e 65°C per almeno 30 minuti in modo da assicurare la completa distruzione di tutti i microrganismi patogeni (in particolare il bacillo di Koch)

2. Rapida: (H.T.S.T) si esegue a 72-85 °C per 15-30 secondi e rapido raffreddamento a 2-4 °C Diversi sono i batteri che possono sopravvivere a queste temperature: (Streptococcus termophilus, micrococchi, Clostridium, ecc.)

Si distinguono i seguenti tipi di latte pastorizzato:

1. Latte pastorizzato ottenuto da latte già pastorizzato: deve presentare al consumo a) la prova della fosfatasi alcalina negativa; b) un contenuto in sieroproteine solubili non denaturate non inferiore all’11% delle proteine totali

2. Latte fresco pastorizzato ottenuto da latte crudo trattato entro 48 ore dalla mungitura: a) fosfatasi alcalina negativa; b) sieroproteine > 14%; c) positivo alla prova della perossidasi. In relazione al contenuto dei grassi il latte pastorizzato può essere: - intero, con valori non inferiori al 3,5%; - parzialmente scremato, con valori inferiori all’1,8%; - scremato, con valori inferiori all’1%

3. Latte fresco pastorizzato di alta qualità ottenuto da latte crudo di elevate caratteristiche qualitative: è un latte con particolari caratteristiche igieniche e di composizione stabilite con riferimento al contenuto di proteine, di grasso, di carica batterica totale. Tale latte proviene da bestiame selezionato, allevato in fattorie modello, con tutte le caratteristiche di igiene e di genuinità imposte dalla legge 169/1989 e dal decreto 185 del 975/1991

• STERILIZZAZIONE

La sterilizzazione deve assicurare la distruzione di tutti i microrganismi o impedirne definitivamente la proliferazione. Di

fatto un pur minimo rischio microbiologico rimane

Le modificazioni sul valore biologico del latte sterilizzato riguardano in particolare la riduzione della componente

proteica e vitaminica (vitamine C, B1, B12, E)

L’interazione del lattosio con le proteine può creare imbrunimento ed accentuare il sapore di cotto o di caramello.

Il latte sterilizzato viene definito:

a) Latte sterilizzato a lunga conservazione: quando ha subito un trattamento termico finale di sterilizzazione in contenitore sigillato a temperatura di 118 – 120 °C per 15-20 minuti. La data di scadenza non deve superare i 180 giorni dal confezionamento.

b) Latte UHT (Ultra High Temperature): quando il trattamento termico viene applicato in un’unica volta a 140-150°C per 2 secondi ed è seguito dal confezionamento asettico in un recipiente opaco. La scadenza non deve superare i 90 giorni dal confezionamento. Può avvenire per scambio di calore o per uperizzazione.

• LATTE A RIDOTTO CONTENUTO DI UMIDITA’

a) Latte evaporato: sterilizzato a 114-118°C per 15 minuticon un contenuto in acqua dal 66 al 68,5%. Grasso dal 10% allo 0,5%

b) Latte condensato: con aggiunta di zucchero sotto forma di sciroppo, con il 26% di acqua e il 9% di grasso

c) Latte in polvere: essiccato a 130-150°C contiene il 4-5% di acqua e grasso dal 26% all’1,5%

RICERCA DEI PARAMETRI MICROBIOLOGICIIl percorso che in genere si segue è caratterizzato da 4 fasi:

1. Campionamento

2. Preparazione del campione

3. Semina in terreni colturali

4. Identificazione biochimica

Le prove principali riguardano:• Reduttasi• Carica microbica totale• Enterobatteri totali• Coliformi• Salmonelle• Staphylococcus aureus• Listeria monocytogenes• Mastite

• PROVA DELLA REDUTTASI

Introdurre in una provetta 10 ml di latte crudo e 1 ml di blu di metilene. Tappare, agitare ed incubare a 40°C

