Metodologie di biochimica clinica in vivo · Caratteristiche distintive •emivita(min) • tempo...

Metodologie di Metodologie di biochimica clinica in biochimica clinica in

vivo vivo

Emiliano [email protected]

Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica Laboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica ––Facoltà di Medicina, Università di PisaFacoltà di Medicina, Università di Pisa

Esplorazione funzionale in vivo del cervelloEsplorazione funzionale in vivo del cervello

Perché studio in vivo?1. Differenze in vitro e in vivo2. Limite anatomico: “santuario anatomico”


Perché studio in vivo?3. Segregazione e integrazione funzionale


Perché studio in vivo?

4. Limite dei modelli animali


La prima esperienza di Angelo Mosso: l’aumento dell’attività cerebrale induce un aumento di flusso ematico

Angelo Mosso (1881):Concerning the Circulation of the Blood in the HumanBrainVerlag von Viet & Company: Leipzig, pages 66-67

Nonostante i numerosi sforzi per risolvere il quesito del “coupling”, il meccanismo fisiologico è ancora sconosciuto: dopo l’ipotesi omeostatica di Roy e Sherrington, sono stati

suggeriti differenti modelli di regolazione dinamica cerebrovascolare e vari agenti mediatori di tipo biometabolico.

Recentemente, è stata proposta un’ipotesi di regolazione multilivello, che interessa anche le cellule neurogliali

Fisiologia della Correlazione Flusso Fisiologia della Correlazione Flusso EmaticoEmatico--MetabolismoMetabolismo CerebraleCerebrale

Il metabolismo cerebrale del glucosioIl metabolismo cerebrale del glucosio• Tessuto nervoso comprende neuroni e cellule gliali

• In condizioni fisiologiche l’ossidazione del glucosio a CO2 ed H2O è pressoché l’unica via metabolica per la produzione di ATP (corpi chetonici nel digiuno prolungato)

• L'apporto di glucosio ed ossigeno dipende strettamente dal flusso ematico cerebrale

cervello: ~2% del peso corporeo ma riceve il 15% della gittata cardiaca basale e consuma il 20% dell'O2 (50% nel bambino)

estrae circa il 10% del glucosio nel sangue

riserve cerebrali di glicogeno molto limitate

il flusso ematico cerebrale aumenta nelle regioni cerebrali dove vi è un’aumentata richiesta metabolica

− i prodotti del metabolismo energetico (CO2, ADP, AMP) contribuiscono a regolare l’aumento di flusso ematico

− l'interruzione completa del flusso ematico cerebrale comporta perdita di coscienza in pochi secondi e danni irreversibili in pochi minuti

• L’ipoglicemia si associa a confusione mentale, obnubilamento del sensorio →coma

• Questi effetti possono essere corretti dalla somministrazione di glucosio o di mannosio

ma non dai substrati intermedi della glicolisi, che non possono passare attraverso la BEE

condizionifisiologiche

ipoglicemia grave ipoglicemiacon coma

Glicemia (mg/dL)

Consumo di Glucosio(mg/100g/min)

Consumo di O2(ml/100g/min)

Flusso Ematico Cerebrale(ml/100g/min)

8

0,8

1,9

63

19

2,3

2,6

60

70-100

5,5

3,5

58

Mannosio Mannosio-6-P Fruttosio-6-PEsochinasi Fosfato

isomerasi

ATP ADP

Il metabolismo energetico cerebrale:Il metabolismo energetico cerebrale:Effetti della deprivazione di glucosioEffetti della deprivazione di glucosio

Glicogeno

Glucosio-1-P

Glucosio Glucosio-6-PGlicolisi

Piruvato

sintesi componenti cellulari (glicoproteine,

glicolipidi, ecc.)

Lattato

10%sintesi e metabolismo di neurotrasmettitori

(ossidasi, ossigenasi ecc.)Acetil-CoA

Ciclo di Krebs

CO2 + H2O36-38 ATP

~ 10-15%

~ 85-90%

condizioni anaerobiche

90%ossidazionedel glucosio

Fosforilazione ossidativa

Ribulosio-5-Pcondizioniaerobiche

shunt5-8%

UDP-glucosio

O2

Fosforilasi a

Glucosio-6-fosfatasi

Esochinasi

2 ATP

La glicolisi libera solo il 5,2% dell’energia totale

disponibile nella molecola di glucosio e che può essere ricavata dall’ossidazione

completa a CO2 e H2O

DESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E ODESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E O22

• 65% processi collegati ai flussi ionici:• pompa Na+/K+: mantenimento del potenziale di membrana

negativo; processi legati al reuptake di neurotrasmettitori• 15% processi biochimici di sintesi:

• sintesi proteica (6%)• sintesi lipidica (2%)• sintesi dei nucleotidi (1%)• glicogenosintesi (2%)• turn-over neurotrasmettitoriale

• 20% altri processi:• trasporto assoplasmatico veloce (6%)• trasporto di calcio• reazioni di fosforilazione• riciclo vescicole sinaptiche

La maggior parte della produzione di ATP nel cervello a riposo èdestinata a mantenere la funzione della pompa Na+/K+