• CARICA MICROBICA TOTALE

Il D.M. del 26/3/92 impone la numerazione dei germi in piastra a 30°C, a 21°C e la numerazione dei coliformi a 30°C. Il metodo si applica al latte crudo, al latte pastorizzato, nonché a quello uperizzato e sterilizzato dopo preincubazione a 30°C per 15 gg. La tecnica consiste nel seminare il campione in un terreno di coltura, incubare in termostato a 30 °C per 72 ore per la carica mesofila e a 21°C per 25 ore per quella psicrotrofa e contare le colonie. Si calcola il numero dei germi per 1 ml nel caso del latte crudo o pastorizzato e per 0,1 ml nel caso del latte uperizzato o sterilizzato.Diluizioni: a) latte crudo: diluire da 1:1000 a 1:100000; b) latte pastorizzato: diluire da 1:10 a 1:1000. Conteggio: Contare con il contacolonie le coppie di piastre nelle quali sono visibili colonie in numero né troppo basso (ca.30), né troppo alto(non superiore a 300). Calcolare la media dei due conteggi e moltiplicare per il reciproco della diluizione. Il risultato corrisponde al numero delle U.F.C per unità di peso o di volume. Terreno di coltura: ()

Agar Conta Latte agarizzato

Estratto di carne 3 g/l Estratto di lievito 2,5 g/l

Triptone 5 g/l Triptone 5,0 g/

Destrosio 1 g/l Destrosio 1 g/l

Agar 15 g/l Latte scremato in polv. 1 g/l

Diluente: Agar 15 g/l

Peptone 1 g Acqua 1000 ml

Cloruro di sodio 8,5 g

Acqua 1000 g

SAGGIO ALLA RESAZURINAPermette di valutare lo stato microbico del latte. Più sono i germi e più veloce è l’effetto riducente della resazurina e quindi la decolorazione del latte da azzurrato al colore originario.In una provetta a 10 ml di campione si aggiunge 1 ml di resazurina. Si chiude con tappo sterile, si agita e si pone a bagnomaria a 37-40°C per 10 minuti. Tanto più la carica microbica del latte è alta tanto più rapidamente si avrà la decolorazione.• ENTEROBACTERIACEAE La famiglia delle Enterobacteriacae raggruppa batteri bacillari e coccobacillari a prevalente habitat

intestinale, Gram negativi, aerobi-anaerobi facoltativi con metabolismo sia respiratorio sia fermentativo degli zuccheri con produzione di acidi e di gas. . Sono catalasi positivi e privi dell’enzima ossidasi. Gli enterobatteri sono accomunati da caratteri biochimici e sierologici che rappresentano uno dei criteri di classificazione. A livello colturale , gli enterobatteri mostrano rispetto ai Gram positivi, una minore sensibilità nei confronti di acidi, Sali biliari e coloranti (cristalvioletto…). Crescono bene in terreno contenente rosso neutro dove producono colonie rosse.

I generi più comuni sono:Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, YersiniaEnterobacteriaceae totali: metodo di inclusione in piastraIncubare a 37°C per 24 ore su Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA)Peptone 7 g/lEstratto di lievito 3 g/lGlucosio 10 g/lNaCl 5 g/lSali biliari 1,5 g/lRosso neutro 0,03 g/lCristalvioletto 0,002 g/lAga 10-15 g/lAcqua 1000 mlProva dell’ossidasiSi porta un’ansata stemperata di patina batterica su un dischetto o all’estremità di uno stick impregnata con una soluzione di N,N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato (Oxoid, ecc.), acido ascorbico e alfa naftolo. Lo sviluppo dopo 30 secondi di un colore blu-porpora è indicativo di reazione positiva. Le enterobacteriaceae sono ossidasi negative.

Metodo dell’impedenzaAnche basse densità di batteri alterano l’impedenza propria del latteNumerazione dei coliformiI coliformi sono batteri ad habitat intestinale, generalmente non patogeni, che a 30 °C fermentano il lattosio con produzione di gas. La loro presenza negli alimenti è indice diinquinamento fecale. I più comuni sono Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter, Serratiaed Hafnia.Principio:Mescolare un volume definito di campione di latte con il terreno di coltura in piastre Petri del diametro di circa 100 mm. Incubare a 30 °C per 24 ore.Contare le colonie caratteristiche confermando, se necessario, l’identità di quelle dubbie con la fermentazione del lattosio.Calcolare il numero di coliformi per 1 ml di latte pastorizzato considerando i fattori di diluizione. Diluizioni suggerite: 1:10, 1:100, 1:1000Terreni di coltura.1. Violet Red Bile Lactose Agar (VRBLA) (come il VRBGA con il lattosio al posto del glucosio)2. Brodo Bile Verde Brillante (BGB) (terreno colturale di conferma)

Peptone 10 g/lLattosio 10 g/lBile di bue 20 g/lVerde brillante 0,0133 g/lAcqua 1000 ml

Determinazione dei coliformi totali col metodo MPN

Il metodo MPN è applicabile quando si desideri campionare quantità elevate ed

escludere, ad esempio, la presenza di coliformi in 1 g di prodotto. Per il calcolo dell’indice MPN si

utilizzano le tavole probabilistiche.

Si sfrutta la capacità dei coliformi di metabolizzare il lattosio per via fermentativa con produzione di

gas che si accumula nella campanella di Durham posta in brodo bile verde brillante

Procedimento:

Preparare tre diluizioni del campione di latte omogenato 0,1; 0,01; 0,001. Si dispongono tre serie di tre

tubi contenenti 10 ml di BGB 2%. - Nei tre tubi della prima fila, contenenti brodo doppiamente concentrato, si inoculano 10 ml di

omogenato, equivalenti a 1 g di campione- Nei tre tubi della seconda fila si inocula 1 ml di omogenato, equivalente a 0,1 g di campione per

tubo- Nei tre tubi della terza fila si inocula 1 ml di omogenato diluito 1:10, equivalente all’inoculo di 0,01 g

di campione per tubo

Incubare a 32°C per 24 ore. La presenza di coliformi resistenti ai Sali biliari e al verde brillante è

testimoniata dalla produzione di gas che si accumula nella campanella di Durham.

Prova di conferma

Da ciascuna provetta positiva si semina un’ansata in VRBA. I microrganismi fermentanti il lattosio

formano colonie rotonde del diametro < 0,5-2 mm di colore rosso porpora.

Interpretazione dei risultati:- Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in due tubi su tre della prima fila - Risultato positivo se si ha sviluppo di gas in un tubo su tre della seconda fila- Nessun risultato positivo se non si ha sviluppo di gas nei tre tubi della terza fila.

A ciascun risultato si attribuisce un valore pari al numero delle provette positive. Tramite le apposite tabelle di conversione MPN specifiche per varie serie di inoculi di diluizioni, il risultato codificato viene espresso in numero più probabile.

Confrma di Escherichia coli La presenza di Escherichia coli insieme a Enterobacter aerogenes in un campione è indice di contaminazione

fecale e fa sospettare, per comunanza di nicchia ecologica, la presenza di microrganismi patogeni intestinali quali salmonelle, virus gastroenterici, ecc.

E. coli, abituale commensale intestinale, può causare in situazioni particolari serie affezioni diarroiche a carico di ceppi enteropatogeni, enterotossigenici, enteroinvasivi e enteroemorragici

L’attività tossica si manifesta quando la carica batterica è compresa tra 100 milioni e 10 miliardi di cellule. E. coli è anche l’agente più comune di infezioni urinarie. Gli stipidi enterotossigenici producono due tipi di tossine, una termolabile e una termoresistente, responsabili dei

sintomi diarroici.PROCEDIMENTO• Inoculare un’ansata di brodocoltura BGB 2% positiva ai coliformi, in una provetta contenente brodo BGB2% e

in una provetta di acqua peptonata (Peptone 10 g/l, Sodio cloruro 5 g/l). • Incubare a 44°C per 48 ore. • In caso di risultato positivo si ha lo sviluppo di gas nella campanella del tubo con BGB2%• Aggiungere, nella provetta contenente acqua peptonata, 1 ml di reattivo di Kovacs

(Paradimetilaminobenzaldeide 5 g, Alcool isoamilico 75 ml, Acido cloridrico conc. 25 ml). La prova è positiva quando in presenza di indolo, formato da E. coli per la deaminazione del triptofano, in pochi minuti il reattivo si colora di riosa-rosso.