Consumo di ATP nel Cervello in CondizioniConsumo di ATP nel Cervello in Condizionidi Riposo di Riposo SomatosensorialeSomatosensoriale

DESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E ODESTINO METABOLICO DI GLUCOSIO E O22

• Stimolando una cellula nervosa si provoca la sua depolarizzazione e lo sviluppo di un potenziale d’azione, caratterizzato a livello intracellulareda un aumento del sodio e da una diminuzione del potassio

• L’aumento dell’attività di trasmissione sinaptica aumenta l’attività della pompa Na+/K+, necessaria a ripristinare il potenziale negativo della membrana cellulare

• Questo comporta un incremento della richiesta energetica, che per essere soddisfatta attraverso il metabolismo ossidativo del glucosio, produce un aumento della produzione di ATP dal 60% al 80%

Eventi legati all’Attivazione Neuronale CerebraleEventi legati all’Attivazione Neuronale Cerebrale

Esperimento di Mata e coll., 1980J Neurochem, 34: 213-215

preparati in vivo di cellule nervose

del 30%

=consumo di glucosio

stimolazione elettrica a 10 Hz

UABAINAblocco della pompa

Na+/K+

Il maggior quantitativo di ATP prodotto durante Il maggior quantitativo di ATP prodotto durante l'attivazione neuronale è utilizzato esclusivamente per l'attivazione neuronale è utilizzato esclusivamente per

il funzionamento della pompa il funzionamento della pompa NaNa++/K/K++


Il consumo di ATP avviene a livello delle Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellularisinapsi e non dei corpi cellulari


Esperimento di Kadekaro e coll., 1987 Proc Natl Acad Sci USA, 84: 5492-5495

• L’aumento dell’attività neuronale in una regione cerebrale induce un aumento del flusso ematico locale (coupling)

• Il flusso ematico fornisce glucosio e ossigeno ai neuroni

• In condizioni fisiologiche nel neurone l’unica via metabolica è l’ossidazione del glucosio con produzione di ATP

• L’ATP serve a ripristinare il potenziale di membrana

• Il glucosio rappresenta un indice indiretto dell’attività neuronale sinaptica

• Il consumo di ATP avviene a livello delle sinapsi e non dei corpi cellulari


Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell’attività cerebraleneurometabolici dell’attività cerebrale

attività neuronale sinaptica

richiesta di ATP

richiesta di

ossigeno e

glucosio

flusso ematico cerebrale

attività della

pompa Na+/K+

Rip

oso

Att

ivaz

ion

e

= HbO2

= Hb

-70

0

+50

mV

2 msec31

metabolismo ossidativo del

glucosio e produzione di

ATPHH221515OO--PETPETfMRIfMRI

FDGFDG--PETPETsMRIsMRI

EEGEEGMEGMEG

La tomografia ad La tomografia ad emissione di positroniemissione di positroni

Lo Studio in vivo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio mediante Tomografia ad Emissione di Positroni

• Presupposti fisici:• Radionuclidi a breve emivita (es. 18Fluoro, 15Ossigeno) che

decadono ed emettono positroni

• Positroni ed elettroni (stessa massa, carica opposta) annichilano e danno origine a due raggi γ in direzione diametralmente opposta, rilevabili da appositi detettori (Tomografo PET)


• 18FDG per misurare il metabolismo glucidico

• H215O per misurare il

flusso ematico

misurano l'attività sinaptica neuronale di un determinato

distretto cerebrale

Caratteristiche distintive

• emivita (min)• tempo di osservazione (min)• durata singolo studio (min)• numero di studi possibili

nella stessa sessione PET

18FDG H215O

11045 651-2

21 - 41 - 4> 10

• Sostanze di interesse biologico, quali substrati metabolici, possono essere marcati usando questi radionuclidi positrone-emittenti

• Per lo studio in vivo del metabolismo cerebrale possiamo utilizzare:

HO

HO-CH2

OH

H

H

OH

HO

H

OH

H

( 18F )

[18F]deossi-glicogeno

[18F]glicolipidi[18F]glico-proteine

[18F]UDPDG

[18F]deossiglucosio-1-P

[18F]deossiglucosio-6-P

glucosio-6-P

fruttosio-6-P

CO2 + H2O

Tessuto cerebralePlasma

[18F]deossiglucosio

Bar

riera

em

ato-

ence

falic

a[18F]deossi-

glucosio

glucosio glucosio

Il modello del Il modello del 1818FluoroFluoro--22--deossideossi--DD--glucosio nello glucosio nello Studio in vivo del Metabolismo Glucidico Cerebrale Studio in vivo del Metabolismo Glucidico Cerebrale

precursori prodotti metabolici

K*2

K*1

K1

K2

K*3

K3esochinasi fosfoglucosio

isomerasi

esochinasi

glucosio 2-deossi-D-glucosio

HO

HO-CH2

OH

H

H

H

HO

H

OH

H

G-6-Pasi

Studio del Metabolismo Cerebrale del Glucosio in vivo Studio del Metabolismo Cerebrale del Glucosio in vivo nell’Uomo in Condizioni Fisiologiche nell’Uomo in Condizioni Fisiologiche