• Partendo dagli inoculi positivi a E. coli si può calcolare il MPN come visto per i coliformi totali.• Con il materiale della provetta con BGB 2% si può procedere ad altre reazioni ed accertamenti • Si inocula in VRBA un’ansata da BGB2% positiva dopo 48 ore di incubazione a 44°C• Da ogni piastra si trapiantano 4-5 colonie in Agar Conta.Dopo incubazione le nuove colonie si seminano:1. Sulla superficie a becco di clarino del terreno di Simmons (Ammonio fosfato biacido 1 g/l; Fosfato bipotassico 1

g/l; Cloruro di sodio 5 g/l; Citrato di sodio 2 g/l; Magnesio solfato 0,2 g/l; Blu di bromotimolo 0,08 g/l; Agar 15 g/l; Acqua 1000 g/l). Dopo 48 ore di incubazione, in caso di positività si ha crescita e viraggio dal verde al blu scuro.(E. coli non si sviluppa su questo substrato a differenza di Aerobacter aerogenes).

2. In una provetta contenente Brodo Rosso Metile e Voges Proskauer.Si incuba a 37°C per 48 ore. Quindi si trapianta 1 ml di brodocoltura in una provetta e si aggiungono i reattivi di Barritt: 0,6 ml di una soluzione al 5% di alfa-naftolo in alcool etilico assoluto e 0,2 ml di soluzione acquosa al 40% di KOH; agitare in presenza di ossigeno e attendere 15 minuti. Dopo un minuto in caso di positività si ha colore rosso per la presenza di acetoina prodotta dal gruppo Enterobacter-Serratia-Hafnia-Klebsiella ma non da E. coli.

CONTROLLO DI QUALITA’ DEGLI ALIMENTIGli alimenti o le materie prime utilizzate possono essere vettori di microrganismi patogenie di tossine preformate. Durante la preparazione, il prodotto può subire ulteriori inquinamenti causati dall’ambiente di trasformazione, dagli operatori e dalle attrezzature adottate. Determinante il periodo stagionale, con prevedibile peggioramento delle risposte favorevoli nel periodo estivo.PROCEDURE ANALITICHEA 25 g di campione si aggiungono in sacchetto sterile 225 ml di acqua peptonata tamponata (pH 7,0). Si tratta per 1’ in Stomacher e si lascia a riposo l’omogenato per circa 10’. La soluzione, diluita 1:10, viene utilizzata per le successive diluizioni di lavoro e per il pre arricchimento nella ricerca di salmonella.Carica batterica mesofila: 37°C per 48 ore seminando in superficie su Agar Gelisato il campione opportunamente diluitoColiformi totali: 37°C per 48 ore col metodo MPN in Brodo lattosato con Bile, Verde Brillante e campanella di DurhamColiformi fecali: come sopra a 44°C per 48 oreEscherichia coli: conferma dai tubi positivi per coliformi fecali con trapianto in provette di Acqua Triptonata ed incubazione a 44°C per 24 ore per accertare la produzione di indolo e calcolo dell’MPN/gStaphylococcus aureus: semina in superficie di 0,1 ml ed 1 ml dell’omogenato su agar di Baird-

Parker; incubazione a 37°C per 48 ore, conteggio delle colonie sospette e loro identificazioneSalmonella spp.: pre-arricchimento a 37°C per 24 ore dell’omogenato in acqua peptonata tamponata, arricchimento di 1 ml in 100 ml di Rapport-Vassiliandis a 43°C per 18 ore, isolamento in XLD e prove di conferma