• Condizione di riposo

• Effetti della stimolazione sensoriale visiva

occhi chiusi 1 occhio 2 occhi scenacomplessa

0

10

20

30

40

50

60Corteccia Visiva

aum

ento

% d

el m

etab

olis

mo

del g

luco

sio

Studio del Metabolismo Cerebrale in vivo nell’Uomo in Studio del Metabolismo Cerebrale in vivo nell’Uomo in Condizioni FisiologicheCondizioni Fisiologiche

18FDG -glucosio

18F-fluorodopa

18F-fluoroetilspiperone

Anziano

Sano

Malato

AD

Studio in vivo delle funzioni cerebrali: elaborazione Studio in vivo delle funzioni cerebrali: elaborazione dei dati acquisiti con metodologia PETdei dati acquisiti con metodologia PET

ATTIVAZIONE RIPOSO CONTROLLO

IMMAGINE MEDIADELLE DIFFERENZE

NORMALIZZAZIONE ANATOMICA (Talairach e Tournoux Atlas)IMMAGINI INDIVIDUALI DI DIFFERENZA

PET - applicazioni cliniche

Oncologiche

Cardiache

Cerebrali

Malattie Infettive

Farmacologiche

Metaboliche

PET-FDG: verifica della terapia antitumorale

Esame PETLinfoma di Hodgkin

Esame PETPost-trattamento

Studio in vivo nell’Uomo del Metabolismo Cerebrale del Glucosio nelle Formazioni Neoplastiche Cerebrali → Diagnostica Molecolare in Vivo

• La misurazione del metabolismo cerebrale del glucosio consente di:• determinare la natura (benigna/maligna) della neoformazione• determinarne il grado di anaplasia (↑ anaplasia → ↑ consumo glucosio)• valutare nel tempo gli effetti della terapia e la presenza di eventuali

recidive

• Cellule neoplastiche:↑ replicazione cellulare → ↑ attività metabolica di sintesi

↑ attività glicolitica

Il ruolo della PETnelle patologie neurologiche

Epilessia Alzheimer

Parkinson

Traumi Cranici

Corea di Hungtinton

Il ruolo della PETnelle patologie neurologiche

Alzheimer’s Disease: Diagnosis

M 77 yrs

Alzheimer’s Disease: Diagnosis

M 65 yrs

La risonanza magnetica La risonanza magnetica funzionalefunzionale

Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici dell’attività cerebraleneurometabolici dell’attività cerebrale

attività neuronale sinaptica

richiesta di ATP

richiesta di

ossigeno e

glucosio

flusso ematico cerebrale

attività della

pompa Na+/K+

Rip

oso

Att

ivaz

ion

e

= HbO2

= Hb

-70

0

+50

mV

2 msec31

metabolismo ossidativo del

glucosio e produzione di

ATPHH221515OO--PETPETfMRIfMRI

FDGFDG--PETPETsMRIsMRI

EEGEEGMEGMEG

Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici neurometabolici –– risonanza magnetica funzionalerisonanza magnetica funzionale

Cosa accade al consumo di ossigeno?

• Il segnale BOLD permette l’individuazione dei cambiamenti locali cerebrali di ossigenazione ematica durante una stimolazione fisiologica

• Il segnale BOLD si basa sui cambiamenti fisiologici delle proprietà magnetiche del sangue:

fMRI

fMRI: functional Magnetic Resonance Imaging: Tecnica che utilizza il segnale BOLD per visualizzare il metabolismo cerebrale mediante MRI .

OSSIEMOGLOBINA DIAMAGNETICA

DEOSSIEMOGLOBINA PARAMAGNETICA

Deoxygenated blood attenuates T2*-weighted

MR images

MRI volume element

O2

decrease of venous dHb during increased perfusion:

O2

The influence of arterial blood on the BOLD signal is probably insignificant (it contains low dHb and represent

less than 25% of CBV)

Esplorazione funzionale in vivo dei correlati Esplorazione funzionale in vivo dei correlati neurometabolici neurometabolici –– lo scannerlo scanner

Analisi Analisi deidei datidati: postprocessing: postprocessing

reconstructionreconstruction registrationregistration smoothingsmoothing

RationaleRationale: : ipotesiipotesisperimentalesperimentale

Preprocessing e Preprocessing e sessionesessionesperimentalesperimentale

InterpretazioneInterpretazione deidei risultatirisultati, , correlazionecorrelazione con con datidaticomportamentalicomportamentali e e verificaverificadell’ipotesidell’ipotesi

ParadigmaParadigma sperimentalesperimentale

SelezioneSelezione, screening, , screening, test test psicologicipsicologici e e comportamentalicomportamentali

EsperimentiEsperimenti fMRI: fMRI: ingegneriaingegneriabiomedicabiomedica

Beyond (and behind) the project…Behavior (forgiveness, emotional hyperresponsiveness, reward, etc.)

Tactile perception: sopra- and

crossmodality

Language

EEG and fMRI

Speed and brain (Formula 1 racers)

Pharmacological Modulation

Presurgicalevaluation

Neurodegenerative diseases

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